专利名称：一种从核桃粕中高效提取蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及核桃蛋白萃取技术领域，特别涉及一种反胶束结合微波与酶法高效萃取核桃蛋白的方法。
背景技术：
核桃含有丰富的优质蛋白质，其含量在15%左右，生产核桃油后的核桃柏中的蛋白质含量达到40%以上，且必需的氨基酸含量高，与肉类蛋白可以相比，而且还含有人体必需的多种维生素和矿物质，不含胆固醇，是一种优良的食品原料。目前，国内外对核桃偏重于其油脂方面的研究，对于核桃蛋白质的开发利用研究很少。由于核桃的加工特性，特别是核桃蛋白相对于其他植物蛋白，对热比较敏感，变性温度比较低，为67°C。蛋白变性后其亲水性、乳化性等物化特性降低。生产工艺技术上还存在一些难点，如脂肪上浮、蛋白质沉淀、蛋白质的得率低、降低物料利用率等。因而压榨后核桃柏一般作为饲料，从而造成了资 源的极大浪费，限制了蛋白质的深加工和再利用。目前以冷压榨后的核桃柏为原料，提取核桃蛋白的方法主要有水相法、水相酶法、有机溶剂法、超滤法等。水相法能耗大，生产成本高，排出的废液会严重污染环境。超滤膜法因超滤膜的污染及适宜的清洗方法问题制约着工业化生产的进程。水酶法制油能有效提高油脂及蛋白质的得率与质量，且存在破乳困难等问题，降低蛋白功能性质和营养价值。在提高核桃蛋白产品质量方面最具潜力的，当属于反胶束生物分离技术。研究已经证实反胶束法制备植物蛋白可以同时分离蛋白与油脂，且蛋白的风味较清淡，不含油脂，生产过程中不会产生大量废水，高活性蛋白质得率较高。反胶束技术是一种新的生物分离技术，将表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中，碳氢链向外，亲水基向内组成，形成纳米级分子聚集体，是典型的微乳相体系之一，形成的球状极性核内具有一定数量的水，称为“水池”(Wtl),可通过含有适量盐的缓冲液来调节大小,此“水池”能够溶解可溶性极性物质,例如亲水性蛋白质。当反胶束溶液与蛋白质水溶液或含蛋白质的固相接触后，蛋白质可加溶于反胶束溶液的过程，称为前萃(ForwardExtraction)。将含有蛋白质的反胶束溶液转移至第二水相的过程，通过调节pH值与离子强度等，使蛋白质转入水相，从而分离出蛋白质，称为后萃(Backward Extraction)。反胶束溶液不仅可以萃取蛋白，同时还可以分离出油脂，为蛋白质和油脂的分离提取开辟一条具有工业发展的途径。国外早在1977年，Luisi等首次提出利用反胶束法分离提纯葵花籽蛋白质，蛋白前萃率约为30%。国内在20世纪80年代末，史红勤等(1989)报道了反胶束技术萃取较小分子量蛋白的研究，并研究了水相PH值、离子强度、阳离子种类和蛋白质分子量对反胶束萃取蛋白质的影响。许林妹(2005)等又探讨了用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)反胶束萃取大豆蛋白的研究，蛋白的前萃率为50%左右，得到较好的萃取效果。但是，目前尚没有利用反胶束体系萃取核桃蛋白的报道
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺简单，生产成本低，纯度高，变性程度小的从核桃柏中高效提取蛋白的方法。本发明的目的可通过以下技术措施来实现
该方法按如下步骤进行
a.将核桃柏粉碎，过80 120目筛，制成核桃柏粉；
b.反胶束溶液配制反胶束溶液由丁二酸二异辛酯磺酸钠、正己烷和缓冲液配制而成，按照正己烷丁二酸二异辛酯磺酸钠=I mL :0. 04 O. IOg配比，将正己烷溶解在丁二酸二异辛酯磺酸钠中，得混合液，然后按照混合液电解质缓冲液=I mL :0. 01 O. 06 mL配比，将混合液与电解质缓冲液混合，得反胶束溶液；
c.前萃将a步骤的核桃柏粉与b步骤的反胶束溶液按照反胶束溶液核桃柏粉=ImL :0. 02 O. 10 g配比混合，于30 50°C下搅拌30 90 min或利用微波与酶法辅助萃 取，离心后的上清液即为蛋白前萃液；
d.后萃将c步骤的蛋白前萃液与电解质溶液按照蛋白前萃液电解质溶液=IO. 5 I :2体积份混合，于30 40°C下搅拌30-120 min或利用微波辅助萃取，离心后的下层清液即为蛋白后萃液；
e.精制蛋白将d步骤的蛋白后萃液经层析柱脱盐，得产品。本发明的目的还可通过以下技术措施来实现
上述b步骤中所述的电解质缓冲液是指含KCl、NaCl、LiCUMgCl2, NaN03> KNO3> Na2SO4或MgSO4的磷酸缓冲液；所述电解质缓冲液的浓度为O. 03 O. 2 mol/L, pH为7. O 10. O。上述d步骤中所述的电解质溶液是指含KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaN03、KN03、Na2S04或MgSO4的水溶液；所述的电解质溶液的浓度为O. 5 I. 5M、pH为7. O 10. O。上述C步骤所述酶法中所使用的酶为Alcalase碱性蛋白酶、AS1398中性蛋白酶、复合蛋白酶或木瓜蛋白酶，添加比例为核桃柏粉原料质量的1_3%。上述C步骤所述的微波功率为5 20W，温度为30 50°C，时间为30 120 min。上述d步骤所述的微波功率为5 20W，温度为30 40°C，时间为30 120 min。上述c、d步骤所述的离心控制在10-20分钟。本发明具有如下特点
(1)反胶束体系中正己烷沸点低，易除去，表面活性剂可回收利用，成本低；
(2)微波辅助反胶束体系萃取核桃蛋白可以同时分离油脂与蛋白质，简化工艺，减少生广成本，提闻了蛋白的萃取率，可达到50%以上；
(3)蛋白质处在反胶束体系的内水环境中，条件温和，蛋白不易变性，能够保持较长活性和较高的稳定性；
(4)利用酶在反胶束体系中具有“超活性”的特性，在提取过程中可以改性蛋白质；
(5)萃取过程中，不需要加入大量的酸和碱，避免造成环境的污染；
本发明采用反胶束萃取核桃蛋白，根据核桃蛋白特性选择合适的萃取条件和反胶束溶液，同时采用微波与酶法协同反胶束体系作用，明显提高了蛋白质的提取率，是核桃柏蛋白资源的高效开发利用的新途径。由于核桃蛋白被表面活性剂与水分子保护，不与有机溶剂接触，提取温度低，因此不会失活与变性。本发明工艺简单，不需要加入大量的酸和碱，生产成本低，操作条件温和，产品纯度高，蛋白提取率高。
具体实施例方式为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例作进一步说明。实施例I :
a.核桃柏粉的制备将核桃经过冷压榨后得到的核桃柏在高速粉碎机上进行粉碎，粉碎后过120目筛，得核桃柏粉，测定其蛋白质的含量为47. 85% ；
b.反胶束溶液配制按照正己烷丁二酸二异辛酯磺酸钠=ImL :0. 04g配比，将正己烷溶解在丁二酸二异辛酯磺酸钠中，得混合液，待混合液透明后按照混合液KC1浓度为
O.2 mol/L、pH为7. O的磷酸缓冲液=I mL :0. 01 mL配比，将混合液与含KCl的磷酸缓冲液混合，得反胶束溶液，该反胶束溶液中水与丁二酸二异辛酯磺酸钠的摩尔比Wtl为10 ； c.前萃将a步骤的核桃柏粉与b步骤的反胶束溶液按照反胶束溶液核桃柏粉=ImL :0. 10 g配比混合,于30°C下搅拌90 min,搅拌速度为300r/min, Alcalase碱性蛋白酶添加量为核桃柏粉原料质量的3%，然后3000 r/min离心20min，得上清液(即蛋白前萃液)；
d.后萃将c步骤的蛋白前萃液与电解质溶液按照蛋白前萃液KC1重量浓度为O.5M、pH为10. O的水溶液=I :0. 5体积份混合，于40°C下搅拌30min，搅拌速度为300r/min，然后3000 r/min离心IOmin,离心后的下层清液即为蛋白后萃液；
e.精制蛋白取后萃蛋白液经葡聚糖凝胶(sephadeXG)-25层析柱脱盐，再除去水分，得到核桃蛋白产品。蛋白的提取率为60%，蛋白的纯度为92%。实施例2:
a.核桃柏粉的制备将核桃经过冷压榨后得到的核桃柏在高速粉碎机上进行粉碎，粉碎后过80目筛，得核桃柏粉，测定其蛋白质的含量为47. 85% ；
b.反胶束溶液配制按照正己烷丁二酸二异辛酯磺酸钠=ImL:0.10g配比，将正己烷溶解在丁二酸二异辛酯磺酸钠中，得混合液，待混合液透明后按照混合液KC1浓度为
O.03 mol/L、pH为10. O的磷酸缓冲液=I mL :0. 06 mL配比，将混合液与含KCl的磷酸缓冲液混合，得反胶束溶液，该反胶束溶液中水与丁二酸二异辛酯磺酸钠的摩尔比Wtl为30 ;
c.前萃将a步骤的核桃柏粉与b步骤的反胶束溶液按照反胶束溶液核桃柏粉=ImL :0. 02g配比混合,于50°C下搅拌30min,搅拌速度为300r/min, Alcalase碱性蛋白酶添加量为核桃柏粉原料质量的1%，然后3000 r/min离心lOmin，得上清液(即蛋白前萃液)；
d.后萃将c步骤的蛋白前萃液与电解质溶液按照蛋白前萃液KC1重量浓度为I.5M、pH为7. O的水溶液=I 2体积份混合，于30°C下搅拌120 min，搅拌速度为300r/min，然后3000 r/min离心20min,离心后的下层清液即为蛋白后萃液；
e.精制蛋白取后萃蛋白液经葡聚糖凝胶(sephadeXG)-25层析柱脱盐，再除去水分，得到核桃蛋白产品。蛋白的提取率为63%，蛋白的纯度为95%。实施例3:
a.核桃柏粉的制备将核桃经过冷压榨后得到的核桃柏在高速粉碎机上进行粉碎，粉碎后过100目筛，得核桃柏粉，测定其蛋白质的含量为47. 85% ；
b.反胶束溶液配制按照正己烷丁二酸二异辛酯磺酸钠=ImL :0. 07g配比，将正己烷溶解在丁二酸二异辛酯磺酸钠中，得混合液，待混合液透明后按照混合液KC1浓度为
O.21mol/L、pH为8. 5的磷酸缓冲液=I mL :0. 04 mL配比，将混合液与含KCl的磷酸缓冲液混合，得反胶束溶液，该反胶束溶液中水与丁二酸二异辛酯磺酸钠的摩尔比Wtl为20 ;
c.前萃将a步骤的核桃柏粉与b步骤的反胶束溶液按照反胶束溶液核桃柏粉=ImL :0. 07g配比混合,于40°C下搅拌60 min,搅拌速度为300r/min, Alcalase碱性蛋白酶添加量为核桃柏粉原料质量的2%，然后3000 r/min离心15min，得上清液(即蛋白前萃液)；
d.后萃将c步骤的蛋白前萃液与电解质溶液按照蛋白前萃液KC1重量浓度为I.0M、pH为8. 2的水溶液=I :1. 5体积份混合，于35°C下搅拌80 min，搅拌速度为300r/min，然后3000 r/min离心15min,离心后的下层清液即为蛋白后萃液；
e.精制蛋白取后萃蛋白液经葡聚糖凝胶(sephadeXG)-25层析柱脱盐，再除去水分，得到核桃蛋白产品。蛋白的提取率为65%，蛋白的纯度为97%。实施例4:
a.核桃柏粉的制备将核桃经过冷压榨后得到的核桃柏在高速粉碎机上进行粉碎，粉碎后过120目筛，得核桃柏粉，测定其蛋白质的含量为47. 85% ；
b.反胶束溶液配制按照正己烷丁二酸二异辛酯磺酸钠=ImL :0. 04g配比，将正己烷溶解在丁二酸二异辛酯磺酸钠中，得混合液，待混合液透明后按照混合液KC1浓度为
O.2 mol/L、pH为7. O的磷酸缓冲液=I mL :0. 01 mL配比，将混合液与含KCl的磷酸缓冲液混合，得反胶束溶液，该反胶束溶液中水与丁二酸二异辛酯磺酸钠的摩尔比Wtl为10 ；
c.前萃将a步骤的核桃柏粉与b步骤的反胶束溶液按照反胶束溶液核桃柏粉=ImL :0. 10 g配比置于多功能微波萃取仪中，功率为5W，在50°C提取30min，期间搅拌速度为750r/min, Alcalase碱性蛋白酶添加量为1%,然后3000 r/min离心20min,得上清液(即蛋白前萃液);
d.后萃将c步骤的蛋白前萃液与电解质溶液按照蛋白前萃液KC1重量浓度为O.5M、PH为10. O的水溶液=I :0. 5体积份置于多功能微波萃取仪中，功率为20W，在30°C提取120min,期间搅拌速度为750r/min, Alcalase碱性蛋白酶添加量为3%,然后3000 r/min离心lOmin，得下清液(即蛋白后萃液)；
e.精制蛋白取后萃蛋白液经葡聚糖凝胶(sephadeXG)-25层析柱脱盐，再除去水分，得到核桃蛋白产品。蛋白的提取率为61%，蛋白的纯度为91%。实施例5
a.核桃柏粉的制备将核桃经过冷压榨后得到的核桃柏在高速粉碎机上进行粉碎，粉碎后过80目筛，得核桃柏粉，测定其蛋白质的含量为47. 85% ；
b.反胶束溶液配制按照正己烷丁二酸二异辛酯磺酸钠=ImL:0.10g配比，将正己烷溶解在丁二酸二异辛酯磺酸钠中，得混合液，待混合液透明后按照混合液KC1浓度为
O.03 mol/L、pH为10. O的磷酸缓冲液=I mL :0. 06 mL配比，将混合液与含KCl的磷酸缓冲液混合，得反胶束溶液，该反胶束溶液中水与丁二酸二异辛酯磺酸钠的摩尔比Wtl为30 ;
c.前萃将a步骤的核桃柏粉与b步骤的反胶束溶液按照反胶束溶液核桃柏粉=ImL :0. 02 g配比置于多功能微波萃取仪中，功率为20W，在30°C提取120min，期间搅拌速度为750r/min, Alcalase碱性蛋白酶添加量为3%,然后3000 r/min离心IOmin,得上清液(即蛋白前萃液);
d.后萃将c步骤的蛋白前萃液与电解质溶液按照蛋白前萃液KC1重量浓度为O.5M、pH为7. O的水溶液=I :2体积份置于多功能微波萃取仪中，功率为5W，在40°C提取30min，期间搅拌速度为750r/min, Alcalase碱性蛋白酶添加量为1%,然后3000 r/min离心20min，得下清液(即蛋白后萃液)；
e.精制蛋白取后萃蛋白液经葡聚糖凝胶(sephadeXG)-25层析柱脱盐，再除去水分，得到核桃蛋白产品。蛋白的提取率为63%，蛋白的纯度为95%。实施例6:
a.核桃柏粉的制备将核桃经过冷压榨后得到的核桃柏在高速粉碎机上进行粉碎，粉碎后过100目筛，得核桃柏粉，测定其蛋白质的含量为47. 85% ；
b.反胶束溶液配制按照正己烷丁二酸二异辛酯磺酸钠=ImL :0. 07g配比，将正己烷溶解在丁二酸二异辛酯磺酸钠中，得混合液，待混合液透明后按照混合液KC1浓度为
O.21mol/L、pH为8. 5的磷酸缓冲液=I mL :0. 04 mL配比，将混合液与含KCl的磷酸缓冲液混合，得反胶束溶液，该反胶束溶液中水与丁二酸二异辛酯磺酸钠的摩尔比Wtl为20 ;
c.前萃将a步骤的核桃柏粉与b步骤的反胶束溶液按照反胶束溶液核桃柏粉=ImL :0. 07 g配比置于多功能微波萃取仪中，功率为10W，在40°C提取80min，期间搅拌速度为750r/min, Alcalase碱性蛋白酶添加量为2%,然后3000 r/min离心15min,得上清液(即蛋白前萃液);
d.后萃将c步骤的蛋白前萃液与电解质溶液按照蛋白前萃液KC1重量浓度为I.0M、pH为8. 5的水溶液=I :1. 5体积份置于多功能微波萃取仪中，功率为15W，在35°C提取80min,期间搅拌速度为750r/min, Alcalase碱性蛋白酶添加量为2%,然后3000 r/min离心15min，得下清液(即蛋白后萃液)；
e.精制蛋白取后萃蛋白液经葡聚糖凝胶(sephadeXG)-25层析柱脱盐，再除去水分，得到核桃蛋白产品。蛋白的提取率为64%，蛋白的纯度为96%。实施例7
用NaCl代替KC1，其余分别同实施例1-6。实施例8
用LiCl代替KCl，其余分别同实施例1-6。实施例9
用MgCl2代替KCl，其余分别同实施例1-6。实施例10
用NaNO3代替KCl，其余分别同实施例1-6。实施例11
用KNO3代替KCl，其余分别同实施例1-6。实施例12
用Na2SO4代替KCl，其余分别同实施例1-6。实施例13
用MgSO4代替KCl，其余分别同实施例1-6。实施例14
用AS1398中性蛋白酶代替Alcalase碱性蛋白酶，其余分别同实施例1_13。实施例15
用Protamex (复合蛋白酶)代替Alcalase碱性蛋白酶,其余分别同实施例1_13。
实施例16
用木瓜蛋白酶代替Alcalase碱性蛋白酶,其余分别同实施例1_13。
权利要求
1.一种从核桃柏中高效提取蛋白的方法，其特征在于该方法按如下步骤进行 a.将核桃柏粉碎，过80 120目筛，制成核桃柏粉； b.反胶束溶液配制按照正己烧丁二酸二异辛酯磺酸钠=ImL :0. 04 O. IOg配比，将正己烷溶解在丁二酸二异辛酯磺酸钠中，得混合液，然后按照混合液电解质缓冲液=ImL :0. 01 O. 06 mL配比，将混合液与电解质缓冲液混合，得反胶束溶液； c.前萃将a步骤的核桃柏粉与b步骤的反胶束溶液按照反胶束溶液核桃柏粉=ImL :0. 02 O. 10 g配比混合，于30 50°C下搅拌30 90 min或利用微波与酶法辅助萃取，离心后的上清液即为蛋白前萃液； d.后萃将c步骤的蛋白前萃液与电解质溶液按照蛋白前萃液电解质溶液=IO. 5 I :2体积份混合，于30 40°C下搅拌30-120 min或利用微波辅助萃取，离心后的下层清液即为蛋白后萃液； e.精制蛋白将d步骤的蛋白后萃液经层析柱脱盐，得产品。
2.根据权利要求I所述的一种从核桃柏中高效提取蛋白的方法，其特征在于b步骤中所述的电解质缓冲液是指含KCl、NaCl、LiCUMgCl2, NaN03> KNO3> Na2SO4或MgSO4的磷酸缓冲液。
3.根据权利要求2所述的一种从核桃柏中高效提取蛋白的方法，其特征在于所述电解质缓冲液的浓度为O. 03 O. 2 mol/L, pH为7. O 10. O。
4.根据权利要求I所述的一种从核桃柏中高效提取蛋白的方法，其特征在于d步骤中所述的电解质溶液是指含KCl、NaCl、LiCl、MgCl2、NaNO3、KNO3、Na2SO4或MgSO4的水溶液。
5.根据权利要求4所述的一种从核桃柏中高效提取蛋白的方法，其特征在于所述的电解质溶液的浓度为O. 5 I. 5M、pH为7. O 10. O。
6.根据权利要求I所述的一种从核桃柏中高效提取蛋白的方法，其特征在于c步骤所述酶法中所使用的酶为Alcalase碱性蛋白酶、AS1398中性蛋白酶、复合蛋白酶或木瓜蛋白酶，添加比例为核桃柏粉原料质量的1_3%。
7.根据权利要求I所述的一种从核桃柏中高效提取蛋白的方法，其特征在于c步骤所述的微波功率为5 20W，温度为30 50°C，时间为30 120 min。
8.根据权利要求I所述的一种从核桃柏中高效提取蛋白的方法，其特征在于d步骤所述的微波功率为5 20W，温度为30 40°C，时间为30 120 min。
全文摘要
本发明提供一种从核桃粕中高效提取蛋白的方法，该方法按如下步骤进行a.将核桃粕粉碎成核桃粕粉；b.按照正己烷丁二酸二异辛酯磺酸钠＝1mL0.04～0.10g配比，将正己烷溶解在丁二酸二异辛酯磺酸钠中，得混合液，然后将混合液与电解质缓冲液混合，得反胶束溶液；c.将a步骤的核桃粕粉与b步骤的反胶束溶液按照反胶束溶液核桃粕粉＝1mL0.02～0.10g配比混合，搅拌或利用微波与酶法辅助萃取，离心后的上清液即为蛋白前萃液；d.将c步骤的蛋白前萃液与电解质溶液按照蛋白前萃液电解质溶液＝10.5～12体积份混合，搅拌或利用微波辅助萃取，离心后的下层清液即为蛋白后萃液；e.将d步骤的蛋白后萃液经层析柱脱盐，得产品。
文档编号C07K1/14GK102936610SQ20121041417
公开日2013年2月20日 申请日期2012年10月26日 优先权日2012年10月26日
发明者虎海防, 赵晓燕, 王宪昌, 刘凤兰, 孙丽, 陈锋亮 申请人:新疆林科院经济林研究所, 山东省农业科学院农产品研究所