专利名称：一种链酶亲和素结合功能荧光磁性纳米颗粒的制备方法
技术领域：
本发明属于纳米材料技术领域，具体的说是涉及一种链酶亲和素结合功能荧光 磁性纳米颗粒的制备方法。
背景技术：
20世纪80年代，随着扫描隧道显微镜(STM)、原子力显微镜(AFM)等微观表 征和操纵技术的诞生与发展，纳米技术应运而生。其中，磁性纳米粒子具有良好的超顺 磁性以及表面易功能化，引起了越来越多的关注。经过表面修饰的超顺磁性纳米粒子， 可以应用于生物固定化、分离、修饰和检测，从而起到提取或者测定一系列生物活性化 合物、异生化合物、胞内组分或者细胞本身的作用。除此之外，荧光标记探针技术，作为一种常用的生物分析技术，具有灵敏度 高、选择性好、特异性高、精确性好、直观可视化等特点，被广泛用于流式细胞技术、 免疫分析、分子生物学、细胞分析及细胞凋亡、对肿瘤细胞的识别等多个领域的研究。 目前常用的荧光标记物包括有机荧光染料、荧光半导体量子点材料、普通稀土荧光材料 和上转换稀土材料等。小分子有机染料作为生物荧光探针已被广泛应用于诊断学和分子 成像等生命科学中。然而大多数有机荧光探针对光不稳定，且荧光光谱较宽，易受样品 本身荧光信号背景的干扰。纳米探针技术如无机发光量子点和荧光纳米乳液微球，克服 了有机染料的一些缺点。但是无机发光量子点由于其水溶性较差、黏度大、量子产率较 低、且含有毒的金属镉化合物，因而在生物医学等领域受到一定的限制。因此，有机高 分子纳米颗粒及以氧化硅为代表的无机纳米颗粒等作为负载荧光分子的基质已成为纳米 荧光探针的研究热点之一。超顺磁性纳米荧光颗粒是同时具有磁性操纵分离功能和荧光标记功能的多功能 纳米材料，纳米级的粒径使其能作为标记物和蛋白、核酸等生物分子联接，并具有磁性 分离和载送等特性，同时它本身带有的荧光物质能起到示踪和检测的作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种链酶亲和素结合功能荧光磁性纳米颗粒的制备方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为—种链酶亲和素结合功能荧光磁性纳米颗粒的制备方法1)通过PCR反应将Strep II标签基因分别连在别藻蓝蛋白APC的α和β亚基 脱辅基蛋白基因的N末端，分别得到Strep II-apcA和Strep IIapcB基因片段，待用；2)将StrepII-apcA基因片段插入到带有6XHis基因的载体A中6XHis基因 的下游，同时将藻胆素生物合成酶基因hoi和pcyA插入到载体上，得到pCDF-Strep II-apcA-hol-pcyA,待用；将Strep II-apcB基因片段插入到带有6XHis基因的载体B中6XHis基
因的下游，同时将色基裂合酶基因cpcS和cpcU插入到载体上，得到pRSF-Strep
4II-apcB-cpcS-cpcU,待用；3)将步骤2)所得两个表达载体同时转化大肠杆菌，筛选获得同时表达上述基因 的工程菌；4)将上述工程菌诱导培养后分离纯化，得到双标签重组APC荧光蛋白质；5)将所得双标签重组APC荧光蛋白质与锌离子修饰的超顺磁性硅壳纳米颗粒振 荡混合，即得到链酶亲和素结合功能荧光磁性纳米颗粒。所述步骤1)构建 Strep II-apcA 基因片段时，采用 Synechocystis sp.PCC6803 基因组DNA为模板，以Al和A2为引物，进行PCR扩增；Al 5，AAGGATCCG AGTAACTGGTCACACCCACAATTCGAGAAAATGAGTATCGTCACGAA3' ； A2 5' GCGAGCTCCTAGCTCATTTTTCCGAT3 ‘；所述步骤1)构建 Strep II-apcB 基因片段时，采用 Synechocystis sp.PCC6803 基因组DNA为模板，以Bl和B2为引物，进行PCR扩增；Bl 5’ AAGGATCCG AGTAACTGGTCACACCCACAATTCGAGAAAATGCAAGACGCAATTAC3' ； B2 5' CCGAGCTCCTAGCTCAAGCCAGAGC3‘。所述步骤2)带有6\扭3基因的载体人为？€0 0朋1载体；带有6XHis基因的 载体B为pRSFDuet载体。所述步骤2)中Strep II-apcA基因片段、Strep II-apcB基因片段、pCDFDuet载 体和pRSFDuet载体均用限制性内切酶BamH I和Sac I进行双酶切，而后Strep II-apcA
基因酶切片段通过T4连接酶连接到酶切后的pCDFDuet载体上得到pCDFDuet_Strep II-apcA, Strep II-apcB基因酶切段片通过T4连接酶连接到酶切后的pRSFDuet载体上 得到pRSFDuet-StrepII-apcB ；上述酶切片段与载体按照体积份数比为3-7 1的比例连 接；藻胆素生物合成酶基因hoi和pcyA经过相应酶切后，依次与载体 pCDFDuet-Strep II-apcA 连接，得到表达载体 pCDF-Strep II-apcA-hol-pcyA ；色基裂合 酶基因cpcS和cpcU经过相应酶切后，依次连接到pRSFDuet-StrepII-apcB，得到表达载 体pRSF-Strep II-apcB-cpcS-cpcU ；上述酶切片段与载体按照体积份数比为3-7 1的比
例连接。所述步骤5)中所述的锌离子修饰的超顺磁性硅壳纳米颗粒为经锌离子修饰的以 二氧化硅为壳以四氧化三铁为核的超顺磁性硅壳纳米颗粒。本发明所具有的优点1.本发明中采用的荧光染料为别藻蓝蛋白，该荧光蛋白水溶性好、毒副作用
小、荧光量子产率高。2.本发明中采用的荧光染料为重组的别藻蓝蛋白具有与天然别藻蓝蛋白相似的 光谱特征，同时避免了天然别藻蓝蛋白含量有限，提取困难的缺点。3.本发明中采用的荧光染料为重组的别藻蓝蛋白，首先，含有His-tag标签又含 有，便于选择性分离纯化；其次，含有Strep II标签，无需化学修饰即可生物结合链酶亲 和素。4.本发明中采用的超顺磁性硅壳纳米颗粒是以二氧化硅为壳的纳米颗粒，该壳 材料本身对锌离子具有吸附能力，无需化学反应就可以结合锌离子。
5.本发明中采用的锌离子作为颗粒与蛋白的连接桥梁，避免了传统镍离子、铜 离子、钴离子等重金属离子可能带来的危害。6.利用锌离子与组氨酸之间的螯合作用，实现了对组氨酸标签蛋白的选择性结 合，这种结合可以用咪唑竞争洗脱，即该荧光蛋白为可逆性结合。
图1为本发明实施例重组质粒的构建示意图；图2为本发明实施例双标签重组别藻蓝蛋白表达的电泳表征和生物亲和能力检 测图(其中，泳道从左到右1，预染Marker; 2，转化菌株诱导前；3，转化菌株诱导 后；4，凝胶层析纯化后样品。考马斯里亮蓝染色(上)，ZnSO4染色(中)，Western染 色(下)成像。预染蛋白Maker，分子量由上至下为95，72，55，43，26，17kDa)；图3为本发明实施例双标签重组别藻蓝蛋白的吸收光谱和荧光发射光谱图(其 中，a，吸光光谱；b，荧光光谱Uex = 600nm))；图4为本发明实施例纳米颗粒的透射电镜照片；图5为本发明实施例多功能纳米颗粒的荧光成像图；图6为本发明实施例多功能纳米颗粒结合链酶亲和素(FITC-Streptavdin)的荧光 成像图。
具体实施例方式实施例a.基因的克隆从美国国立生物信息中心(NationalCenter for BiotechnologyInformation，NCBI) 数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取 Synechocystissp.PCC6803 的 apcA、apcB、 cpcS、cpcU、hoi、pcyA基因的序列，并参考文献中Strep II标签基因序列，由此设计引
物。所用的引物和反应条件如表1。以Synechocystis sp.PCC6803基因组DNA为模板，分别以下述表1中各引物进 行PCR克隆分别得到Strep II-apcA基因片段、藻胆素生物合成酶hoi和pcyA基因片段、 StrepII-apcB基因片段、色基裂合酶cpcS和cpcU基因片段。PCR反应体系双蒸水18.7 μ 1，含Mg2+的缓冲液2.5 μ 1，dNTP0.5yl,上游引 物 Ιμ ，下游引物 Ιμ ，Taq 酶 0.3 μ 1，Synechocystis sp.PCC 6803 基因组 1 μ 1。由于在引物设计中，已经将Strep II标签基因分别连接在apcA和apcB基因的上 游引物的5’端，所以PCR扩增得到的就是N端连接StrepII基因的apcA和apcB基因 片段(简称 Strep II-apcA 和 Strep II-apcB)。表 1
权利要求
1.一种链酶亲和素结合功能荧光磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于1)通过PCR反应将StrepII标签基因分别连在别藻蓝蛋白APC的α和β亚基脱辅 基蛋白基因的N末端，分别得到Strep II-apcA和Strep II-apcB基因片段，待用；2)将StrepII-apcA基因片段插入到带有6 X His基因的载体A中6 X His基因的 下游，同时将藻胆素生物合成酶基因hoi和pcyA插入到载体上，得到pCDF-Strep II-apcA-hol-pcyA,待用；将Strep II-apcB基因片段插入到带有6 XHis基因的载体B中6 XHis基因的下游，同 时将色基裂合酶基因cpcS和cpcU插入到载体上，得到pRSF-Strep II-apcB-cpcS-cpcU， 待用；3)将步骤2)所得两个表达载体同时转化大肠杆菌，筛选获得同时表达上述基因的工 程菌；4)将上述工程菌诱导培养后分离纯化，得到双标签重组APC荧光蛋白质；5)将所得双标签重组APC荧光蛋白质与锌离子修饰的超顺磁性硅壳纳米颗粒振荡混 合，即得到链酶亲和素结合功能荧光磁性纳米颗粒。
2.按权利要求1所述的链酶亲和素结合功能荧光磁性纳米颗粒的制备方法，其特 征在于所述步骤1)构建Strep II-apcA基因片段时，采用Synechocystis sp.PCC6803 基因组DNA为模板，以Al和A2为引物，进行PCR扩增；Al 5，AAGGATCCG AGTAACTGGTCACACCCACAATTCGAGAAAATGAGTATCGTCACGAA3' ； A2 5' GCGAGCTCCTAGCTCATTTTTCCGAT3 ‘；所述步骤1)构建Strep II-apcB基因片段时，采用Synechocystis sp.PCC6803基 因组DNA为模板，以Bl禾Π B2为弓丨物，进行PCR扩±曾；Bl 5，AAGGATCCGA GTAACTGGTCACACCCACAATTCGAGAAAATGCAAGACGCAATTAC3' ； Β2 5' CCGAGCTCCTAGCTCAAGCCAGAGC3‘。
3.按权利要求1所述的链酶亲和素结合功能荧光磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在 于所述步骤2)带有6\扭8基因的载体八为？€0 0诚载体；带有6XHis基因的载体 B 为 pRSFDuet 载体。
4.按权利要求1或2所述的链酶亲和素结合功能荧光磁性纳米颗粒的制备方法，其 特征在于所述步骤2)中Strep II-apcA基因片段、Strep II-apcB基因片段、pCDFDuet 载体和pRSFDuet载体均用限制性内切酶BamH I和Sac I进行双酶切，而后Strep II-apcA 基因酶切片段通过T4连接酶连接到酶切后的pCDFDuet载体上得到pCDFDuet_Strep II-apcA, Strep II-apcB基因酶切段片通过T4连接酶连接到酶切后的pRSFDuet载体上得 至IJ pRSFDuet-Strep II-apcB ；上述酶切片段与载体按照体积份数比为3-7 1的比例连 接；藻胆素生物合成酶基因hoi和pcyA经过相应酶切后，依次与载体pCDFDuet-Strep II-apcA连接，得到表达载体pCDF-Strep II-apcA-hol-pcyA ；色基裂合酶基因cpcS禾口 cpcU经过相应酶切后，依次连接到pRSFDuet-StrepII-apcB，得到表达载体pRSF_Strep II-apcB-cpcS-cpcU ；上述酶切片段与载体按照体积份数比为3-7 1的比例连接。
5.按照权利要求1中所述的链酶亲和素结合功能荧光磁性纳米颗粒的制备方法，其特 征在于所述步骤5)中所述的锌离子修饰的超顺磁性硅壳纳米颗粒为经锌离子修饰的以二氧化硅 为壳以四氧化三铁为核的超顺磁性硅壳纳米颗粒。
全文摘要
本发明属于纳米材料技术领域，具体的说是涉及一种链酶亲和素结合功能荧光磁性纳米颗粒的制备方法。具体为通过PCR技术将Strep II标签基因分别连在APC的α和β亚基脱辅基蛋白基因的N末端，得到Strep II-apcA和Strep II-apcB基因片段；将Strep II-apcA基因片段插入到6×His基因的下游，与藻胆素生物合成酶基因共同克隆到一个表达载体中；将Strep II-apcB基因片段插入到6×His基因的下游，与色基裂合酶基因克隆到另一个载体上，将两个表达载体同时转化大肠杆菌，筛选工程菌，经蛋白分离纯化，将纯化后双标签重组APC荧光蛋白质与锌离子修饰的超顺磁性硅壳纳米颗粒振荡混合，即得到链酶亲和素结合功能荧光磁性纳米颗粒。本发明所得双标签重组蛋白无需化学修饰，即可生物结合链酶亲和素。
文档编号C07K14/405GK102010872SQ20101026176
公开日2011年4月13日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者刘少芳, 姜鹏, 崔玉琳, 李富超, 秦松, 陈华新, 陈英杰 申请人:中国科学院海洋研究所