一种布舍瑞林的固液合成方法
【专利摘要】本发明公开了一种布舍瑞林的固液合成方法，包括以下步骤：1)用固相合成方法合成五肽片段H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH，2)用固相合成方法合成三肽片段H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-OH，然后液相合成方法连接特殊氨基酸Pro-NHEt·HCl合成4肽片段H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-NHEt；3)五肽片段与四肽片段液相缩合，经过沉淀、纯化、脱盐、转盐，得布舍瑞林。本发明工艺步骤简单，反应条件温和，易于控制，对人体和环境危害小，产率高，适合大规模生产。
【专利说明】一种布舍瑞林的固液合成方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种布舍瑞林的固液合成方法。
【背景技术】
[0002] 布舍瑞林（Buserelin)，商品名为CinnaFact，CinnaGen公司生产的醋酸 Buserelin水针剂已投入市场。适应症：用于治疗子宫内膜异位、中枢性早熟、乳腺癌 和前列腺癌。布舍瑞林是促性腺素释放激素类（LH-RH)药物，LH-RH是由下丘脑分泌 的激素，能促进垂体合成并释放黄体生成素、卵细胞雌激素。该类激素的同系物包括 戈舍瑞林（Goserelin)、亮丙瑞林（Leuprorelin)、曲普瑞林（Triptorelin)、戈那瑞林 (Gonadoerlin)〇
[0003] 布舍瑞林为线性九肽，分子量为1239. 42, CAS登记号为57982-77-1，分子式为： C60H86N16O13，其氨基酸序列为 H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (tBu) -Leu-Arg-Pro-NHEt。结 构式如下：
【权利要求】
1. 一种布舍瑞林的固液合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1) 采用Fmoc固相合成策略，利用偶联剂依次将Fmoc-Tyr(tBu)-〇H、 Fmoc_Ser(tBu)-〇H、Fmoc_Trp(Boc)-〇H、Fmoc_His(Trt)-〇H、H-Pyr-OH 按照布舍瑞林前 5 个氨基酸的序列连接至树脂上，得到全保护的五肽树脂，即Pyr-His (Trt) -Trp (Boc) -Ser ( tBu)-Tyr (tBu)-树脂；切割树脂，同时脱除侧链保护基，经乙醚沉淀，得到线性五肽片段，即 H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-〇H ； (2) 采用Fmoc固相合成策略，利用偶联剂依次将Fmoc-Arg(HCl)-〇H、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-D-Ser (tBu)-OH按照布舍瑞林第6至第8个氨基酸的序列连接至树脂上，得到全保护 的三肽树脂，即Fmoc-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-树脂；切割树脂，乙醚沉淀，得到全保护 的三肤片段，即 Fmoc-D-Ser (tBu)-Leu-Arg (HC1)-0H ; (3) 将步骤（2)得到的三肽片段与特殊氨基酸Pro-NHEt ? HC1液相中偶联，脱除Fmoc 基团，得到四肽片段，即：H-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pr〇-NHEt ; (4) 将步骤⑴得到的五肽片段与步骤（3)得到的四肽片段液相中在偶联剂的作用下 进行缩合，乙醚沉淀，得到布舍瑞林粗肽，再经脱盐，转盐，得到布舍瑞林纯肽。
2. 根据权利要求1所述的布舍瑞林的固液合成方法，其特征在于，步骤（1)和（2)中， 所用的树脂为二氯三苯甲基氯树脂。
3. 根据权利要求1所述的布舍瑞林的固液合成方法，其特征在于，步骤（1)和（2)中， 所使用的偶联剂为以下三种混合物中的任选一种：HBTU、Y试剂和DIEA的混合物；HATU、Y 试剂和DIEA的混合物；DIC与Y试剂的混合物；其中，所述的Y试剂为HoBt或HoAt。
4. 根据权利要求3所述的布舍瑞林的固液合成方法，其特征在于，步骤⑴和⑵中， 按1: (1?6) : (2?12)的摩尔比分别称取溶胀后的二氯三苯甲基氯树脂、Fmoc保护氨基 酸和DIEA，将Fmoc保护氨基酸、DIEA溶于DMF，预活化，然后再加入到溶胀后的二氯三苯甲 基氯树脂中，室温震荡反应〇. 5?3小时连接第一个Fmoc保护氨基酸，连接下一个氨基酸 之前用哌啶的DMF溶液脱Fmoc保护基2次，时间分别为3?5分钟和15?25分钟，每次 连接上一个氨基酸之后和脱除Fmoc保护基之后都需要用DMF、DCM洗涤3?10次； 自连接第二个氨基酸起，按1: (1?6) : (1?6) : (1?6) : (2?12)的摩尔比分别计算 树脂、Fmoc保护氨基酸、HoBt、HBTU和DIEA的量，将Fmoc保护氨基酸、HoBt溶于二甲基甲 酰胺，冰上预活化，加入HBTU和DIEA，然后再加入到树脂中，室温震荡反应0. 5?3小时连 接Fmoc保护氨基酸，重复上述过程，直至连接完毕。
5. 根据权利要求1所述的布舍瑞林的固液合成方法，其特征在于，步骤（1)、（2)和（3) 中，脱除Fmoc保护基的方法是用体积百分含量25%的哌啶的DMF溶液。
6. 根据权利要求1所述的布舍瑞林的固液合成方法，其特征在于，步骤（1)中，切割肽 树脂的方法是将三氟乙酸、三异丙基硅烷、水按体积比95:2. 5:2. 5混合，加入全保护的五 肽树脂中，室温震荡反应〇. 5?4小时后，将反应液过滤逐滴滴入冷乙醚中，沉淀，离心，洗 涤，干燥，得到布舍瑞林五肽片段；步骤（2)中，切割肽树脂的方法是将三氟乙酸与二氯甲 烷按体积比1:99混合，加入全保护的三肽树脂中，室温震荡反应0. 5?4小时后，将反应液 过滤逐滴滴入冷乙醚中，沉淀，离心，洗涤，干燥，得到布舍瑞林三肽片段。
7. 根据权利要求1所述的布舍瑞林的固液合成方法，其特征在于，步骤（3)中，按 1: (1?6) : (1?6) : (1?6) : (2?12)的摩尔比分别取羧基端三肽片段组分、特殊氨基酸 Pro-NHEt ? HC1、缩合剂X、试剂Y和DIEA，其中所述的缩合剂X为HATU、HBTU、PyBop、DCC、 DIC、EDC ? HC1其中一种或多种组合，试剂Y为HoBt或HoAt ;将羧基端三肽片段组分、试剂 Y溶于DMF，冰浴预活化，加入缩合剂X和DIEA，室温搅拌反应0. 5?4小时，水沉淀，离心， 洗涤，得到Fmoc保护的布舍瑞林四肽；将Fmoc保护的布舍瑞林四肽片段溶解于预先冰浴的 25% v/v的哌啶的DMF溶液，室温搅拌反应0. 5?2小时，乙醚沉淀，离心，洗漆，得到布舍 瑞林四肽片段。
8.根据权利要求1所述的布舍瑞林的固液合成方法，其特征在于，步骤（4)中，按 1: (1?6) : (1?6) : (1?6) : (2?12)的摩尔比分别取氨基端四肽片段组分、羧基端五肽 片段组分、缩合剂X、试剂Y和DIEA，其中，所述的缩合剂X为HATU、HBTU、PyBop、DCC、DIC、 EDC ? HC1其中一种或多种组合，试剂Y为HoBt或HoAt ;将两种片段组分、试剂Y溶于DMF， 冰浴预活化，加入缩合剂X和DIEA，室温震荡反应0. 5?4小时，乙醚沉淀，离心，洗涤，得到 布舍瑞林粗肽。
【文档编号】C07K1/04GK104402977SQ201410741975
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】董守良, 玄其存, 曹硕, 常民 申请人:泰州施美康多肽药物技术有限公司