专利名称：有抗人体免疫缺损病毒作用的环孢菌素衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的由环孢菌素类物质衍生得到的环肽物质，该环肽不仅对人体免疫缺损性病毒(HIV)具有很强的抑制作用，而且没有任何的免疫抑制活性。此类环肽物质尤其是在欧洲专利EP 484 281中特别请求给予保护。其中，此专利的说明书中明确请求保护的物质之一是(γ-羟基-N-甲基亮氨酸)环孢菌素。虽然此物质由环孢菌素A经微生物羟基化作用即可容易地制备得到，但在EP 484 281中指出，与具有最强抗HIV活性并被称为甲基异亮氨酸-4-环孢菌素或甲基缬氨酸-4-环孢菌素相比，该物质的抗HIV活性要低5-6倍。此3种物质都没有免疫抑制活性。出乎意料的是，该环孢菌素氨基酸中肌氨酸的3位亚甲基上引人适当的取代基，其抗HIV活性将被显著地提高，但免疫抑制活性并没有任何增加。环孢菌素A可用于防止器官移植后产生生器官移植排异作用，但所需环孢菌素A的治疗剂量很高，并且环孢菌素衍生物在抗HIV治疗中所需的剂量也同样的较高，因此本发明的目的是提供新的环孢菌素衍生物，该衍生物具有高效抗HIV活性，同时这些环孢菌素衍生物可由环孢菌素A只经过几个步骤即制备得到，而环孢菌素A作为产品现已被成吨的生产出来。
本发明还涉及通式I所示的新环肽物质，
其中A-K表示下列的氨基酸片断A是由通式II所示取代的高苏氨酸，R1-CH2CH(CH3)-CH(OH)-CH(NHCH3)-COOHII其中R1是正丙基或丙烯基，双键物质优选为反式构型，B是α-氨基丁酸，缬氨酸，正缬氨酸或苏氨酸，C是由通式III所示的(D)-氨基酸，CH3NH-CH(R)-COOH III
其中R是C2-C6烷基，链烯基，炔基，这些基团可以是直链或支链的，并可被羟基，氨基，C1-C4烷基氨基，C1-C4二烷基氨基，烷氧基或酰氧基进一步取代，COOR2，CONHR2，其中R2可是直链或支链的C1-C4烷基，X-R3，其中X是O或S，R3是直链或支链的C1-C4烷基，链烯基，炔基，并且当X为S时，R3也可是芳香基或杂芳基，卤素，优选氟，氰基，或CHR4R5，其中R4是氢，甲基，乙基或苯基，并且R5是氢，羟基或卤素，优选氟，还包括氨基，C1-C4烷基氨基，C1-C4二烷基氨基，酰氧基，优选乙酰氧基，以及叔-丁氧基羰基-氨基乙氧基-乙氧基-乙酰氧基，或烷氧基羰基，优选丁氧基羰基，D是N-甲基-γ-羟基亮氨酸或N-甲基-γ-乙酰氧基亮氨酸，E是缬氨酸，F，I和J都是N-甲基亮氨酸，G是丙氨酸，H是(D)-丙氨酸或(D)-丝氨酸，K是N-甲基缬氨酸。
本发明的一个重要组成要素是通式III所示氨基酸C的R基团所代表的不同基团。通式III中的R基团实例为直链或支链的C1-C6烷基，链烯基或炔基，其中这些基团还可进一步被羟基，烷氧基，酰氧基，C1-C4烷基氨基，或C1-C4二烷基氨基取代。具体例如甲基，乙基，丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基，戊基，异戊基，新戊基，叔戊基，己基，环丙甲基，烯丙基，丁烯基，戊烯基，异戊烯基，炔丙基和丁炔基。R基团中的烷氧基和酰氧基取代基可具体选自甲氧基，乙氧基，丙氧基，β-甲氧基乙氧基，还有乙酰氧基或新戊酰氧基。R基团中的C1-C4烷基氨基和C1-C4二烷基氨基取代基可具体选自甲基氨基，二甲基氨基，乙基氨基，二乙基氨基，丙基氨基，异丙基氨基，二丙基氨基，二异丙基氨基和叔丁基氨基。R的R2基团可以代表甲基，乙基，丙基，异丙基，正丁基，异丁基或叔丁基。另外，R还可以是卤素和氰基。R3和X-R3基团是直链或支链的C1-C4烷基，链烯基，或炔基，并且当X是S时，也可是芳香基和杂芳基。具体的芳香基例如苯基，1-萘基和2-萘基，杂芳基的例子有2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，2-嘧啶基，4-嘧啶基，吡嗪基和苯并噻唑-2-基。
优选的化合物是，A的R1基团为丙烯基，B是α-氨基丁酸，D是N-甲基-γ-羟基亮氨酸，E是缬氨酸，F，I和J各自为N-甲基亮氨酸，G是丙氨酸，H是(D)-丙氨酸和K是N-甲基缬氨酸。
在此结构式中，通式III中的R基团是甲基，乙基，丙基，烯丙基，炔丙基，羟甲基，羟乙基，羟苄基，氨基甲基，甲氨基甲基，二甲氨基甲基，乙氨基甲基，二乙氨基甲基，丙氨基甲基，异丙氨基甲基，二丙氨基甲基，二异丙氨基甲基，叔丁基氨基甲基，氟代甲基，甲氧基甲基，乙氧基甲基，甲氧基羰基，乙氧基羰基，丙氧基羰基，异丁氧基羰基，甲氨基羰基，乙氨基羰基，丙氨基羰基，异丙氨基羰基，苯基氨基羰基，甲氧基羰甲基，乙氧基羰甲基，丙氧基羰甲基，叔丁氧基羰甲基，甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，正丁氧基，异丁氧基，叔丁氧基，羟乙氧基，甲硫基，乙硫基，羟基乙硫基，丙硫基，异丙硫基，正丁基硫基，异丁基硫基，叔丁基硫基，苯硫基，2-吡啶基硫基，苯并噻唑-2-基硫基，氰基或氟。
新化合物的制备首先是将通式I所示环肽与适当的碱反应，制备成聚阴离子物质，其中通式I中的D是甲基亮氨酸，然后将此聚阴离子与适宜的亲电性试剂反应，适当时，引人新的取代基团以进一步转化，使氨基酸C产生预期的取代反应。产物经微生物转化作用后被羟基化。另一种可选择的制备新化合物的方法包括，如上所述，首先是由通式I所示环肽与适当的碱反应，制备成聚阴离子物质，其中通式I中的D是N-甲基-γ-羟基-亮氨酸，然后将此聚阴离子物质与适宜的亲电性试剂反应，适当时，引人新的基团以达到进一步转化，得到预期的取代氨基酸C。聚阴离子物质是通过适当的起始反应物溶液与合适的碱进行反应后得到的，该反应溶液所用的溶剂为无水溶剂，例如四氢呋喃，反应在低温下进行，优选的反应温度为低于零下40度，所用碱是过量的，优选的碱是溶于无水四氢呋喃中的二异丙氨化锂；然后，所得聚阴离子物质与适当的亲电性试剂结合。此方法基本上已经被Seebach等人所公开(D.Seebach等人，Helv.Chim.Acta，第76卷，1564-1590页，1993)。另外，适宜的碱还包括碱金属氨化物，例如二乙基氨化锂，或六甲基二硅杂叠氮化物；还有碱金属醇盐，例如甲醇钾，叔丁醇钾，叔戊醇钾，和甲醇钠。适用亲电性试剂具体有烷基卤，例如，碘甲烷，碘乙烷，烯丙基溴和苄基溴；烷氧甲基卤，例如，甲氧基甲基氯，甲氧基乙氧基甲基氯，和苄氧基甲基氯；或羰基化合物，例如醛或某些酮，具体的例子有甲醛，乙醛，苯甲醛，丙酮，或环酮，例如环丙酮和它的高级同系物；以及碳酸的反应衍生物，例如异氰酸盐，和有机羧酸活性衍生物，例如酯，具体的例子有甲酸甲酯，草酸二乙酯，苯甲酸乙酯和烟酸乙酯。其它适用的亲电性试剂是卤素，以及正性卤素的其它种类，例如N-氯代琥珀酰亚胺，N-溴代琥珀酰亚胺，N-氟代-N-新戊基-p-甲苯磺酰胺，全氯氧代氟化物；N-卤化氰，例如氰化氯；还有二硫化物和它们的锍盐，例如二甲基硫，二甲基硫甲基碘化锍，二苯基二硫化物，二吡啶基二硫化物，和2，2’-苯并噻唑基二硫化物。与这些亲电性试剂进行反应，可形成一个新的手性中心。根据不同的反应条件，可得到两种非对映异构体的混合物，而该混合物中的两种非对映体中的一种是优势产物。这些新的非对映体彼此不同，这是由通式I所示氨基酸C的差异造成的，该非对映体的构型分别是(D)构型和(L)构型。本发明中优选的非对映体是通式I所示的(D)构型氨基酸C的非对映异构体。导致优选生成(D)构型非对映体或(L)构型非对映体的反应因素，及所用碱对反应的影响，以及亲电性试剂的选择范围，都由Seebach等人在环孢菌素A为起始反应物的制备试验中做了细致的研究，并在文献中有详细的报导(D.Seebach等人，Helv.Chim.Acta，第76卷，1564-1590页，1993)，其它的作者对这些试验报导也做了鉴定性地评价(S.David，Chemtracts Organic Chemitry，第6卷，303-306页，1993)。本发明也对反应条件进行了描述，该反应条件的主要作用是非对映体的形成，那些非对映体在C位氨基酸上可形成(D)构型的新手性中心。本发明还证明了可采用4-(γ-羟基)-N-甲基-亮氨酸环孢菌素代替环孢菌素A作为反应起始物的可行性。将4-(γ-羟基)-N-甲基-亮氨酸环孢菌素作为反应起始物并应用于这种转化是新的应用，也是本发明发明内容的一部分。
通常，在这类情况中得到的优势产物还是(D)构型氨基酸。
可利用多种放线菌属的微生物来完成对D氨基酸γ位的微生物羟基化作用，例如采用Eur.J.Immunol.1987，17，1359.中描述的Sebekia benibana。这种转化的重要性主要是在于，它只经过一步就几乎消除了环孢菌素全部的免疫抑制活性。
在具有低毒性的同时，通式I所示的化合物具有很高的生物活性，尤其是它们表现出对人体免疫缺损病毒(HIV)的抑制作用，因此可作为抗HIV感染的药物。经适当的体内试验并选择0.05-50mg/l的浓度即可观察到此抑制作用。通式I所示的化合物，适当时，和它们的盐可单独作为药物，或与无机或有机的药用惰性辅料结合以制备成适用的药物。实施例13-N-甲基-(D)-丝氨酸-4-(γ-羟基)-N-甲基亮氨酸环孢菌素的制备Eur.J.Immunol.，1987，17卷，1359页中描述了微生物转化作用，利用Sebdkia benihana将环孢菌素A中N-亮氨酸γ位进行羟基化，该生物转化可将3-N-甲基-(D)-丝氨酸环孢菌素制备得到3-N-甲基-(D)-丝氨酸-4-γ-羟基-N-甲基亮氨酸环孢菌素。所用的菌株被描述为NRLL 11111，它属于游动放线菌科。
起始培养NRLL 11111的琼脂培养物在无菌培养介质和27℃条件下培养10天，该灭菌介质的PH值调至7，并且它是由20g葡萄糖，10g酵母提取物(Gistex)，10g胨，40g淀粉，2g碳酸钙，40g琼脂，和1升水组成。
预培养预培养介质由35g葡萄糖，50g淀粉，12.5g胨，50g麦精，22.5g酵母提取物，和5g碳酸钙，和5升水组成。另外，该介质含有5ml的由示踪组分组成的溶液[1ml浓硫酸，5g硫酸亚铁(II)七水合物，50mgKI，100mg硼酸，4g硫酸锌七水合物，2g氯化镁(II)四水合物，200g硫酸铜五水合物和2g氯化钴六水合物，这些组分溶于1l蒸馏水中]。起始培养物的芽孢和菌丝体悬浮在10ml的0.9％盐溶液中，该悬浮液加入到100ml的灭菌预培养介质中。此培养物在27℃下振摇四天，振摇是在转速为200转/分钟的轨道摇动器上进行。四天后，将预培养物用与培养介质稀释(1∶10)并再振摇三天。
主培养将用于主培养的发酵介质(1升蒸馏水，1ml如上所述的示踪组分溶液，200mg钼酸铵，255mg磷酸氢二钾，120mg磷酸二氢钾，100mg硫酸镁七水合物，50mg氯化钙六水合物，12.5g大豆粉，2.5g酵母提取液，10g淀粉，10g糊精和10g西瑞糖)调至PH等于7.3，并在120℃下灭菌20分钟。将上述得到的预培养物10ml加入到发酵介质中，混合物在27℃下振摇24小时，振摇由轨道摇动器完成，然后将100mg 3-N-甲基-(D)-丝氨酸-环孢菌素加入其中，并继续振摇3天。3-N-甲基-(D)-丝氨酸-4-(γ-羟基)-N-甲基亮氨酸环孢菌素的分离经过滤将菌丝体从主培养物中分离出来，滤液用二氯甲烷提取5次。合并后的提取液用旋转蒸发器浓缩，残留物用250g硅胶(Merck硅胶，颗粒大小为0.4-0.63目)进行色谱分离。环孢菌素部分再用70g硅胶进行色谱分离，得到15mg 3-N-甲基-(D)-丝氨酸-4-(γ-羟基)-N-甲基亮氨酸环孢菌素的无定形粉末。该物质的旋光度是[α]D＝-166°(c＝0.5，二氯甲烷)。该产物可用甲醇结晶，所得结晶产物的熔点是150-152℃，在其溶于氘化的DMSO的1H NMR谱中，N-甲基-γ-羟基-亮氨酸上的两个甲基在1.05ppm处呈单峰。实施例23-N-甲基-(D)丝氨酸环孢菌素的制备此物质的制备方法已由D.Seebach等人在Helv.Chimica Acta的第76卷，第1564-1590页，1993的文献中公开。该物质可按下列方式得到2a)3-α-甲氧基羰基环孢菌素在0℃和惰性气体(氩气)保护下，将30ml的1.6mol正丁基锂的己烷溶液滴加到8.7ml二异丙胺的800mlTHF中的溶液。0℃下保持20分钟，随后将该溶液冷却至-78℃，把预先冷却到-78℃的10.0g环孢菌素A在150ml无水四氢呋喃中的溶液分次加入到上述该溶液中。所得混合物在-78℃下搅拌1小时，然后通入干燥的CO2气流。6.4ml的氯甲酸甲酯滴加到混合物中，并且在-78℃继续搅拌2小时。然后，加入1.1ml的二异丙胺，反应温度可升至20℃，混合物在此温度下搅拌14小时；再把混合物加热回流45分钟。随后，混合物冷却到20℃，加入100ml的10％磷酸，水相用600ml的乙酸乙酯萃取。水相再继续用乙酸乙酯抽提数次。合并有机提取液，用硫酸镁干燥，并真空至干。所得油状物用500g硅胶(0.02-0.05目)进行色谱分离，流动相是乙酸乙酯与环己烷的4∶1的混合物。含有产物的馏分合并在一起，并将溶剂真空蒸除。得到1.9g的3-α-甲氧基羰基环孢菌素的无色粉末，该物质的熔点是138℃。2b)3-N-甲基-D-丝氨酸环孢菌素在0℃下，将2.4ml的2.0mol硼氢化锂在四氢呋喃中的溶液滴加到1.0g 3-α-甲氧基羰基环孢菌素在30ml无水四氢呋喃中的溶液。该混合物在0℃下搅拌22小时。随后加入2ml蒸馏水，再滴加10％的盐酸，然后再加入10ml的蒸馏水。此混合物与25ml乙酸乙酯共同振摇，随后静置分层，其中的水相层继续用乙酸乙酯萃取3次，每次所用乙酸乙酯的量是50ml。合并有机提取液并用硫酸镁干燥，然后在真空下浓缩。残留物用300g硅胶进行色谱分离，流动相是乙酸乙酯。将含有产物的馏分合并在一起，并在真空下浓缩，得到401mg的3-N-甲基-(D)丝氨酸-环孢菌素的无色不定形粉末，该产物的熔点是128-130℃。实施例3从4-(γ-羟基)-N-甲基亮氨酸环孢菌素制备3-N-甲基-(D)-丝氨酸-4-(γ-羟基)-N-甲基亮氨酸环孢菌素在0℃和惰性气体(氩气)保护下，将5ml的1.6mol正丁基锂的己烷溶液滴加到1.12ml二异丙胺于50mlTHF中的溶液。0℃下保持20分钟，随后将该溶液冷却至-78℃，把预先冷却到-78℃的1.2g4-(γ-羟基)-N-甲基-亮氨酸环孢菌素在50ml无水四氢呋喃中的溶液分次加入到上述该溶液中。所得混合物在-78℃下搅拌1小时，再利用氩气的微气流将单体甲醛通入到反应混合物中。混合物在-78℃继续搅拌2小时。然后，反应温度可升至20℃，加入10ml的10％磷酸，水相用100ml的乙酸乙酯萃取。水相再继续用乙酸乙酯抽提数次。合并有机提取液，用硫酸镁干燥，并真空至干。所得油状物用100g硅胶(0.02-0.05目)进行色谱分离，流动相是乙酸乙酯。将含有产物的馏分合并在一起，并将溶剂真空蒸除。该方法得到5mg的3-N-甲基-(D)-丝氨酸-4-(γ-羟基)-N-甲基亮氨酸环孢菌素。根据其物理化学指标，用本方法制备的该物质与实施例1中描述的物质是相同的。抗病毒活性试验在本试验中采用由Myoshi等人公开的(Nature 294，770-771，1981)的MT4的T细胞系。在37℃下，细胞对HIV-1(菌株IIIB)进行2小时的吸附。然后将种菌移去，感染细胞转移到组织培养皿中，这些培养皿中含有不同浓度待测化合物。在菌系中，该病毒的种菌被选定识别，随后导致细胞上清液中病毒p24抗原的浓度呈指数倍增长，这些变化是自感染后第4天开始的。在感染后第3或4天，利用ELISA法(酶联免疫吸附测定法)来分析细胞上清液中的p24抗原。经感染过的并用待测物质处理过的细胞上清液中p24的浓度，与感染过但未经处理的对照细胞上清液中的p24浓度进行比较，可测定得到IC50值。在本试验中，3-N-甲基-(D)-丝氨酸-4-(γ-羟基)-N-甲基亮氨酸环孢菌素的IC50是0.1mg/l，与此相比，环孢菌素A的IC50值是0.5mg/l。
权利要求
1.一种如通式I所示的新环肽物质，
其中A-K表示下列的氨基酸片断A是通式II所示取代的高苏氨酸，R1-CH2CH(CH3)-CH(OH)-CH(NHCH3)-COOH II其中R1是正丙基或丙烯基，双键优选为反式构型，B是α-氨基丁酸，缬氨酸，正缬氨酸或苏氨酸，C是由通式III所示的(D)-氨基酸，CH3NH-CH(R)-COOHIII其中R是C2-C6烷基，链烯基，炔基，这些基团可以是直链或支链的，并可被羟基，氨基，C1-C4烷基氨基，C1-C4二烷基氨基，烷氧基或酰氧基再进一步取代，COOR2，CONHR2，其中R2可是直链或支链的C1-C4烷基，X-R3，其中X是O或S，并且R3是直链或支链的C1-C4烷基，链烯基，炔基，并且当X为S时，R3也可是芳香基或杂芳基，卤素，优选氟，氰基，或CHR4R5，其中R4是氢，甲基，乙基或苯基，并且R5是氢，羟基或卤素，优选氟，还有氨基，C1-C4烷基氨基，C1-C4二烷基氨基，酰氧基，优选乙酰氧基，以及，叔-丁氧基羰基-氨基乙氧基-乙氧基-乙酰氧基，或烷氧基羰基，优选丁氧基羰基，D是N-甲基-γ-羟基亮氨酸或N-甲基-γ-乙酰氧基亮氨酸，E是缬氨酸，F，I和J都是N-甲基亮氨酸，G是丙氨酸，H是(D)-丙氨酸或(D)-丝氨酸，K是N-甲基缬氨酸。
2.根据权利要求1所述的通式I中的环肽，其中A的R1基团是丙烯基，B是α-氨基丁酸，D是N-甲基-α-羟基亮氨酸，E是缬氨酸，F，I和J分别是N-甲基亮氨酸，G是丙氨酸，H是(D)-丙氨酸，K是N-甲基缬氨酸。
3.根据权利要求2所述的通式I的环肽，其中通式III中所示的R基团为甲基，乙基，丙基，烯丙基，炔丙基，羟甲基，羟乙基，羟苄基，氨基甲基，甲氨基甲基，二甲氨基甲基，乙氨基甲基，二乙氨基甲基，丙氨基甲基，异丙氨基甲基，二丙氨基甲基，二异丙氨基甲基，叔丁基氨基甲基，氟代甲基，甲氧基甲基，乙氧基甲基，甲氧基羰基，乙氧基羰基，丙氧基羰基，异丁氧基羰基，甲氨基羰基，乙氨基羰基，丙氨基羰基，异丙氨基羰基，苯基氨基羰基，甲氧基羰甲基，乙氧基羰甲基，丙氧基羰甲基，叔丁氧基羰甲基，甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，正丁氧基，异丁氧基，叔丁氧基，羟乙氧基，甲硫基，乙硫基，羟基乙硫基，丙硫基，异丙硫基，正丁基硫基，异丁基硫基，叔丁基硫基，苯基硫基，2-吡啶基硫基，苯并噻唑-2-基硫基。
4. 3-N-甲基-(D)-丝氨酸-4-(α-羟基)-N-甲基-亮氨酸环孢菌素。
5.一种通式I所示化合物的制备方法，通式中的C由上述内容表示，D是N-甲基-γ-羟基亮氨酸，该制备方法包括将通式I所示的环肽利用微生物进行羟基化，该通式I中的D代表N-甲基亮氨酸。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中的微生物是Sebekia Benihana。
7.一种通式I所示化合物的制备方法，该通式I中的D代表N-甲基-γ-羟基亮氨酸，该方法包括利用合适的碱，将通式I所示环肽转化为聚阴离子，其中通式I中的C是肌氨酸，D为N-甲基-γ--羟基-亮氨酸，再将该聚阴离子与适当的亲电性试剂反应，转化成为权利要求1中所述的产物。
8.一种药物组合物，其中包括一种或多种如权利要求1中所述的环肽物质和药用可接受性稀释剂或赋形剂。
9.权利要求1所述化合物用于制备成治疗或防止由人体免疫缺损病毒(HIV)引起的感染的药物的应用。
全文摘要
本发明涉及通式Ⅰ所示的新环肽物质,其中A－K表示下列的氨基酸片断:A是由通式Ⅱ所示取代的高苏氨酸,R
文档编号C07K7/64GK1192750SQ96196264
公开日1998年9月9日 申请日期1996年7月17日 优先权日1995年7月17日
发明者J·M·路施格 申请人:碳化学公司