一种超高压提取北虫草大米培养基中虫草素的方法
【专利摘要】本发明涉及一种超高压提取北虫草大米培养基中虫草素的方法，属于天然产物【技术领域】。本发明的工艺流程包括对北虫草培养基进行切片、热风干燥、粉碎、超高压提取、离心、陶瓷膜除杂、浓缩、冷冻干燥，再采用高速逆流色谱纯化虫草素，最后通过高效液相色谱进行检测。采用本方法，北虫草培养基中虫草素的得率达到常规方法的1.2倍，纯度可达90%以上。本发明采用超高压提取虫草素具有高效低耗、提取率高、杂质含量低、稳定性好等优点，而且整个提取过程不会产生高温，可有效保留虫草素活性成分及结构。本方法所制备的虫草素安全无污染，具有很高的食（药）用价值，为食用菌北虫草副产物的综合利用带来了一定的市场应用前景和经济效益。
【专利说明】一种超高压提取北虫草大米培养基中虫草素的方法
【技术领域】
[0001]本发明具体的涉及一种快速高效提取北虫草大米培养基中虫草素的方法，属生物【技术领域】。采用超高压提取北虫草培养基中虫草素，并且利用陶瓷膜对提取液进行初步除杂，最后采用高速逆流色谱制备高纯度的虫草素。
【背景技术】
[0002]北虫草，作为一种药(食)用菌，与冬虫夏草具有相似的作用，已被我国人民认可并广泛接受。随着市场需求的上升，人工栽培北虫草的技术不断成熟并广泛应用于市场，取得良好的市场效应和经济效益的同时，随之产生的问题是采收子实体后的残留培养基被废弃于环境中导致腐败变酸发臭造成污染。经研究表明北虫草培养基中存在虫草素，并高于子实体中的含量，它具有免疫调节、抗肿瘤、抗真菌、抗衰老和治疗白血病的作用，具有可观的医疗和商用价值。近年来，国内外研究人员对北虫草副产物的综合利用高度重视，不断对有效成分进行提取分离、开发并转化为高附加值的功能新产品。
[0003]超高压提取技术应用于提取天然有效成分的研究已有报道，而超高压提取北虫草培养基中的虫草素在国内外中还未见报道。目前所涉及的虫草素提取方法已有报道的如2010年第16期《安徽农学通报》张丽艳采用正交试验法研究了水浸提虫草素的工艺，所得最适参数是40°C水浸提取4次，料液比1: 20，每次提取2h ；2006年第22期《食品安全与检测》中陈尚卫等比较了超声波法和回流法提取虫草素，认为两者结果相近，但超声波法操作更简便，回流法则需要较高的温度，但虫草素的热稳定性较差；2010年第31期《食品科学》王淘则采用微波-超声波协同提取虫草素，充分发挥了超声波和微波两种提取方法的优点，所以提取效率比传统的方法高得多，且提取时间较短。众所周知，水浸提法和回流法耗时长，所需温度较高，不利于虫草素活性的保留，技术含量低，工艺繁琐，提取不充分等。超声提取的提取时间和能耗大大降低，但噪音大、对人体具有辐射、规模化生产难以实现等。另外，结合现有发表的文献资料和专利可知，目前采用的虫草素富集纯化技术可归纳为:离子交换树脂法、硅胶柱层析、超临界流体萃取技术等。2004年第四期《食用菌》期刊中车振明等经过对蛹虫草子实体及培养基的粉碎、石油醚脱脂、80°C—85°C水浴12 h、调节等电点沉淀、732-NH4离子交换树脂的分离、浓缩、4°C下低温结晶，得到一定纯度的虫草素晶体。中国专利(CN 101906127 A)“一种从北冬虫夏草培养基残基中提取虫草素和虫草多糖的方法”中使用大孔树脂吸附及洗脱，同时纯化虫草素和多糖。中国专利(CN 1339440 A)“一种超临界萃取虫草脱氧核苷的生产方法”中以蛹虫草人工培养后的发酵物为原料，采用超临界技术萃取核苷类有效成分，并以乙醇等作为夹带剂减压分离获得核苷多组份及单体。传统的虫草素纯化方法自动化程度不高，操作繁琐，重现性不稳定，且易造成虫草素的吸附损耗，不易回收。目前研究者在虫草素纯化方法上另辟蹊径，中国专利(CN 102977172A)中指出蛹虫草粗提液可经反相ODS填料柱吸附后得粗虫草素采用高效液相色谱进行纯化，另外中国专利《CN 102321135 A》发明一种利用高速逆流色谱分离纯化虫草属真菌的提取物中虫草素的方法。然而，因进样量受限，不适宜大规模制备虫草素。
【发明内容】
[0004]为克服现有技术中的不足，本发明旨在提供一种超高压提取北虫草大米培养基中虫草素的方法，该方法在保持较高的虫草素提取率的同时，保留其原有结构和活性不变，显著提高效率，有效降低能耗。通过优化工艺过程，使用本方法可使虫草素的提取率达到0.18%以上，比常规方法所得的提取率提高了 20%，而且通过高速逆流色谱分离后纯度可达到90%以上。
[0005]为了实现本发明的目的，本发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案:
一种快速高效提取北虫草大米培养基中虫草素的方法，具体步骤如下:
(1)原料粉碎:将相同批次的北虫草大米培养基收集切片，并于60°c热风干燥至含水率低于5%，使用超微粉碎进行粉碎，粉碎后过20 g —180目筛；
(2)超高压处理:称量一定质量粉碎后的培养基粉末于容器中，按照料液比1:40-70加入蒸馏水，搅拌均匀使其充分润湿，放入真空封装机中抽真空确保容器中无气泡，再放入超高压的处理室，在处理室中加入加载介质自来水，用深度尺检测液面高度合适为止，取走深度尺后将柱塞推至加压位置，关上超高压主机防护门，准备开始加压。超高压处理条件为:压力300-600MPa，处理时间9_15min，处理完毕得处理液；
(3)陶瓷膜除杂:将处理液先通过150KD陶瓷膜，流速16-30mL/min，压力
0.20bar-l.0bar，温度23°C -30°C，保留透过液，再通过15KD陶瓷膜进行二次除杂，流速、压力和温度与第一次保持一致；
(4)旋转蒸发浓缩:将除杂的虫草素提取液倒入圆底烧瓶中，设定温度60°C进行旋蒸，浓缩至原来的百分之一体积；
(5)冷冻干燥:将浓缩液转移至冻干盘中后放入冻干机中，设定温度从_3°C开始每隔2h上调2°C，直至45°C，检查样品冻干完全后慢减压至ATM后推开上盖，快速取走样品放置于防潮避光处；
(6)高速逆流色谱纯化:按比例配置溶剂体系乙酸乙酯-正丁醇-0.5%氨水(2:3:5)倒入分液漏斗中，将其反复多次振荡摇匀，静置10分钟左右，即出现明显分层，后将两相移入干净干燥的两试剂瓶中，放置超声震动仪中超声脱气20min后放至室温。设置主机温度28°C,然后以流速30mL/min泵入上相，再停泵以主机转速900r/min、流速3mL/min泵入下相，当体系达到动力学平衡后开启检测器，基线稳定后开始手动注入提前用各5mL体积上、下相溶解的虫草素样品，检测波长254nm，同时进行图谱采集，根据谱图峰形手动收集色谱组分；
(7)高效液相色谱定量分析:将收集好的组分分别过0.45 μ m滤膜后进入1.5mL棕色进样瓶中，色谱条件为:色谱柱C18柱(250mm X 2.6mm, 5um);流动相为乙腈-水(5:95);体积流量lmL/min ;进样量10 μ L ;检测波长260nm ;柱温35°C。
[0006]本发明有以下优点:
(I)本发明的主要优势是，超高压处理可以维持在接近常温下溶出有效成分，从而使有效活性成分得到保存。同时，由于高压处理可以杀灭部分微生物，可使提取和灭菌同步进行，另外，超高压在卸压时压力传递能瞬间完成，容器内任何方向和位置的压力相等，作用在物料上的力是均匀一致的。
[0007]( 2 )本发明中北虫草培养基不同的粉碎目数对超高压设备提取虫草素含量和得率的影响显著，最终优化的结果是粉碎过20目筛的培养基粉末经过超高压提取后含量和得率均最高，即在本发明中证实超高压设备提取北虫草培养基中虫草素时并非是粉碎至越细越有利于虫草素的溶出，相反，粉碎越细的物料在提取过程中产生的杂质更多，虫草素的含量和得率反而下降。
[0008](3)陶瓷膜分离设备以“错流过滤”这独有的技术优势可有效去除样品溶液中大量存在的可溶性蛋白、胶体、杂质多糖、亚微米微粒等；且膜分离材料无毒、无污染，无需额外助剂，可实现安全清洁生产；分离精度高，通过透析循环，可提高虫草素收率。
[0009]( 4 )高速逆流色谱无需固体作固定相，不存在固体对样品组分的吸附、玷污、变性、失活、拖尾等现象，能实现很高的回收率，节省昂贵的材料消耗和溶剂消耗；溶剂极性可调，无需更换不同极性的色谱柱即可实现流动相从弱极性到强极性或相反的转化；色谱柱无填料，柱内空间全部是有效空间，容积大，样品负载能力强，制备量大，重现性好，可以快速分离虫草素，得到高纯度虫草素溶液。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]附图1是虫草素标准曲线。
[0011]附图2是虫草素标准品的高效液相色谱图。
[0012]附图3是超高压提取后虫草素粗品的高效液相色谱图。
[0013]附图4是超声波提取后虫草素粗品的高效液相色谱图。
[0014]附图5是超高压提取液透过陶瓷膜后虫草素的高效液相色谱图。
[0015]附图6是高速逆流色谱分离虫草素图谱。
[0016]附图7是高速逆流色谱纯化后虫草素样品的物质的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0017]本发明的步骤是:对北虫草培养基进行粉碎，超高压处理后，通过陶瓷膜分离初步除杂后，将澄清液液移置旋转蒸发器中浓缩，在冷冻干燥机中干燥后取样进入高速逆流色谱中进行纯化得到高纯度虫草液，最后用高效液相色谱进行定量分析。
[0018]下面用具体实施例详述本发明:
实施例一
取粉碎后过20目筛的北虫草培养基粉末30.0g于可密封的塑料容器中，按料液比为I:70加入蒸馏水后，搅拌均匀使其充分润湿，使用真空包装机脱气以确保容器中无气泡，后放入超高压处理装置中，在处理室中加入加载介质自来水，用深度尺检测液面高度合适为止，取走深度尺后将柱塞推至加压位置，关上超高压主机防护门，准备开始加压。设置压力400MPa，保压时间15min，处理完毕卸压后，取出容器，倒出提取液离心(4000r/min，1min),弃残渣得超高压提取液。
[0019]采用高效液相色谱法对超高压提取清液中虫草素的含量进行了测定，色谱条件为:色谱柱C18柱(250mmX 2.6mm, 5um);流动相为乙腈-水(5:95);体积流量lmL/min ;进样量1uL ;检测波长260nm ;柱温35°C。其色谱图参见图1至图3。
[0020]从色谱图中我们可以看出，超高压提取液中物质很杂，特别是高效液相色谱图前面部分有很多杂质峰，但尽管如此，在14.610min仍有一很高的色谱峰，其保留时间与标准色谱图(图2)相一致，这就是虫草素，峰表显示含量为44.86%，通过虫草素标准曲线方程及峰面积归一法计算其提取得率为1843.49ug/g，与常规方法超声波提取虫草素相比(见图4)，其提取得率为1586.69ug/g，且耗时少，含量高。由于虫草素粗提品含有较多的杂质，直接用于高速逆流色谱进行分离纯化难度比较大，于是将超高压提取液先通过150KD陶瓷膜，流速20mL/min，压力0.40bar，温度28°C，保留透过液，再通过15KD陶瓷膜进行二次除杂，频率、压力和温度与第一次保持一致。采用高效液相色谱法对陶瓷膜透过液中虫草素的含量进行了测定(见图5)，图谱显示色谱图前面的杂质峰有减少，且含量提高到了49.56%。透过液再旋转浓缩至原来体积的百分之一，使用冻干机干燥得超高压提取虫草素粗品 1.436g。
[0021]虫草素粗提物样品加入1mL上相和1mL下相使其溶解，按比例配置溶剂体系乙酸乙酯-正丁醇-水(2:3:5)倒入分液漏斗中，将其反复多次振荡摇匀，静置10分钟左右，即出现明显分层，后将两相移入干净干燥的两试剂瓶中，放置超声震动仪中超声脱气20min后放至室温。设置主机温度28°C，然后以流速30mL/min泵入上相，再停泵以主机转速900r/min、流速3mL/min泵入下相，当体系达到动力学平衡后开启检测器，基线稳定后开始手动注入提前用各5mL体积上、下相溶解的虫草素样品，检测波长254nm，同时进行图谱采集，根据图谱峰形手动收集93.00Γ111.583min的流出组分共计约65mL，见图6。然后用一次性注射器吸取各组分过0.45um滤膜至1.5mL进样瓶中，最后用高效液相色谱进行定量分析，见图7，经测定确定峰C为虫草素峰，在260nm波长下检测峰纯度为97.58%。
[0022]实施例二
与实施例一不同的是:使用的北虫草培养基粉末粉碎过60目筛，最后测得其含量为41.09%，超高压提取得率为1558.556ug/g，冻干后超高压提取虫草素粗品质量为1.311g，干燥的虫草素粗品经过逆流色谱分离后纯度为94.02%。
[0023]实施例三
与实施例一不同的是:使用的北虫草培养基粉末粉碎过60目筛,压力为600Mpa,最后测得超高压提取液中虫草素含量为40.57%，提取得率为1393.71ug/g，冻干后超高压提取虫草素粗品质量为1.142g，干燥的虫草素粗品经过逆流色谱分离后纯度为91.82%。
[0024]实施例四
与实施例一不同的是:使用的北虫草培养基粉末粉碎过120目筛，最后测得超高压提取液中虫草素含量为37.44%，提取得率为1418.57ug/g,冻干后超高压提取虫草素粗品质量为1.259g,干燥的虫草素粗品经过逆流色谱分离后纯度为90.25%。
[0025]实施例五
与实施例一不同的是:使用的北虫草培养基粉末粉碎过120目筛,在压力600Mpa下提取9min，最后测得其含量为33.53%，超高压提取得率为291.60ug/g，鉴于得率太低，最后没有再经过陶瓷膜除杂用高速逆流色谱分离的必要了。
【权利要求】
1.一种超高压提取北虫草大米培养基中虫草素的方法，其特征在于具体步骤如下: (1)原料预处理:将相同批次北虫草大米培养基收集后切片，并于60°c热风干燥至含水率低于5%，粉碎过20目筛-180目筛； (2 )超高压处理:将过筛后的培养基粉配置一定的料液比，真空脱气后放入超高压设备进行处理，压力300-600MPa，处理后离心得提取液； (3)陶瓷膜分离:将提取液通过陶瓷膜除杂，得到透过液； (4)旋转浓缩:透过液使用旋转蒸发仪对上述处理液在温度60°C下进行浓缩，浓缩至原来体积的百分之一，得到浓缩液； (5)冷冻干燥:将浓缩液放入冻干机中干燥，温度从_3°C_45°C，每隔2h均匀上调，时间 24-26h ； (6)高速逆流色谱制备:取冻干样品于逆流色谱中制备高纯度虫草素； (7)高效液相色谱测定:HPLC测定虫草素含量，色谱条件:色谱柱C18柱，流动相是乙腈:水=5:95,流速1.011117111；[11,柱温351€,进样量 10uL。
2.根据权利要求1所述的一种超高压提取北虫草大米培养基中虫草素的方法，其特征在于步骤(1)中北虫草大米培养基粉碎后过20目筛。
3.根据权利要求1所述的一种超高压提取北虫草大米培养基中虫草素的方法，其特征在于步骤(2)中超高压处理条件为:温度为常温，处理时间9-15min，料液比(g/L)为1:40-70。
4.根据权利要求1所述的一种超高压提取北虫草大米培养基中虫草素的方法，其特征在于步骤(3)中陶瓷膜分离条件为:将处理液先通过150KD陶瓷膜，流速16-30mL/min，压力0.20bar-l.0bar，温度23°C -30°C，保留透过液，再通过15KD陶瓷膜进行二次除杂，流速、压力和温度与第一次保持一致。
5.根据权利要求1所述的一种超高压提取北虫草大米培养基中虫草素的方法，其特征在于步骤(6)中高速逆流色谱条件为:溶剂系统V (乙酸乙酯):V (正丁醇):V (水)=1?2:3?4:5，主机转速700-900r/min，流速2.5_4mL/min，分离温度15_35°C，进样体积最大为 20mL。
【文档编号】C07H1/06GK104447925SQ201410686548
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】程薇, 高虹, 陈丽冰, 吴光旭, 史德芳, 范秀芝, 郭鹏, 陈明利, 薛淑静, 杨德, 乔宇, 汪兰, 吴文锦, 李露 申请人:湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所