专利名称：重金属汞多克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附测定方法
技术领域：
本发明涉及的是一种重金属检测技术领域的方法，具体是一种重金属汞多克隆抗 体的制备及其酶联免疫吸附测定方法。
背景技术：
近年来，随着工农业迅速发展，重金属污染日益加剧，造成的环境及食品安全问题 也日益突出。重金属主要通过水循环，经由饮用水及农产品等途径，进入人体，威胁人们健 康。污染水体的重金属主要包括Hg、Cd、Cr、Cu、Co、Ni等，其中Hg的毒性最大，因此快速检 测重金属汞污染现状，显得尤为重要。目前，重金属的检测分析方法主要有原子吸收光谱 分析(AAS)、电感耦合等离子发射光谱(ICP-AES)、电感耦合等离子质谱分析(ICP-MS)、原 子荧光光谱分析(AFS)等。这些检测方法虽然可以精确地测定重金属的含量，但需要对样 品做繁琐的预处理步骤，检测过程需在配备大型分析仪器的室内进行，且需要专业的仪器 操作员，检测费用也代价高昂，难以快速、简便、费用低廉地检测环境中的重金属汞。经过对现有技术的检索发现，Reardan等人于1985年首次利用螯合剂螯合金属制 备单克隆抗体以来，重金属免疫学检测方法受到了国内外的广泛关注，尤其是近些年相关 研究越来越多，多种重金属包括Cd2+、Hg2+、Pb2+、U6+、Cu2+、Zn2+等螯合剂复合物的抗体均有研 究报道，其主要集中于单克隆抗体。进一步检索发现，HuanHe 等在 Analytical Letters (42 409-424, 2009)上公开 了用EDTA衍生物螯合镉制备多克隆抗体进行间接酶联免疫吸附的研究。多克隆抗体就特 异性而言不如单克隆抗体，但其检测方法也可以达到一定的检测要求。青霉素G盐作为双 功能螯合剂连接重金属汞及大分子蛋白，藉此作为免疫原制备多克隆抗体，建立IC-ELISA， 未见报道先例。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种重金属汞多克隆抗体的制备及其 酶联免疫吸附测定方法，针对水样中汞离子的检测限为14. 5 μ g/L，对汞离子具有很高的特 异性，可以运用于重金属污染地区及污染样本的快速检测。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及一种重金属汞多克隆抗体的制备方法，通过将双工能螯合剂青霉 素G钠盐的一端结合重金属汞，另一端与大分子载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白 (OVA)偶联形成汞-螯合剂-蛋白的免疫原MMPA-BSA和包被原MMPA-0VA，最后经对免疫原 MMPA-BSA进行乳化、免疫后制备多克隆抗体，其反应式如下 所述的将双工能螯合剂青霉素G钠盐的一端结合重金属汞是指取青霉素G钠盐 或钾盐的水溶液中加入咪唑，搅拌溶解后逐滴加入HCl并调节pH到6. 8，然后加入HgCl2经 水浴反应并冷却后产生黄色粉末状沉淀，最后再加入HCl并震荡离心处理后弃去上清，得 到青霉烯酸硫醇汞盐。所述的与大分子载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联是指采用碳 二亚胺法和载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)加入青霉烯酸硫醇汞盐，经室温反应并透析后得 到免疫原Hg-青霉素-BSA和包被原Hg-青霉素-OVA。所述的偶联中采用紫外吸收法对完全抗原进行扫描，并且对完全抗原中的蛋白含 量和重金属汞的含量进行测定，分别采用考马斯亮蓝法和电感耦合等离子发射光谱法，确 定抗原是否合成成功本发明涉及上述重金属汞多克隆抗体的酶联免疫吸附测定方法，包括以下步骤第一步、酶联免疫吸附测定方法，包括用棋盘法优化多克隆抗体及包被抗原工作 浓度，建立IC-ELISA，绘制出标准曲线，具体为将重金属汞多克隆抗体加入到孔底固定有 表面半抗原的酶标板孔中，使待测抗原与固相载体表面半抗原竞争抗体表面的结合位点。第二步、优化二抗、包被缓冲液、包被介质工作浓度，具体为加入酶标记的二抗， 二抗与结合在固相载体表面抗原上的抗体反应，也固定在固相载体上，使得底物被酶催化 成为有色产物，而产物的量与待测重金属标准溶液的量相关，呈现的颜色通过紫外光一定 波长下测定吸光度值，以进行定性或定量分析。第三步、检验该IC-ELISA 方法中其他金属 Cu2+、Cd2+、Pb2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ni2+ 的干扰，建立对水样的添加回收实验，实现对酶联免疫吸附的测定。本发明在制备重金属汞多克隆抗体的基础上，建立了测定水样中汞离子含量的 间接竞争酶联免疫吸附测定方法。本发明的检测限为14. 5 μ g/L，对汞离子具有很高的 特异性，除了与镉的交叉反应率为7. 9%之外，其他金属的均小于0. 001%，添加回收率在 91.4% -120%之间。本方法可用于水样中的重金属汞的测定，也可以通过结合一定的前处 理技术发展为快速检测农产品等其他样品中重金属汞的快速免疫检测技术。
图1为本发明测定方法示意图。图2为实施例重金属抑制率示意图。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。实施例1多克隆抗体的制备步骤1 完全抗原的合成取青霉素G钠盐或钾盐50mg溶解在IOml超纯水中，加入Ig咪唑，搅拌使其完全 溶解，逐滴加入IM HCl调pH到6. 8 ；加入与青霉素G钠盐或钾盐等物质量的HgCl2,60°C水 浴2小时，取出室温中冷却，反应产生黄色粉末状沉淀。在所得溶液中加入过量的IM HC1，边滴边轻轻震荡，溶液中产生大量黄色絮状沉 淀，将溶液分装在4mlEP管中，10000r/m离心5分钟，弃去上清；在EP管中加入超纯水洗涤 沉淀，振荡2min，然后10000r/m离心5分钟，重复洗涤2次，得到青霉烯酸硫醇汞盐。采用碳二亚胺法(Harlow and Lane, 1988)与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)，反应 液在缓慢搅拌下室温反应24小时后装入预处理过的透析袋中，PBS缓冲液透析三次，纯水 透析二次，4°C透析3天。然后取透析液，即为免疫原Hg-青霉素-BSA，低温保存。相同方法 制备包被原Hg-青霉素-OVA。用电感耦合等离子发射光谱测定汞的含量，考马斯亮蓝染色法测定蛋白含量。根 据重金属汞与蛋白的摩尔比得出偶联比，MMPA-BSA与MMPA-OVA偶联比分别为25/1与9/1。步骤2 抗体的制备与鉴定MMPA-BSA作为免疫原，共分5次免疫，初免采用弗氏完全佐剂与免疫原等体积乳 化，28天后的二免及以后的免疫均用弗氏不完全佐剂作为乳化剂且间隔为2周，最后一次 免疫之后8 10天，获得多克隆抗体，分装后于-20°C冻存。通过间接非竞争ELISA法测定抗体效价，以效价高用作后续间接竞争ELISA的建立。效价检测步骤包括(1)以MMPA-OVA及青霉素-OVA作为包被原包被，100 μ L/孔，4°C过夜，洗涤3次， 拍干；(2)封闭，200 μ L/孔，37°C2h，洗涤3次，拍干；(3)加抗体(稀释成2000、4000、8000、 16000,32000,64000,128000 倍)100 μ L/ 孔，37°C Ih,洗涤 3 次，拍干；(4)加酶标二抗(2000 倍稀释)，37°C lh，洗涤3次，拍干；(5)加TMB反应液显色，100 μ L/孔，37°C IOmin ； (6)加 50 μ L/孔2M硫酸终止反应；(7)酶标仪测0D450值，值若等于或大于阴性的2. 1倍即为阳 性。测试结果显示以青霉素-OVA作为包被原的没有阳性反应，可见抗体并非是针对 青霉素的；经测定效价超过1 128000，可以进行酶联免疫吸附试验。实施例2酶联免疫吸附测定方法
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步骤一效价测定采用棋盘法优化抗原抗体最佳工作浓度把包被抗原MMPA-OVA用碳酸盐缓冲液 (ρΗ9· 6)稀释到一定浓度(1，1. 3，2，2. 5，3，4，5，10 μ g/mL)，分别包被在96孔酶标板A H 排，抗体也稀释一定倍数(4000，8000，10000，12000，16000，32000)加入1 6列，其余列 作为对照；用间接非竞争ELISA的方法测定出OD450值，以0. 8 1. 2的值为最优值，即该值 对应的为最佳工作浓度。确定最佳包被原浓度为MMPA-OVA 2. 5μ g/mL，最佳抗体稀释度为 1 8000。步骤二 =IC-ELISA法测定重金属汞方法建立用间接竞争ELISA法建立抗体对重金属汞的检测方法。0. 5mM EDTA 与汞标准溶液混合，形成浓度为 0. 01，0. 05，0. 1,0. 5,1,5,10mg/mL 的 反应液，与等体积抗体溶液先混合过夜为样品进行前抑制。间接竞争ELISA法的步骤如下(1)前处理0· 5mM EDTA与标准溶液(待测样)预混，37°C温浴lh。(2)包被包被原用CB缓冲液100 μ L/孔包被4°C过夜，洗板3次。(3)封闭200 μ L/孔5%甘氨酸37°C封闭lh，洗板3次。(4)加样将预混好的样品50 μ L/孔加入，用PBS稀释抗体到两倍工作浓度， 50 μ L/孔加入，振荡10min，37°C温浴2h，洗板3次。(5)加酶标二抗；1 2000倍稀释的酶标二抗100 μ L/孔，37°C温浴lh，洗板3次。(6)显色加TMB底物液显色lOmin。(7)终止反应50 μ L/孔2Μ硫酸终止反应，450nm下读取OD值。步骤三优化条件在ELISA试验中，封闭介质的作用是消除非特异性吸附，本方法中比较了各种不 同的封闭剂包括1 %明胶，8 %脱脂奶粉，5 %甘氨酸，2 % BSA，2 % OVA对ELISA的影响，确定 了 5%甘氨酸为封闭介质。本方法还比较了不同的二抗稀释度及不同的包被缓冲液对ELISA的影响，确定了 最佳稀释比例为1 2000 8000，碳酸盐缓冲液(CB，pH9.6)为最佳包被缓冲液。步骤四方法评价与应用根据IC-ELISA测定的OD45tl值，以未添加汞标准溶液的OD值为Btl，添加了标准 溶液的OD值为B1,按公式(Bci-B1VBciXlOO^计算抑制率；以抑制物(汞标准溶液)对 数值为横坐标，抑制率为纵坐标绘制得标准曲线，见图1，用直线拟合后得回归方程Y = 0. 17886X-0. 10732，相关系数为0. 988，以抑制率为10%的待测样品汞含量(ICltl)作为检测 限，为 0. 0145 μ g/mL。按本例步骤二，用其他金属Cu2+、Cd2+、Pb2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ni2+ 的标准溶液 代替汞的标准溶液检验交叉反应率，交叉反应率公式如下CR = IC5tl(汞)/IC5tl (其他金 属)X100%。结果验证抗体对于汞具有很高的特异性，除了重金属镉有7. 9%的交叉反应 率外，其他的供试金属交叉反应率都小于0. 001%。通过对纯水中按5，0. 5,0. 05 μ g/mL三种不同浓度添加汞离子，按步骤二进行试 验，检验添加回收率，得添加回收率在91. 40% 120%之间。
权利要求
一种重金属汞多克隆抗体的制备方法，其特征在于，通过将双工能螯合剂青霉素G钠盐的一端结合重金属汞，另一端与大分子载体蛋白牛血清白蛋白、卵清蛋白偶联形成汞-螯合剂-蛋白的免疫原MMPA-BSA和包被原MMPA-OVA，最后经对免疫原MMPA-BSA进行乳化、免疫后制备多克隆抗体，其反应式如下FDA0000023387990000011.tif
2.根据权利要求1所述的重金属汞多克隆抗体的制备方法，其特征是，所述的将双工 能螯合剂青霉素G钠盐的一端结合重金属汞是指取青霉素G钠盐或钾盐的水溶液中加入 咪唑，搅拌溶解后逐滴加入HCl并调节pH到6. 8，然后加入HgCl2经水浴反应并冷却后产生 黄色粉末状沉淀，最后再加入HCl并震荡离心处理后弃去上清，得到青霉烯酸硫醇汞盐。
3.根据权利要求1所述的重金属汞多克隆抗体的制备方法，其特征是，所述的与大分 子载体蛋白牛血清白蛋白、卵清蛋白偶联是指采用碳二亚胺法和载体蛋白牛血清白蛋白 加入青霉烯酸硫醇汞盐，经室温反应并透析后得到免疫原Hg-青霉素-BSA和包被原Hg-青 霉素-OVA。
4.根据权利要求1所述的重金属汞多克隆抗体的制备方法，其特征是，所述的偶联中 采用紫外吸收法对完全抗原进行扫描，并且对完全抗原中的蛋白含量和重金属汞的含量进 行测定，分别采用考马斯亮蓝法和电感耦合等离子发射光谱法，确定抗原是否合成成功。
5.一种根据权利要求1所述方法制备得到的重金属汞多克隆抗体的酶联免疫吸附测 定方法，其特征在于，包括以下步骤第一步、酶联免疫吸附测定方法，包括用棋盘法优化多克隆抗体及包被抗原工作浓度， 建立IC-ELISA，绘制出标准曲线；第二步、优化二抗、包被缓冲液、包被介质工作浓度；第三步、检验该 IC-ELISA 方法中其他金属 Cu2+、Cd2+、Pb2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ni2+ 的 干扰，建立对水样的添加回收实验，实现对酶联免疫吸附的测定。
6.根据权利要求5所述的重金属汞多克隆抗体的酶联免疫吸附测定方法，其特征是， 所述的第一步具体为将重金属汞多克隆抗体加入到孔底固定有表面半抗原的酶标板孔中，使待测抗原与固相载体表面半抗原竞争抗体表面的结合位点。
7.根据权利要求5所述的重金属汞多克隆抗体的酶联免疫吸附测定方法，其特征是， 所述的第二步具体为加入酶标记的二抗，二抗与结合在固相载体表面抗原上的抗体反应， 也固定在固相载体上，使得底物被酶催化成为有色产物，而产物的量与待测重金属标准溶 液的量相关，呈现的颜色通过紫外光一定波长下测定吸光度值，以进行定性或定量分析。
全文摘要
一种重金属检测技术领域的重金属汞多克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附测定方法。通过将双工能螯合剂青霉素G钠盐的一端结合重金属汞，另一端与大分子载体蛋白牛血清白蛋白、卵清蛋白偶联形成汞-螯合剂-蛋白的免疫原MMPA-BSA和包被原MMPA-OVA，最后经对免疫原MMPA-BSA进行乳化、免疫后制备多克隆抗体用于酶联免疫吸附测定，本发明制备得到的抗体对汞离子具有很高的特异性，除了与镉的交叉反应率为7.9％之外，其他金属的均小于0.001％，添加回收率在91.4％-120％之间，可用于水样中的重金属汞的测定，也可以通过结合一定的前处理技术发展为快速检测农产品等其他样品中重金属汞的快速免疫检测技术。
文档编号C07K16/44GK101885775SQ201010229009
公开日2010年11月17日 申请日期2010年7月16日 优先权日2010年7月16日
发明者周培, 奚涛, 曹成喜, 邢海波 申请人:上海交通大学