一种从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法
【专利摘要】本发明涉及一种从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，包括以下步骤：（1）花生根用乙醇低温超声震荡提取;（2）提取液60℃以下减压回收乙醇至无醇味;（3）醇提物先用大孔吸附树脂柱吸附、洗脱，除去杂质，再用聚酰胺树脂柱吸附分离;（4）薄层层析跟踪检测，收集白藜芦醇流分，用活性炭脱色，低温减压浓缩，冷冻干燥;（5）用乙醇重结晶，即得高纯度的白藜芦醇;本发明的工艺步骤简便易行，采用聚酰胺树脂可达到吸附、分离纯化一步完成，所使用的溶剂无毒，安全，可靠，产品纯度高、成本低，适合于工业化大生产。
【专利说明】—种从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从花生根中快速提取分离高纯度白藜芦醇的方法。
【背景技术】
[0002]白藜芦醇，是含有芪类结构的非黄酮多酚类化合物，是植物在受到应激时自身合成的一种抗毒素。白藜芦醇主要有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗自由基、保护肝脏、保护心血管和抗心肌缺血等功能，其中，最令人瞩目和最有发展前景的是抗肿瘤作用，被喻为继紫杉醇之后又一新的绿色抗癌药物；同时也被美国专著《抗衰老圣典》一书列为“100种最热门有效抗衰老物质之一”，因此白藜芦醇在医药、食品工业上的应用越来越广，市场价值极闻。
[0003]白藜芦醇(Resveratrol)，又名芪三酚，化学名为3，5，4’ -三羟基二苯乙烯(3，5，4’ 一 trihydrolystilbene),分子式为C14H12O3,分子量为228.2,白色针状晶体,难溶于水，在有机溶剂中的溶解性顺序大致为:丙酮 > 乙醇 > 甲醇 > 乙酸乙酯 > 乙醚 > 氯仿；在366nm的紫外光照射下产生紫色荧光，在低温、避光条件下较为稳定，碱性环境中不稳定。白藜芦醇具有顺、反式两种结构，在自然界中主要是以反式结构存在。白藜芦醇在自然界广泛分布，1940年首次从毛叶藜芦的根部获得，目前至少已经在21个科、31个属的72种植物中发现:如葡萄科的葡萄属、蛇葡萄属，豆科的落花生属、决明属、槐属，百合科的藜芦属，寥科的寥属等。
[0004]白藜芦醇是一种重要的植物抗毒素，在葡萄、虎杖、花生等植物中含量相对较高，目前已经在花生的根、茎、花、果实等各部位发现了该物质的存在，充分说明花生是开发白藜芦醇的一种重要资源，我国学者测定出花生根中白藜芦醇含量是花生衣几十倍和葡萄籽几百倍，但以花生根为原料进行白藜芦醇开发的研究少见报道。在我国，花生根原本是废弃物且资源丰富，并且花生根茎中的白藜芦醇含量也相当可观，用它提取白藜芦醇可变废为宝，将更具有市场竞争力，可以增加农民收入，对于提高花生的利用价值将更加有意义。
[0005]白藜芦醇的提取技术包括有机溶剂浸提法、超声波或微波辅助提取法、酶解法、超临界萃取等；纯化技术有柱层析、薄层层析、高效逆流色谱等。目前，从花生根中提取分离白藜芦醇的方法专利不多，主要有:
CN101074188A 利用大孔吸附树脂富集纯化花生根中白藜芦醇的方法 CN1903815A 超声提取花生根中白藜芦醇的方法 CN1709846A 花生根提取白藜芦醇的生产方法 CN101353675A 利用黑曲霉发酵花生根提取白藜芦醇的方法 CN101597214A 一种萃取花生根中白藜芦醇的方法
上述的五项专利，样品都是采用常规的方法进行提取，包括有机溶剂提取、超声波提取、生物霉发酵提取等，在对提取物的纯化过程中，大都是先采用大孔树脂吸附技术进行除杂，然后再进行硅胶柱层析，用混合有机溶剂梯度洗脱，收集流分，也有采用高效液相制备色谱或者采用二氧化碳超临界流体色谱进行纯化。
[0006]上述的几项专利的不足之处在于操作过程比较复杂，硅胶柱层析操作耗时长，使用大量的有机溶剂，毒性较大，对环境污染严重，产品有机溶剂残留量高。高效液相制备色谱对实验条件要求苛刻，必须采用高端精密的实验仪器和昂贵的色谱纯试剂，产品收率少，使得制备成本很高、且操作不易控制。二氧化碳超临界流体色谱虽然解决了收率问题，但产品的纯度不高，达不到食品级或药用级要求，并在过程中引入了大量的二氧化碳，操作步骤仅限于实验室，产品不能实现产业化。
【发明内容】
[0007]本发明主要解决的技术问题是提供一种能够解决花生根在纯化白藜芦醇过程中，步骤复杂，耗时长，所用溶剂毒性大，产品收率低，不能实现产业化的从花生根中快速提取分离高纯度白藜芦醇的方法。
[0008]本发明的技术解决方案是这样实现的:一种从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，包括如下步骤:
(O花生根粉碎成细粉，用乙醇超声震荡提取，提取温度为20°c -60°C，提取时间为30-60分钟，提取两次，合并提取液；
(2)提取液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.18-1.22的清膏，冷却；
(3)上述(2)的清膏上大孔吸附树脂柱吸附，分别以水、70%乙醇洗脱至洗脱液无色，然后用95%乙醇洗脱，收集95%洗脱的流分，回收乙醇至无醇味，再用聚酰胺树脂柱吸附分离，以醇-酸的混合液为洗脱液进行层析分离；
(4)薄层色谱跟踪检测，收集白藜芦醇流分，用活性炭脱色后，过滤，滤液于50°C-70°C在通氮气保护下，低温减压浓缩至相对密度为1.15-1.18，冷冻干燥；
(5)用乙醇重结晶，即得95%以上的高纯度白藜芦醇。
[0009]优选的，所述的步骤(1)中花生根细粉和乙醇的比是1:10-1:20 (g/ml)。
[0010]优选的，所述的步骤(1)中乙醇浓度为40%_95%。
[0011]优选的，所述的步骤(1)中乙醇浓度为60%。
[0012]优选的，所述的步骤(2)中提取液回收乙醇，是指在60°C以下减压回收。
[0013]优选的，所述的步骤(3)大孔吸附树脂为DlOl或AB-8或DM130或HPD600或HPD400，大孔吸附树脂的粒度为30-50目，用量为:树脂:清膏=10-20:1 (g/g)，树脂柱的径闻比为I:20o
[0014]优选的，所述的步骤(3)中聚酰胺树脂的粒度为60-100目，用量为:树脂:清膏=10-20:1 (g/g)，树脂柱的径高比为1:20。
优选的，所述的步骤(3)中以醇-酸的混合液为洗脱液，醇包括10%-95% (V/V)乙醇或无水乙醇，酸包括10%-30% (V/V)甲酸或10%-100% (V/V)乙酸，洗脱液中醇:酸的比例为2:1-1:2 (V/V)。
[0015]优选的，所述的步骤(4)活性炭的用量为溶液体积的2%_3%( g/100ml)。
[0016]由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点:
本发明采用大孔树脂对样品进行初步提纯后，通过控制色谱分离条件，采用一种分离系统，可以直接进行聚酰胺色谱层析分离，再通过薄层色谱跟踪检测，直接可以得到白藜芦醇纯品，使分离、纯化一步完成，使得操作简便易行。整个过程中只用了两种食品级的溶剂，保证了产品安全、无毒；本发明工艺过程简单，使得花生根作为废弃物得到了回收利用，同时也解决了花生根在纯化白藜芦醇过程中，步骤复杂，耗时长，所用溶剂毒性大，产品收率低，不能实现产业化等问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]附图1是白藜芦醇对照品的高效液相色谱图；
附图2是花生根样品用60%乙醇超声提取后未经纯化的高效液相色谱图；
附图3是本发明所述从花生根中快速提取分离高纯度白藜芦醇的方法获得的样品高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0018]实施例1
一种从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，包含以下步骤:
(I)花生根粉碎成细粉，过60目筛，称取I kg，加10L40%乙醇超声震荡提取，提取温度为40°C，提取两次，每次各30min，合并提取液；(2)提取液60°C以下减压回收乙醇至无醇味，浓缩至相对密度为1.20的清膏，冷却；(3)上述(2)的清膏上AB-8大孔吸附树脂柱吸附，分别以水、70%乙醇洗脱至洗脱液无色，再用95%乙醇洗脱，收集95%洗脱的流分，回收乙醇至无醇味，再用聚酰胺树脂柱(树脂用量为膏重的10倍，柱的径高比为1:20)吸附分离，以95%乙醇:36%乙酸(2:1) (V/V)洗脱；(4)薄层色谱跟踪检测，收集白藜芦醇流分，用活性炭吸附后(活性炭的用量为溶液体积的2%-3%( g/100ml),即每10ml溶液中添加活性炭的量为2g-3g)，过滤，滤液于60°C低温减压(通氮气保护)浓缩至相对密度为1.15-1.18，冷冻干燥；(5)用乙醇重结晶，即得纯度为95.3%的白藜芦醇,收率为0.1%。
[0019]实施例2
一种从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，包含以下步骤:
(I)花生根粉碎成细粉，过60目筛，称取I kg，加10L60%乙醇超声震荡提取，提取温度为40°C，提取两次，每次各30min，合并提取液；(2)提取液60°C以下减压回收乙醇至无醇味，浓缩至相对密度为1.20的清膏，冷却；(3)上DlOl大孔吸附树脂柱吸附，分别以水、70%乙醇洗脱至洗脱液无色，再用95%乙醇洗脱，收集95%洗脱的流分，回收乙醇至无醇味，再用聚酰胺树脂柱(树脂用量为膏重的20倍，柱的径高比为1:20)吸附分离，以乙醇:36%乙酸(2:1)洗脱；(4)薄层色谱跟踪检测，收集白藜芦醇流分，用活性炭吸附后(活性炭的用量为溶液体积的2%-3%( g/100ml)，即每10ml溶液中添加活性炭的量为2g_3g)，过滤，滤液于60°C低温减压(通氮气保护)浓缩至相对密度为1.15-1.18，冷冻干燥；(5)用乙醇重结晶，即得纯度为97.5%的白藜芦醇，收率为0.09%。
[0020]实施例3
一种从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，包含以下步骤:
(I)花生根粉碎成细粉，过60目筛，称取I kg，加20L40%乙醇超声震荡提取，提取温度为50°C，提取两次，每次各30min，合并提取液；(2)提取液60°C以下减压回收乙醇至无醇味，浓缩至相对密度为1.20的清膏，冷却；(3)上HPD-600大孔吸附树脂柱吸附，分别以水、70%乙醇洗脱至洗脱液无色，再用95%乙醇洗脱，收集95%洗脱的流分，回收乙醇至无醇味，再用聚酰胺树脂柱(树脂用量为膏重的15倍，柱的径高比为1:20)吸附分离，以95%乙醇:10%甲酸(2:1)洗脱；(4)薄层色谱跟踪检测，收集白藜芦醇流分，用活性炭吸附后(活性炭的用量为溶液体积的2%-3%( g/100ml)，即每10ml溶液中添加活性炭的量为2g_3g)，过滤，滤液于60°C低温减压(通氮气保护)浓缩至相对密度为1.15-1.18，冷冻干燥；(5)用乙醇重结晶，即得纯度为95.8%的白藜芦醇，收率为0.09%ο
[0021]实施例4
一种从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，包含以下步骤:
(I)花生根粉碎成细粉，过60目筛，称取I kg，加20L60%乙醇超声震荡提取，提取温度为40°C，提取两次，每次各30min，合并提取液；(2)提取液60°C以下减压回收乙醇至无醇味，浓缩至相对密度为1.22的清膏，冷却；(3)上DM130大孔吸附树脂柱吸附，分别以水、70%乙醇洗脱至洗脱液无色，再用95%乙醇洗脱，收集95%洗脱的流分，回收乙醇至无醇味，再用聚酰胺树脂柱(树脂用量为膏重的10倍，柱的径高比为1:20)吸附分离，以95%乙醇:20%乙酸(2:1)洗脱；(4)薄层色谱跟踪检测，收集白藜芦醇流分，用活性炭吸附后(活性炭的用量为溶液体积的2%-3%( g/100ml)，即每10ml溶液中添加活性炭的量为2g_3g)，过滤，滤液于60°C低温减压(通氮气保护)浓缩至相对密度为1.15-1.18，冷冻干燥；(5)用乙醇重结晶，即得纯度为96.1%的白藜芦醇，收率为0.12%。
[0022]实施例5
一种从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，包含以下步骤:
(I)花生根粉碎成细粉，过60目筛，称取I kg，加10L40%乙醇超声震荡提取，提取温度为40°C，提取两次，每次各30min，合并提取液；(2)提取液60°C以下减压回收乙醇至无醇味，浓缩至相对密度为1.22的清膏，冷却；(3)上HPD600大孔吸附树脂柱吸附，分别以水、70%乙醇洗脱至洗脱液无色，再用95%乙醇洗脱，收集95%洗脱的流分，回收乙醇至无醇味，再用聚酰胺树脂柱(树脂用量为膏重的20倍，柱的径高比为1:20)吸附分离，以95%乙醇:36%乙酸(1:1)洗脱；(4)薄层色谱跟踪检测，收集白藜芦醇流分，用活性炭吸附后(活性炭的用量为溶液体积的2%-3%( g/100ml)，即每10ml溶液中添加活性炭的量为2g_3g)，过滤，滤液于60°C低温减压(通氮气保护)浓缩至相对密度为1.15-1.18，冷冻干燥；(5)用乙醇重结晶，即得纯度为96.3%的白藜芦醇，收率为0.1%。
[0023]实施例6
一种从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，包含以下步骤:
(I)花生根粉碎成细粉，过60目筛，称取I kg，加10L40%乙醇超声震荡提取，提取温度为40°C，提取两次，每次各30min，合并提取液；(2)提取液60°C以下减压回收乙醇至无醇味，浓缩至相对密度为1.20的清膏，冷却；(3)上AB-8大孔吸附树脂柱吸附，分别以水、70%乙醇洗脱至洗脱液无色，再用95%乙醇洗脱，收集95%洗脱的流分，回收乙醇至无醇味，再用聚酰胺树脂柱(树脂用量为膏重的10倍，柱的径高比为1:20)吸附分离，以95%乙醇:36%乙酸(1:2)洗脱；(4)薄层色谱跟踪检测，收集白藜芦醇流分，用活性炭吸附后(活性炭的用量为溶液体积的2%-3%( g/100ml)，即每10ml溶液中添加活性炭的量为2g_3g)，过滤，滤液于60°C低温减压(通氮气保护)浓缩至相对密度为1.15-1.18，冷冻干燥；(5)用乙醇重结晶，即得纯度为98.8%的白藜芦醇，收率为0.08%ο
[0024]上述实施例的有益效果是:本发明通过控制薄层色谱分离条件，直接进行聚酰胺色谱层析分离，通过薄层色谱跟踪检测，可以直接得到EGCG纯品，见附图1、2、3，而不是混合物，这样使分离、纯化一步完成，使得操作简便易行；而且整个过程中只用了食品级的溶剂乙醇、乙酸(或甲酸)和活性炭，保证了产品安全、无毒。
[0025]上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，其特征在于，包括如下步骤: (O花生根粉碎成细粉，用乙醇超声震荡提取，提取温度为20°c -60°C，提取时间为30-60分钟，提取两次，合并提取液； (2)提取液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.18-1.22的清膏，冷却； (3)上述(2)的清膏上大孔吸附树脂柱吸附，分别以水、70%乙醇洗脱至洗脱液无色，然后用95%乙醇洗脱，收集95%洗脱的流分，回收乙醇至无醇味，再用聚酰胺树脂柱吸附分离，以醇-酸的混合液为洗脱液进行层析分离； (4)薄层色谱跟踪检测，收集白藜芦醇流分，用活性炭脱色后，过滤，滤液于50°C-70°C在通氮气保护下，低温减压浓缩至相对密度为1.15-1.18，冷冻干燥； (5)用乙醇重结晶，即得95%以上的高纯度白藜芦醇。
2.根据权利要求1所述的从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，其特征在于:所述的步骤(1)中花生根细粉和乙醇的比是1:10-1:20 (g/ml)。
3.根据权利要求1所述的从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，其特征在于:所述的步骤(1)中乙醇浓度为40%-95%。
4.根据权利要求 3所述的从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，其特征在于:所述的步骤(1)中乙醇浓度为60%。
5.根据权利要求1所述的从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，其特征在于:所述的步骤(2)中提取液回收乙醇，是指在60°C以下减压回收。
6.根据权利要求1所述的从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，其特征在于:所述的步骤(3)大孔吸附树脂为DlOl或AB-8或DM130或HPD600或HPD400，大孔吸附树脂的粒度为30-50目，用量为:树脂:清膏=10-20:1 (g/g)，树脂柱的径高比为1:20。
7.根据权利要求1所述的从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，其特征在于:所述的步骤(3)中聚酰胺树脂的粒度为60-100目，用量为:树脂:清膏=10-20:1 (g/g),树脂柱的径闻比为1:20。
8.根据权利要求1所述的从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，其特征在于:所述的步骤(3)中以醇-酸的混合液为洗脱液，醇包括10%-95% (V/V)乙醇或无水乙醇，酸包括10%-30% (V/V)甲酸或10%-100% (V/V)乙酸，洗脱液中醇:酸的比例为2:1_1:2 (V/V)。
9.根据权利要求1所述的从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，其特征在于:所述的步骤(4)活性炭的用量为溶液体积的2%-3%( g/100ml)。
【文档编号】C07C37/82GK104163754SQ201410343453
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】刘臣, 唐长波 申请人:苏州市职业大学