大分子印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球及其制备方法

专利名称：大分子印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球及其制备方法
大分子印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球及其制备方法
技术领^
本发明属于材料科学技术领域，特别涉及一种大分子印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化 聚合物微球及其制备方法。
背景技术：
由于蛋白质等一些大分子的一些特点，比如体积庞大、受环境影响容易变性、化学结构 复杂、识别机理也不清楚等，对大分子蛋白质印迹的研究远不如小分子的印迹研究系统和深 入。蛋白质一般为非刚性的生物大分子，其化学结构也非常复杂，依靠几个结合位点很难在 印迹聚合物中产生确定的识别点。传统上制备的分子印迹聚合物为高度交联且坚硬的材料， 这类材料不具有足够的柔顺度和内部孔径从而使得庞大的蛋白质模板方便地进出聚合物。
磷酸钙盐与蛋白质之间存在着相互作用，近年来人们在磷酸钙盐与蛋白质分子相互作用 这一领域进行了卓有成效的研究。蛋白质表面的酸性氨基酸基团和碱性氨基酸残基通过离子 键与P-TCP晶体上的钙离子结合，蛋白质的碱性氨基酸基团通过氢键和静电吸引作用与P043— 上的氧结合。聚丙烯酸钠是一类聚阴离子的高分子电介质，遇到钙离子形成不溶性盐，引起 分子交联而凝胶化沉淀。聚丙烯酸及其衍生物己经被用于各类蛋白质的印迹中。Xingshou Pang， Guoxiang Cheng， Shulai Lu, Synthesis of polyacrylamide gel beads with electrostatic functional groups for the molecular imprinting of bovine serum albumin, Analytical and Bioanalytical Chemistry 2006 (384) (1): 225-330海藻酸盐具有良好的亲水性，在多价阳离子 <^2+的存在下，能够迅速发生凝胶化反应，其温和的凝胶条件有利于保持生物蛋白质的活性， 海藻酸盐凝胶的软湿特性有利于生物蛋白质保持其构象、有利于模板分子的洗脱和识别过程 中对模板分子的再重结合，海藻酸盐凝胶对于环境参数诸如离子强度、pH值等的可响应性也 给蛋白质印迹海藻酸盐凝胶的设计参数提供了较宽的选择余地。直接采用带有功能基团的天 然聚合物海藻酸钠代替传统分子印迹体系中的功能单体，简化了印迹聚合物的合成过程。成 国祥，张凤菊，英晓光，双模板法羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球及制备方法，中国发明专 利，申请号200510015832.1单纯的海藻酸盐微球易溶胀，机械强度低，质脆，羟基磷灰石 /海藻酸盐复合微球用来印迹蛋白质的效果较差，因为羟基磷灰石与海藻酸盐之间的作用太 弱。成国祥，刘超，赵孔银，张凤菊.羟基磷灰石/海藻酸盐复合微球的制备方法.中国 发明专利，申请号200410019979.3
材料的杂化制备技术系是采用同时能和多种物质反应的某种物质参加制备，而得到一种 具有多种成分并且至少两种成分之间存在化学结合作用的新材料。有机/无机杂化材料是复合 材料的一个新领域，它综合了有机物和无机物的众多优良性质，如有机物密度较低、粘弹性
好、韧性高、可加工性好等和无机物硬度高、弹性模量及强度高、较好的透光性能、高折射 率等。邱泽浩，叶巧明，溶胶一凝胶法制备有机/无机杂化材料工艺及其应用，广州化学， 2006, 31(1): 40 45在我们以前的研究中制备了大分子印迹磷酸钙/海藻酸钙杂化聚合物微球 和聚丙烯酸钙/海藻酸钙杂化聚合物微球并申请了专利。成国祥，赵孔银，黄建军，张立广.大 分子印迹磷酸钙/海藻酸钙杂化聚合物微球及其制备方法.中国发明专利，申请号 200710057639.3成国祥，赵孔银，张立广.大分子印迹聚丙烯申钙/海藻酸钙杂化聚合物微 球及其制备方法.中国发明专利，申请号200710057640.6但是它们各自有自己的一些缺点， 例如磷酸钙/海藻酸钙杂化聚合物微球强度大，但是韧性差，而且在较高的盐浓度溶液和酸性 溶液中微球稳定性差。聚丙烯酸钙/海藻酸钙杂化聚合物微球的强度比磷酸钙/海藻酸钙杂化聚 合物微球小，但是其韧性好，而且聚丙烯酸钙/海藻酸钙杂化聚合物微球的耐酸碱性较好。将 这两种各有优缺点的杂化聚合物材料结合起来可能具有更好的效果。本发明将磷酸盐、聚丙 烯酸盐和海藻酸盐用钙离子交联制备了大分子印迹多杂化的微球，目前还没有见到相关报道。

发明内容
本发明的目的是提供一种杂化方法制备磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球。相比 纯海藻酸钙微球，杂化聚合物微球的强度和重结合性能有了较大提高。
本发明的另一目的是提供一种以大分子蛋白质为模板制备的包埋分子印迹的方法。与非 印迹微球相比，包埋印迹微球对模板蛋白质的重结合量有较大提高。
本发明的另一目的是提供一种以大分子蛋白质为模板制备的表面分子印迹的方法。与包 埋印迹微球相比，表面印迹微球对模板蛋白质的重结合量有较大提高。
本发明提供了大分子蛋白质印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球的制备及印
迹方法。蛋白质印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球的组份和重量百分含量如下
海藻酸钠 20% 40% 磷酸氢二铵 1% 10% 聚丙烯酸钠 0.5% 5% 氯化钙 50% 65% 蛋白质 0.1 10%。 所述的蛋白质为牛血清白蛋白、卵白蛋白或溶菌酶等。
所述的杂化聚合物微球是蛋白质表面印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球。 所述的杂化聚合物微球是蛋白质包埋印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球。 本发明的蛋白质表面印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球的制备方法步骤如
下
a) 配制质量百分比浓度为0.5% 5%的聚丙烯酸钠、2% 3%的海藻酸钠和0.25% 2 %的磷酸氢二铵混合溶液A;
b) 将溶液A在搅拌的条件下加入到2 4倍溶液A体积，密度为0.75 0.95 g /ml的有 机相中，再搅拌10 15min使粘稠的溶液A分散成微球；
c)在搅拌下向上述b)混合体系中加入质量百分比浓度0.1 10%的蛋白质和质量百分 比浓度浓度3% 5%的氯化钙混合水溶液8进行凝胶化反应，继续搅拌45 50min，得 到微球；洗脱掉蛋白质模板，得到蛋白质大分子表面印迹的磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂 化聚合物微球。
本发明的蛋白质包埋印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球的制备方法步骤如
下
a)向质量百分比浓度0.1 10%的蛋白质溶液中加入聚丙烯酸钠、海藻酸钠和磷酸氢二 铵固体，得到质量百分比浓度为0.5% 5%的聚丙烯酸钠、2% 3%的海藻酸钠和0.25 % 2 %的磷酸氢二铵混合溶液Al;
b )量取溶液Al体积2 4倍，密度为0.75 0.95 g/ml的有机相，在搅拌下将溶液Al 加入到有机相中，搅拌10 15min使粘稠的溶液Al分散成微球；
c )在搅拌下向上述b)混合体系中加入质量百分比浓度浓度3% 5%的氯化钙水溶液 进行凝胶化反应，继续搅拌45 50min，得到微球；洗脱掉蛋白质模板，得到蛋白质大分 子包埋印迹的磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球。
本发明的大分子印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球的制备方法中，所述的有 机相是通常采用的有机相，要求有机物的密度为0.75 0.95g/ml,其中溶解质量百分比为 0.05 4%的表面活性剂或分散剂。但是为了环保等的需要，也可以采用如下的有机相-
有机相l:三氯甲垸与正己烷按照3: 1 1: l的体积比混合，表面活性剂山梨醇酐单油
酸酯质量百分比为2 4%。
有机相2:醋酸丁酯与蓖麻油按照l: 3 1: l的体积比混合，分散剂乙基纤维素质量百
分比为0.05 0.1%。
本发明所制备的磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球，经蛋白质重结合测试结果表 明，印迹微球的重结合量是非印迹微球，即不加蛋白质制备的微球重结合量的3 4.4倍。 电导率滴定和红外光谱测试表明，磷酸氢二铵、聚丙烯酸钠和海藻酸钠可以与CaCl2共同作 用产生新的多杂化组分，磷酸盐不仅起到增强微球的作用，还利于形成蛋白质的印迹位点以 及起到致孔的作用，聚丙烯酸盐不但起到功能单体的作用还增加了微球强度"本发明采用钙 离子交联法制备的蛋白质印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球具有制备方法简单 易行、反应过程易于控制等优点，解决了纯海藻酸钙的机械强度和印迹效率低，性能不稳定 等不足，具有广泛的应用前景。


图1:牛血清白蛋白表面印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球照片；
图2:表面印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球对牛血清白蛋白的重结合曲线；
图3:牛血清白蛋白包埋印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球照片；
图4:包埋印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球对牛血清白蛋白的重结合曲线。
图5:卵白蛋白表面印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球对卵白蛋白的重结合曲线。
图6:溶菌酶包埋印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球对溶菌酶的重结合曲线。
具体实施例方式
实施例1.制备牛血清白蛋白表面印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球，包括以下 步骤 ，
1) 向20ml去离子水中加入0.15g聚丙烯酸钠、0.5128g的海藻酸钠和0.15g磷酸氢 二铵固体，搅拌使其充分溶解，得到溶液A;
2) 量取有机相甲苯40ml，倒入烧杯内，向其中加入0.8g山梨醇酐单油酸酯，搅拌 5min使其充分溶解;在搅拌下将溶液A缓慢倒入到盛有机相的烧杯中，搅拌10min 使粘稠的溶液A分散成微球；
3) 在搅拌下向上述混合体系中加入质量百分比浓度0.1%的牛血清白蛋白和质量百 分比浓度浓度为5X的氯化钙混合水溶液B20ml进行凝胶化反应，继续搅拌 45min，得到微球；采用专利200510015832.1的方法洗脱掉蛋白质模板，得到牛 血清白蛋白表面印迹的磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球；
表面印迹的磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球的光学显微镜照片见图1，对牛血 清白蛋白的重结合结果见图2。从图1中可以看到微球形态较好，微球表面粗糙，得到的杂 化聚合物微球的粒径大小为20 150pm。从图2中看出，表面印迹微球对牛血清白蛋白的重 结合容量明显大于非印迹微球对牛血清白蛋白的重结合容量，平衡时其重结合容量为非印迹 微球重结合容量的3倍。注重结合容量即洗脱微球上的蛋白质后微球对该蛋白质的吸附量。 实施例2.制备牛血清白蛋白包埋印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球，包括以下 步骤
1) 向20ml去离子水溶解的质量百分比浓度0.1%的牛血清白蛋白溶液中加入0.15g 聚丙烯酸钠、0.5128g海藻酸钠和0.15g磷酸氢二铵固体，搅拌使其充分溶解，得 到溶液A1;
2) 量取20ml三氯甲烷和20ml正己垸组成的有机相40ml，倒入烧杯内，向其中加入 0.8g山梨醇酐单油酸酯，搅拌5min使其充分溶解；在搅拌下将溶液Al缓慢倒入 到盛有机相的烧杯中，搅拌15min使粘稠的溶液Al分散成微球；
3) 在搅拌下向上述混合体系中加入质量百分比浓度为5X的氯化钙混合水溶液B1 20ml进行凝胶化反应，继续搅拌45min，得到微球；采用专利200510015832.1 的方法洗脱掉蛋白质模板，得到牛血清白蛋白包埋印迹的磷酸/聚丙烯酸/海藻酸 钙多杂化聚合物微球；
包埋印迹的磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球的光学显微镜照片见图3，对牛血 清白蛋白的重结合结果见图4。从图3中可以看到微球形态较好，微球表面粗糙，得到的杂 化聚合物微球的粒径大小为20 120nm。从图4中看出，包埋印迹微球对牛血清白蛋白的重 结合容量大于非印迹微球对牛血清白蛋白的重结合容量，平衡时其重结合容量为非印迹微球
重结合容量的4.4倍。
实施例3. 制备卵白蛋白表面印迹磷酸/海藻酸钙杂化聚合物微球，包括以下歩骤
1)向20ml去离子水中加入0.15g聚丙烯酸钠、0.6186g的海藻酸钠和0.15g磷酸氢 二铵固体，搅拌使其充分溶解，得到溶液A; ' 2)量取15ml醋酸丁酯和25ml蓖麻油组成的有机相40ml，倒入烧杯内，向其中加入 0.04g乙基纤维素，搅拌5min使其充分溶解；在搅拌下将溶液A缓慢倒入到盛有 机相的烧杯中，搅拌10 15min使粘稠的溶液A分散成微球； 3)在搅拌下向上述混合体系中加入质量百分比浓度为10%的卵白蛋白和质量百分 比浓度浓度为5X的氯化钙混合水溶液B20ml进行凝胶化反应，继续搅拌50min， 得到微球；采用专利200510015832.1的方法洗脱掉蛋白质模板，得到卵白蛋白表 面印迹的磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球； 卵白蛋白表面印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球对卵白蛋白的重结合曲线 见图5。从图5中看出，表面印迹微球对卵白蛋白的重结合容量大于非印迹微球对卵白蛋白 的重结合容量，平衡时其重结合容量为非印迹微球重结合容量的3. 55倍。 实施例4.制备溶菌酶包埋印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球，包括以下歩骤
1) 向20ml去离子水溶解的质量百分比浓度为0.1X的溶菌酶溶液中加入0.15g聚丙 烯酸钠、0.5128g海藻酸钠和0.15g磷酸氢二铵固体，搅拌使其充分溶解，得到溶 液Al;
2) 量取20ml醋酸丁酯和20ml蓖麻油组成的有机相40ml，倒入烧杯内，向其中加入 0.02g乙基纤维素，搅拌5min使其充分溶解；在搅拌下将溶液Al缓慢倒入到盛 有机相的烧杯中，搅拌10 15min使粘稠的溶液Al分散成微球；
3) 在搅拌下向上述混合体系中加入质量百分比浓度为5X的氯化钙混合水溶液B1 20ml进行凝胶化反应，继续搅拌50min，得到微球；采用专利200510015832.1 的方法洗脱掉蛋白质模板，得到溶菌酶包埋印迹的磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂 化聚合物微球；
溶菌酶包埋印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球对溶菌酶的重结合曲线见图 6。从图6中看出，包埋印迹微球对溶菌酶的重结合容量大于非印迹微球对溶菌酶的重结合容 量，平衡时印迹微球为非印迹微球重结合容量的3.53倍。
本发明公开和提出的蛋白质大分子印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球及其 制备方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变原料、工艺参数、结构设计等环 节实现。本发明的产品和方法已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱 离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和产品进行改动或适当变更与组合，来实现 本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易 见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
权利要求
1.一种大分子印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球，其特征是组分和重量百分含量如下海藻酸钠 20％～40％磷酸氢二铵1％～10％聚丙烯酸钠0.5％～5％氯化钙50％～65％蛋白质0.1～10％。
2. 如权利要求1所述的一种大分子印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球及其制备 方法，其特征是所述的蛋白质为牛血清白蛋白、卵白蛋白或溶菌酶。
3. 如权利要求1或2所述的大分子印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球，其特征 是所述的杂化聚合物微球是蛋白质表面印磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球。
4. 如权利要求1或2所述的大分子印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球，其特征 是所述的杂化聚合物微球是蛋白质包埋印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球。
5. 如权利要求3所述的大分子印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球的制备方法， 其特征是所述的蛋白质表面印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球的制备方法步 骤如下a) 配制质量百分比浓度为0.5% 5%的聚丙烯酸钠、2% 3%的海藻酸钠和0.25% 2 %的磷酸氢二铵混合溶液A;b) 将溶液A在搅拌的条件下加入到2 4倍溶液A体积，密度为0.75 0.95 g /ml的有 机相中，再搅拌10 15min使粘稠的溶液A分散成微球；c) 在搅拌下向上述b)混合体系中加入质量百分比浓度0.1 10%的蛋白质和质量百分 比浓度浓度3% 5%的氯化钙混合水溶液8进行凝胶化反应，继续搅拌45 50min，得 到微球；洗脱掉蛋白质模板，得到蛋白质大分子表面印迹的磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂 化聚合物微球。
6. 如权利要求4所述的大分子印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球的制备方法， 其特'征是所述的蛋白质包埋印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球的制备方法步 骤如卞a)向质量百分比浓度0.1 10%的蛋白质溶液中加入聚丙烯酸钠、海藻酸钠和磷酸氢二 铵固体，得到质量百分比浓度为0.5% 5%的聚丙烯酸钠、2% 3%的海藻酸钠和0.25 % 2%的磷酸氢二铵混合溶液Al;b )量取溶液Al体积2 4倍，密度为0.75 0.95 g/ml的有机相，在搅拌下将溶液Al 加入到有机相中，搅拌10 15min使粘稠的溶液Al分散成微球；c )在搅拌下向上述b)混合体系中加入质量百分比浓度浓度3% 5%的氯化钙水溶液 进行凝胶化反应，继续搅拌45 50min，得到微球；洗脱掉蛋白质模板，得到蛋白质大分 子包埋印迹的磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球。
7. 如权利要求5或6所述的大分子印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球的制备方 法，其特征是所述的有机相的密度为0.75 0.95 g/ml，有机相中溶解质量百分比为0.05 4%的表面活性剂或分散剂。
8. 如权利要求7所述的大分子印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球的制备方法， 其特征是所述的有机相是有机相l:三氯甲垸与正己烷按照3: 1 1: 1的体积比混合，表面活性剂山梨醇酐单油酸酯质量百分比为2 4%;或有机相2:醋酸丁酯与蓖麻油按照l: 3 1: l的体积比混合，分散剂乙基纤维素质量百分比为0.05 0.1%。
全文摘要
本发明涉及一种大分子印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球及其制备方法。蛋白质印迹磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球的组份和重量百分含量如下海藻酸钠20％～40％，磷酸氢二铵1％～10％，聚丙烯酸钠0.5％～5％，氯化钙50％～65％，蛋白质0.1～10％。本发明所制备的磷酸/聚丙烯酸/海藻酸钙多杂化聚合物微球，经蛋白质重结合测试结果表明，印迹微球的重结合量是非印迹微球，即不加蛋白质制备的微球重结合量的3倍以上。电导率滴定和红外光谱测试表明，磷酸氢二铵和海藻酸钠可以与CaCl₂共同作用产生新的多杂化组分。本发明制备方法简单易行、反应过程易于控制等优点，解决了纯海藻酸钙的机械强度和印迹效率低，性能不稳定等不足，具有广泛的应用前景。
文档编号C08J9/00GK101186721SQ20071015017
公开日2008年5月28日 申请日期2007年11月14日 优先权日2007年11月14日
发明者张立广, 成国祥, 赵孔银 申请人:天津大学