新的GLP-Ⅰ类似物及其制备方法和用途技术领域本发明涉及药物化学和有机化学领域，尤其涉及多肽类似物，还涉及多肽类似物的制备方法、组合物及其在制药中的用途。
背景技术：
胰高血糖素样肽-1（glucagon-likepeptide-1,GLP-Ⅰ）是一种由小肠-L细胞分泌的多肽激素。GLP-Ⅰ是从含有160个氨基酸的胰高血糖素原（PG）肽链上断裂的30个氨基肽段。GLP-Ⅰ能够在高血糖水平下促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素释放、促进机体胰岛素原基因的表达及延迟胃排空和胃酸分泌，同时发现GLP-Ⅰ能够增加饱腹感（抑制食欲）和降低能量摄取。长期注射GLP-Ⅰ或者exendin-4(人类GLP-Ⅰ的长效类似物)能够增加大鼠β-细胞团的数量。GLP-通过各种独立的作用机制调节血糖水平，在预防和治疗糖尿病中引起广泛关注。胃肠道L-细胞受血糖的调节，分泌GLP-Ⅰ肽，半衰期5min，代谢清除率12-13min。GLP-Ⅰ在DDPIV（dipeptidylpeptidaseIV）作用下降解，即去掉N-端两个氨基酸残基，转化为无活性的GLP-Ⅰ肽。由于GLP-Ⅰ的半减期极短，限制了其临床应用，人们研究得到了一些具有GLP-Ⅰ样生物活性的类似物。如从毒蛇唾液中分离出的exendin-4,与GLP-Ⅰ序列高度同源，生理作用类似，半衰期更长。Exendin-4的N-端剪切产物exendin能够与β细胞表面的GLP-Ⅰ受体（GLP-Ⅰ-R）拮抗，特异性抑制GLP-Ⅰ介导的十二指肠内葡萄糖和口服营养素引起的胰岛素分泌。为了满足临床应用的需要，对GLP-Ⅰ进行分子改造以抵抗酶的降解和提高活性,包括N-末端His自由氨基的甲基化、脱氨基化、羟基化等,以及对第二位Ala的D2型氨基酸置换,已取得了预期的效果，可能为2型糖尿病的治疗开辟新途径。目前进入临床应用的有礼来公司的艾塞那肽（exenatide），该药为首个新型的GLP-Ⅰ激动剂注射剂,用于二甲双胍和磺脲类药物控制血糖不理想的2型糖尿病患者的血糖控制,已在美国上市。丹麦的NovoNordisk公司研发的GLP-Ⅰ类似物利拉鲁肽（Liraglutide）,能抵抗DDPIV的降解,半衰期可达12h,同时与白蛋白连接,具有缓慢释放的特性,一次注射可维持24h的药效。Conjuchem公司的CJC1131，是位置8带非天然的D-丙氨酸的立体异构体GLP-Ⅰ和一个带化学活性基团的连接体，注射后与白蛋白共价结合，半衰期约10-12h。有研究表明，对GLP-Ⅰ的N末端进行修饰后所得产物如N-谷氨酸-GLP-Ⅰ和N-乙酰-GLP-Ⅰ，和GLP-Ⅰ相比，其半衰期长且促胰岛素分泌作用强。但这些药物副作用较强，会导致恶心、呕吐等副作用，且化学合成的步骤繁琐而价格又非常高昂。因此，人们迫切希望开发一种活性高，稳定性好，可方便的利用化学方法合成，且副作用少的可用于治疗糖尿病的GLP-Ⅰ类似物。
技术实现要素：
本发明的目的在于开发一种活性高的用于糖尿病治疗的GLP-Ⅰ类似物，并作为新一代治疗糖尿病的药物。发明人经过大量的实验研究，对GLP-Ⅰ分子进行了改造，结果表明该类GLP-Ⅰ类似物具有更长的半衰期，具有促胰岛素活性，没有临床不良发应发生，可用于糖尿病等疾病的治疗，从而完成了本发明。本发明的第一个方面是提供一种GLP-Ⅰ类似物，该GLP-Ⅰ类似物含以下序列的母体肽:H2N-Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa34-Gly-Arg-Xaa37-COR1；其中，R1=-OH或-NH2；Xaa7=组氨酸,D-组氨酸,脱氨基-组氨酸，2-氨基-组氨酸，β-羟基-组氨酸，高组氨酸，Nα-乙酰基-组氨酸，α-氟甲基-组氨酸，α-甲基-组氨酸，3-吡啶基丙氨酸，2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8=Ala,D-Ala,Gly,Val,Leu,Ile,Lys,Aib,(1-氨基环丙基)羧酸，（1-氨基环丁基）羧酸，（1-氨基环戊基）羧酸，（1-氨基环己基）羧酸，（1-氨基环庚基）羧酸或（1-氨基环辛基）羧酸；Xaa26=Lys；Xaa34=Lys,Glu,Asn或Arg，Xaa37=Gly,Ala,Glu,Pro或Lys，且Xaa34或Xaa37中至少一个为Lys；所述GLP-Ⅰ类似物还含有Q1和Q2基团，Q1及Q2基团同时出现在母体肽中，当Xaa26,Xaa34,Xaa37任意两个或全部为Lys时，以酰胺键的形式连接在Xaa26,Xaa34,Xaa37中的任意二个Lys残基上；Q1基团为亲脂性的取代基连接一个桥接基团W，亲脂性的取代基以其羧基与一个桥接基团的氨基形成一个酰胺键，桥接基团的氨基酸残基的羧基与母体肽的一个Lys的N-末端残基上形成一个酰胺键从而连接到母体肽上；桥接基团W是有1-7个亚甲基不分支链烷烃α,ω-二羧基；所述亲脂性取代基是选自含CH3(CH2)nCO-之组的一个酰基，其中n是4-38的整数；Q2基团为ε(AEEA)n-MPA，n=0-3，其结构式如下：其中各符号的定义如下，His：组氨酸，Ala:丙氨酸，Glu：谷氨酸，Gln：谷氨酰胺，Gly：甘氨酸，Thr：苏氨酸，Phe：苯丙氨酸，Ser：丝氨酸，Asp：天冬氨酸，Val：缬氨酸，Tyr：酪氨酸，Leu:亮氨酸，Ile：异亮氨酸，Lys：赖氨酸，Trp：色氨酸，Arg：精氨酸，Asn：天冬酰胺，Pro：脯氨酸，Aib：2-氨基异丁酸，AEEA：2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸，MPA：3-马来酰亚胺丙酸。在本发明的一个实施方案中，Xaa7优选为组氨酸。在本发明的一个实施方案中，Xaa8优选为D-Ala。在本发明的一个实施方案中，桥接基团W优选为有2个亚甲基的不分支链烷烃α,ω-二羧基；进一步优选为谷氨酸。在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基优选为CH3(CH2)nCO，其中n是4-24的整数；进一步优选为CH3(CH2)14CO-。本发明的GLP-Ⅰ类似物具有促胰岛素活性，稳定性好，半衰期长，没有临床不良发应发生。可用于治疗高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、1型糖尿病、肥胖症、高血压、X综合症、血脂障碍、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其他心血管疾病、中风、炎性肠综合症、消化不良或胃溃疡；或用于减少食物摄取、减少β-细胞凋亡、增强β-细胞功能和β-细胞量和/或恢复β-细胞的葡萄糖敏感性；优选治疗高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、1型糖尿病；更优选治疗2型糖尿病。本发明的另一个方面是提供一种制备本发明的第一个方面的GLP-Ⅰ类似物的方法，包括：合成GLP-Ⅰ类似物的母体肽，所述母体肽上的自由氨基和自由羧基被保护基团保护；脱去Q1基团在母体肽上的偶联位置处的氨基酸残基上的保护基团，将Q1基团偶联到所述母体肽上；脱去Q2基团在母体肽上的偶联位置处的氨基酸残基上的保护基团，将Q2基团偶联到所述母体肽上；脱去母体肽上其它氨基酸残基上的保护基团，制备得到所述的GLP-Ⅰ类似物。对氨基酸残基的自由氨基和自由羧基的保护和脱保护可以使用本领域公知的技术。羧基一般以盐或酯的形式加以保护，常用的盐有钾盐、钠盐、三乙胺盐、三丁胺盐；常用的酯有甲酯（OMe）、乙酯（OEt）、苄酯(oBzl)、叔丁酯(OtBu)。氨基保护基常用的有苄氧甲酰基（CBZ）、叔丁氧甲酰基（Boc）、对甲苯磺酰基（Tosyl）等。在本发明的一个实施方案中，还包括步骤：将制备得到的GLP-Ⅰ类似物使用反相液相色谱纯化。对制备得到的GLP-Ⅰ类似物纯化可以使用如分子筛、吸附层析、亲和层析、疏水层析、电泳、浓缩结晶等本领域公知的技术进一步纯化。在本发明的一个实施方案中，所述将Q1基团偶联到所述母体肽上，包括：桥接基团的氨基酸残基的羧基与母体肽的一个Lys的N-末端残基上形成一个酰胺键从而连接到母体肽上，亲脂性的取代基以其羧基与一个桥接基团的氨基形成一个酰胺键从而偶联到母体肽上。在本发明的一个实施方案中，所述将Q2基团偶联到所述母体肽上，包括：（AEEA）n的羧基与母体肽的一个Lys的N-末端残基上形成一个酰胺键从而连接到母体肽上，MPA以其羧基与（AEEA）n的氨基形成一个酰胺键;所述（AEEA）n中的n=1-3。在本发明的一个实施方案中，所述将Q2基团偶联到所述母体肽上，包括：MPA以其羧基与母体肽的一个Lys的N-末端残基上形成一个酰胺键。本发明的GLP-Ⅰ类似物的制备方法简便，产物收率高，制备成本较大降低。本发明的另一个方面提供一种药物组合物，包括本发明的第一个方面的GLP-Ⅰ类似物或其药学上可接受的盐。在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物包括：0.9mg/ml本发明的第一个方面的GLP-Ⅰ类似物或其药学上可接受的盐，5.0%（w/v）的苯甲酚，5.2%（w/v）的甘露醇，12.5mg/ml的丙二醇，8.0mM的磷酸盐缓冲液。其中pH通常约为5-8，优选pH为6-8，更优选pH为7-7.5。当GLP-Ⅰ类似物用于制备药物时，优选为其药学上可接受的盐。本发明的GLP-Ⅰ类似物可以与任一无机碱，无机及有机酸反应形成盐。通常采用的形成酸加成盐的酸为无机酸，如盐酸，氢溴酸，氢碘酸，硫酸，磷酸等，有机酸如对-甲苯磺酸，甲磺酸，草酸，对溴苯基磺酸，碳酸，琥珀酸，柠檬酸，苯甲酸，乙酸等。优选的酸加成盐是与无机酸如盐酸、氢溴酸，更优选与盐酸形成的盐。碱加成盐包括由无机碱衍生物的盐，如铵或碱金属或稀土金属的氢氧化物，碳酸盐，碳酸氢盐等。这类碱包括氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，碳酸钾等。本发明的药物组合物还可包括其药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如崩解剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。本发明的组合物时，可以使用本领域公知的技术制成各种剂型，如丸剂、片剂、胶囊剂、注射剂等，优选为注射剂。注射剂可以为溶液型、无菌粉末，优选为无菌粉末。制备注射剂时，按照本领域公知的技术将本发明的GLP-Ⅰ类似物或其药学上可接受的盐配制成溶液，所使用的溶剂选自注射用水、注射用大豆油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、苯甲酸苄酯、二甲基乙醇胺。溶液中还可以添加其它物质，如吐温80、甲基纤维素、甘露醇、葡萄糖、氯化钠、苯甲酚、苯酚、三氯叔丁醇等。溶液可以选择醋酸-醋酸钠、枸橼酸-枸橼酸纳、乳酸、磷酸缓冲体系，优选磷酸缓冲体系。配制的溶液在过滤去除固体颗粒、去除热源、灭菌或除菌后制备为注射剂，如注射剂为无菌粉末，则进一步还包括冷冻干燥，这些技术都是本领域公知的。根据医疗上的需要，本发明的注射剂的给药途径可以为静脉注射、脊椎抢注射、肌肉注射、皮下注射和皮内注射，优选为静脉注射、肌肉注射、皮下注射，更优选为静脉注射。应理解，所用GLP-Ⅰ类似物的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师可以判断的范围内。本发明的组合物稳定性好，血管刺激性、肌肉刺激性、过敏性及溶血实验证明没有不良临床反应。本发明的另一个方面是本发明的GLP-Ⅰ类似物在制备治疗或预防疾病的药物中的用途。这些疾病包括高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量降低、1型糖尿病、肥胖症、高血压、X综合症、血脂障碍、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其他心血管疾病、中风、炎性肠综合症、消化不良或胃溃疡。在本发明的一个实施方案中，所述的GLP-Ⅰ类似物用于制备延缓或预防2型糖尿病发展的药物。本发明的再一个方面是本发明的GLP-Ⅰ类似物在制备减少食物摄取、减少β-细胞凋亡、增强β-细胞功能和β-细胞量和/或恢复β-细胞的葡萄糖敏感性的药物中的用途。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。对于本发明实施例中用到的英文缩写，列表给出其中英文名的对照，见表1.0。表1.0英文缩写的中英文名实施例1：化合物1（Compound1）的合成1a)主肽链组装：按照Fmoc/tbu策略在CS336X多肽合成仪（美国CSBio公司）上合成0.25mmol规模的Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Aloc)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(pbf)-Lys(ivDDe)-wangresin。1b)Aloc的脱除与Q1的引入：将1a）中所得的肽树脂加入氯仿中，氩气保护下加入Pd(PPh3)4,NMM，搅拌反应2小时，树脂用DMF,DCM洗涤后，加入Fmoc-Glu-Otbu,DIC,HOBt的NMP混合溶液，偶联2小时，哌啶（piperidine）/DMF脱除Fmoc基团，加入软脂酸（palmiticacid）,DIC,HOBt的NMP偶联液，偶联3小时，得到：Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palmitoyl-gama-Glu-Otbu)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(pbf)-Lys(ivDDe)-wangresin。1c)ivDDe的脱除与Q2的引入：在NMP:DCM为1:1（体积比）的溶液中将由1b）产生的保护的肽基树脂洗涤两次，加入新鲜制备的2%的肼水合物NMP溶液，将该反应混合物在室温下振摇12分钟，然后过滤。将肼处理步骤重复两次。此后用NMP、DCM和NMP充分洗涤树脂。向其中加入Fmoc-AEEA-OH,HBTU,DIEA的NMP混合偶联液，振摇3小时后，过滤，洗涤，哌啶/DMF脱除Fmoc基团，用3-马来酰亚胺丙酸,DIC,HOBt的DMF偶联液，偶联反应3小时，得到：Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palmitoyl-gama-Glu-Otbu)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(pbf)-Lys(AEEA-MPA)-wangresin.1d)全保护的脱除Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palmitoyl-gama-Glu-Otbu)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(pbf)-Lys(AEEA-MPA)-wangresin树脂加入至圆底烧瓶中,冰浴下加入切割液TFA/EDT/Phenol/Water(88/2/5/5，体积比),升温，控制裂解液温度25℃,反应90min。过滤，滤饼用少量TFA洗涤3次，合并滤液。滤液在搅拌下缓慢倒入冰乙醚中。静置1h以上,待沉淀完全。倾去上清液，沉淀离心，用冰乙醚洗涤6次，得到粗品：H-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Palmitoyl-gama-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(AEEA-MPA)-OH。1e)精制纯化将1d）中所得粗品溶于5%乙酸/H2O中，通过10μm反相C18的填充的50mmx250mm柱上进行2次半制备型HPLC纯化。用32-50%CH3CN-0.1%TFA/H2O梯度以50ml/min将该柱洗脱45分钟，收集含有肽的馏分，浓缩除去CH3CN后冻干。得到HPLC纯度大于98%的纯品：H-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Palmitoyl-gama-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(AEEA-MPA)-OH。用PDMS法分析分离出的产物，发现质子化分子离子峰的m/z值为4106.31±3。因此，得出实施例1制备的化合物1的分子量为4105.31±3Da（理论值为4105.31）。由金黄色葡萄球菌V8蛋白酶对目标化合物进行酶解切割，随后通过PDMS进行肽片段的质量测定，从而确定酰基化位置（Lys26、Lys37）。从药物代谢动力学、体外活性测定、药效学分析三个实验考察了实施例1制备的化合物1的动物实验，结果分别如下：化合物1和GLP-Ⅰ药物代谢动力学分析对于雄性SD大鼠以0.1mg/kg的剂量通过静脉注射（IV）或皮下注射（SC）途径分别施用实施例1制备的化合物1与GLP-Ⅰ。在给药后的0-360小时内不同时间将动物进行放血处理，收集每个样本的血浆并用N-端特异的放射免疫测定法分析。使用模型依赖（对于IV所得的数据）和模型非依赖（对于SC所得的数据）的方法计算药物代谢动力学参数，数据如表1-1和表1-2所示。通过IV进行施用的化合物1的消除半衰期大约为19小时，GLP-Ⅰ的消除半衰期大约为12小时。而通过SC进行施用的化合物1的消除半衰期大约为15小时，GLP-Ⅰ消除半衰期大约为8小时。通过IV或SC途径分别施用化合物1与GLP-Ⅰ，均没有临床不良发应发生。通过表1-1和表1-2可以观察到化合物1延长消除半衰期、降低的清除率等。表1-1化合物1的平均值（±SD）药物代谢动力学实验数据表1-2GLP-Ⅰ的平均值（±SD）药物代谢动力学实验数据其中，Cmax表示所观察的血浆浓度最大值；Tmax表示所观察的达血浆浓度最大值的时间；AUC0-last表示所测定的从0到无穷大的血浆浓度-时间曲线下的面积；T1/2表示以小时计的消除半衰期；CL/F表示作为生物利用率函数的总的身体清除率；Vss/F表示作为生物利用率函数的稳态时的分布容积。化合物1和GLP-Ⅰ体外活性测定将用于CRE-荧光素酶系统的，稳定表达人GLP-Ⅰ受体的HEK-293细胞，按照每孔120μl低血清DMEMFBS培养基、30000个细胞接种到96孔板中。接种后第二天，将20μl等分试样的待测样品溶于0.5%BSA中，与该细胞混合并孵育5小时。在加入细胞以获得剂量应答曲线（从该曲线测定EC50值）之前，一般为待测化合物1制备包含从0.001nM到10nM的15种稀释液，为待测GLP-Ⅰ制备包含从0.001nM到10nM的15种稀释液，以及为Val8-GLP-Ⅰ(7-37)OH标准品准备0.3nM和3nM的10种标准溶液。在孵育之后，将100μl荧光素酶试剂直接加入每块平板中并轻轻混合2分钟。将平板放入Tri-lux发光计中并计算荧光素酶表达导致的光输出。化合物1和GLP-Ⅰ的平均EC50值分别如下：化合物1的平均EC50值分别为0.42±0.05nM；GLP-Ⅰ的平均EC50值为0.28±0.04nM。化合物1和GLP-Ⅰ药效学分析化合物1和GLP-Ⅰ，分别通过皮下注射（SC）途径按照0.01mg/kg的剂量给雄性短尾猴用药。并且通过皮下注射（SC）途径按照0.01mg/kg的剂量注射对照液磷酸盐缓冲液。皮下注射0.01mg/kg的剂量化合物1和GLP-Ⅰ后，1、2、3、5、7、10天分步输注葡萄糖液。皮下注射（SC）0.01mg/kg的剂量注射对照液后立即分步输注葡萄糖液。分步输注葡萄糖液是在禁食15小时后在给予镇静剂的猴子上进行的。在开始输注葡萄糖液10分钟之前，抽取血液样本定义基线。然后，以15mg/kg/min的速率再输注30分钟。在输注期间，以15分钟为间隔抽取血液样本，用免疫测定法确定胰岛素水平，数据显示如表1-3、1-4。表1-3化合物1的平均值（±SD）药效学参数值胰岛素曲线下面积表1-4GLP-Ⅰ的平均值（±SD）药效学参数值胰岛素曲线下面积从表1-3、1-4可以看出，在单次皮下注射0.01mg/kg化合物1后，至少10天证明其具有促胰岛素活性，而注射GLP-Ⅰ后只有3天具有促胰岛素活性。实施例2：化合物2（Compound2）合成1a)主肽链组装：按照Fmoc/tbu策略在CS336X多肽合成仪上合成0.25mmol规模的Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(ivDDe)-Gly-Arg(pbf)-Lys(Aloc)-wangresin。1b)Aloc的脱除与Q1的引入：将1a）中所得的肽树脂加入氯仿中，氩气保护下加入Pd(PPh3)4,NMM，搅拌反应2小时，树脂用DMF,DCM洗涤后，加入Fmoc-Glu-OtBu,DIC,HOBt的NMP偶联液,偶联3小时，哌啶（piperidine）/DMF脱除Fmoc基团，加入软脂酸（palmiticacid）,DIC,HOBt,的NMP偶联液，偶联3小时，得到：Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(ivDDe)-Gly-Arg(pbf)-Lys(Palmitoyl-gama-Glu-Otbu)-wangresin。1c)ivDDe的脱除与Q2的引入：在NMP:DCM为1:1（体积比）的溶液中将有1b）产生的保护的肽基树脂洗涤两次，加入新鲜制备的2%的肼水合物NMP溶液，将该反应混合物在室温下振摇12分钟，然后过滤。将肼处理步骤重复两次。此后用NMP、DCM和NMP充分洗涤树脂。向其中加入3-马来酰亚胺丙酸（3-maleimidopropionicacid）,DIC,HOBt的DMF偶联液，偶联反应3小时，得到：Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(MPA)-Gly-Arg(pbf)-Lys(Palmitoyl-gama-Glu-Otbu)-wangresin。1d)全保护的脱除Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(MPA)-Gly-Arg(pbf)-Lys(Palmitoyl-gama-Glu-Otbu)-wangresin树脂加入至圆底烧瓶中,冰浴下加入切割液TFA/EDT/Phenol/Water(88/2/5/5，体积比),升温，控制裂解液温度25℃,反应90min。过滤，滤饼用少量TFA洗涤3次，合并滤液。滤液在搅拌下缓慢倒入冰乙醚中。静置1h以上,待沉淀完全。倾去上清液，沉淀离心，用冰乙醚洗涤6次，得到粗品：H-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(MPA)-Gly-Arg-Lys(Palmitoyl-gama-Glu)-OH。1e)精制纯化将1d）中所得粗品溶于5%乙酸/H2O中，通过10μm反相C18的填充的50mmx250mm柱上进行2次半制备型HPLC而纯化。用34-46%CH3CN-0.1%TFA/H2O梯度以50ml/min将该柱洗脱45分钟，收集含有肽的馏分，浓缩除去CH3CN后冻干。得到HPLC纯度大于98%的纯品：H-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(MPA)-Gly-Arg-Lys(Palmitoyl-gama-Glu)-OH。用PDMS法分析分离出的产物，发现质子化分子离子峰的m/z值为3949.31±3。因此，得出实施例2制备的化合物2的分子量为3948.31±3Da（理论值为3948.31）。从药物代谢动力学、体外活性测定、药效学分析三个实验考察了实施例2制备的化合物2的动物实验，结果分别如下：化合物2和GLP-Ⅰ药物代谢动力学分析对于雄性SD大鼠以0.1mg/kg的剂量通过静脉注射（IV）或皮下注射（SC）途径分别施用实施例2制备的化合物2与GLP-Ⅰ。在给药后的0-360小时内不同时间将动物进行放血处理，收集每个样本的血浆并用N-端特异的放射免疫测定法分析。使用模型依赖（对于IV所得的数据）和模型非依赖（对于SC所得的数据）的方法计算药物代谢动力学参数，数据如表2-1和表2-2所示。通过IV进行施用的化合物2的消除半衰期大约为23小时，GLP-Ⅰ的消除半衰期大约为12小时。而通过SC进行施用的化合物2的消除半衰期大约为18，GLP-Ⅰ消除半衰期大约为8小时。通过IV或SC途径分别施用化合物2与GLP-Ⅰ，均没有临床不良发应发生。通过表2-1和表2-2可以观察到化合物2延长消除半衰期、降低的清除率等。表2-1化合物2的平均值（±）药物代谢动力学实验数据表2-2GLP-Ⅰ的平均值（±）药物代谢动力学实验数据其中，Cmax表示所观察的血浆浓度最大值；Tmax表示所观察的达血浆浓度最大值的时间；AUC0-last表示所测定的从0到无穷大的血浆浓度-时间曲线下的面积；T1/2表示以小时计的消除半衰期；CL/F表示作为生物利用率函数的总的身体清除率；Vss/F表示作为生物利用率函数的稳态时的分布容积。化合物2和GLP-Ⅰ体外活性测定将用于CRE-荧光素酶系统的，稳定表达人GLP-Ⅰ受体的HEK-293细胞，按照每孔120μl低血清DMEMFBS培养基、30000个细胞接种到96孔板中。接种后第二天，将20μl等分试样的待测样品溶于0.5%BSA中，与该细胞混合并孵育5小时。在加入细胞以获得剂量应答曲线（从该曲线测定EC50值）之前，一般为待测化合物1制备包含从0.001nM到10nM的15种稀释液，为待测GLP-Ⅰ制备包含从0.001nM到10nM的15种稀释液，以及为Val8-GLP-Ⅰ(7-37)OH标准品准备0.3nM和3nM的10种标准溶液。在孵育之后，将100μl荧光素酶试剂直接加入每块平板中并轻轻混合2分钟。将平板放入Tri-lux发光计中并计算荧光素酶表达导致的光输出。化合物2和GLP-Ⅰ的平均EC50值分别如下：化合物2的平均EC50值分别为0.44±0.06nM；GLP-Ⅰ的平均EC50值为0.28±0.04nM。化合物2和GLP-Ⅰ药效学分析化合物2和GLP-Ⅰ，分别通过皮下注射（SC）途径按照0.01mg/kg的剂量给雄性短尾猴用药。并且通过皮下注射（SC）途径按照0.01mg/kg的剂量注射对照液磷酸盐缓冲液。皮下注射0.01mg/kg的剂量化合物2和GLP-Ⅰ后，1、2、3、5、7、10天分步输注葡萄糖液。皮下注射（SC）0.01mg/kg的剂量注射对照液后立即分步输注葡萄糖液。分步输注葡萄糖液是在禁食15小时后在给予镇静剂的猴子上进行的。在开始输注葡萄糖液10分钟之前，抽取血液样本定义基线。然后，以15mg/kg/min的速率再输注30分钟。在输注期间，以15分钟为间隔抽取血液样本，用免疫测定法确定胰岛素水平，数据显示如表2-3、2-4。表2-3化合物2的平均值（±SD）药效学参数值胰岛素曲线下面积表2-4GLP-Ⅰ的平均值（±SD）药效学参数值胰岛素曲线下面积从表2-3、2-4可以看出，在单次皮下注射0.01mg/kg化合物2后，至少10天证明其具有促胰岛素活性，而注射GLP-Ⅰ后只有3天具有促胰岛素活性。实施例3：化合物3（Compound3）合成1a)主肽链组装：按照Fmoc/tbu策略在CS336X多肽合成仪上合成0.25mmol规模的Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Aloc)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(ivDDe)-Gly-Arg(pbf)-Pro-wangresin。1b)Aloc的脱除与Q1的引入：将1a中所得的肽树脂加入氯仿中，氩气保护下加入Pd(PPh3)4,NMM，搅拌反应2小时，树脂用DMF,DCM洗涤后，加入Fmoc-Asp-Otbu,DIC,HOBt的NMP混合溶液，偶联2小时，哌啶（piperidine）/DMF脱除Fmoc基团，硬脂酸（stearicacid）,DIC,HOBt,偶联3小时，得到：Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Stearyl-beta-Asp-Otbu)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(ivDDe)-Gly-Arg(pbf)-Pro-wangresin。1c)ivDDe的脱除与Q2的引入：在NMP:DCM为1:1（体积比）的溶液中将由1b）产生的保护的肽基树脂洗涤两次，加入新鲜制备的2%的肼水合物NMP溶液，将该反应混合物在室温下振摇12分钟，然后过滤。将肼处理步骤重复两次。此后用NMP、DCM和NMP充分洗涤树脂。向其中加入Fmoc-AEEA-AEEA-OH,HBTU,DIEA的NMP混合偶联液，振摇3小时后，过滤，洗涤，哌啶/DMF脱除Fmoc基团，用3-马来酰亚胺丙酸,DIC,HOBt的DMF偶联液，偶联反应3小时，得到：Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Stearyl-beta-Asp-Otbu)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(AEEA-AEEA-MPA)-Gly-Arg(pbf)-Pro-wangresin。1d)全保护的脱除Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Stearyl-beta-Asp-Otbu)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(AEEA-AEEA-MPA)-Gly-Arg(pbf)-Pro-wangresin树脂加入至圆底烧瓶中,冰浴下加入切割液TFA/EDT/Phenol/Water(88/2/5/5，体积比),升温，控制裂解液温度25℃,反应90min。过滤，滤饼用少量TFA洗涤3次，合并滤液。滤液在搅拌下缓慢倒入冰乙醚中。静置1h以上,待沉淀完全。倾去上清液，沉淀离心，用冰乙醚洗涤6次，得到粗品：H-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Stearyl-beta-Asp)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(AEEA-AEEA-MPA)-Gly-Arg-Pro-OH。1e)精制纯化将1d）中所得粗品溶于5%乙酸/H2O中，通过10μm反相C8的填充的50mmx250mm柱上进行2次半制备型HPLC而纯化。用35-54%CH3CN-0.1%TFA/H2O梯度以50ml/min将该柱洗脱45分钟，收集含有肽的馏分，浓缩除去CH3CN后冻干。得到HPLC纯度大于98%的纯品：H-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Stearyl-beta-Asp)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(AEEA-AEEA-MPA)-Gly-Arg-Pro-OH。用PDMS法分析分离出的产物，发现质子化分子离子峰的m/z值为4205.78±3。因此，得出实施例3制备的化合物3的分子量为4204.78±3Da（理论值为4204.78）。由金黄色葡萄球菌V8蛋白酶对目标化合物进行酶解切割，随后通过PDMS进行肽片段的质量测定，从而确定酰基化位置（Lys26、Lys34）。从药物代谢动力学、体外活性测定、药效学分析三个实验考察了实施例3制备的化合物3的动物实验，结果分别如下：化合物3和GLP-Ⅰ药物代谢动力学分析对于雄性SD大鼠以0.1mg/kg的剂量通过静脉注射（IV）或皮下注射（SC）途径分别施用实施例3制备的化合物3与GLP-Ⅰ。在给药后的0-360小时内不同时间将动物进行放血处理，收集每个样本的血浆并用N-端特异的放射免疫测定法分析。使用模型依赖（对于IV所得的数据）和模型非依赖（对于SC所得的数据）的方法计算药物代谢动力学参数，数据如表3-1和表3-2所示。通过IV进行施用的化合物3的消除半衰期大约为16小时，GLP-Ⅰ的消除半衰期大约为12小时。而通过SC进行施用的化合物3的消除半衰期大约为13，GLP-Ⅰ消除半衰期大约为8小时。通过IV或SC途径分别施用化合物3与GLP-Ⅰ，均没有临床不良发应发生。通过表3-1和表3-2可以观察到化合物3延长消除半衰期、降低的清除率等。表3-1化合物3的平均值（±SD）药物代谢动力学实验数据表3-2GLP-Ⅰ的平均值（±SD）药物代谢动力学实验数据其中，Cmax表示所观察的血浆浓度最大值；Tmax表示所观察的达血浆浓度最大值的时间；AUC0-last表示所测定的从0到无穷大的血浆浓度-时间曲线下的面积；T1/2表示以小时计的消除半衰期；CL/F表示作为生物利用率函数的总的身体清除率；Vss/F表示作为生物利用率函数的稳态时的分布容积。化合物3和GLP-Ⅰ体外活性测定将用于CRE-荧光素酶系统的，稳定表达人GLP-Ⅰ受体的HEK-293细胞，按照每孔120μl低血清DMEMFBS培养基、30000个细胞接种到96孔板中。接种后第二天，将20μl等分试样的待测样品溶于0.5%BSA中，与该细胞混合并孵育5小时。在加入细胞以获得剂量应答曲线（从该曲线测定EC50值）之前，一般为待测化合物3制备包含从0.001nM到10nM的15种稀释液，为待测GLP-Ⅰ制备包含从0.001nM到10nM的15种稀释液，以及为Val8-GLP-Ⅰ(7-37)OH标准品准备0.3nM和3nM的10种标准溶液。在孵育之后，将100μl荧光素酶试剂直接加入每块平板中并轻轻混合2分钟。将平板放入Tri-lux发光计中并计算荧光素酶表达导致的光输出。化合物3和GLP-Ⅰ的平均EC50值分别如下：化合物3的平均EC50值分别为0.33±0.06nM；GLP-Ⅰ的平均EC50值为0.28±0.04nM。化合物3和GLP-Ⅰ药效学分析化合物3和GLP-Ⅰ，分别通过皮下注射（SC）途径按照0.01mg/kg的剂量给雄性短尾猴用药。并且通过皮下注射（SC）途径按照0.01mg/kg的剂量注射对照液磷酸盐缓冲液。皮下注射0.01mg/kg的剂量化合物3和GLP-Ⅰ后，1、2、3、5、7、10天分步输注葡萄糖液。皮下注射（SC）0.01mg/kg的剂量注射对照液后立即分步输注葡萄糖液。分步输注葡萄糖液是在禁食15小时后在给予镇静剂的猴子上进行的。在开始输注葡萄糖液10分钟之前，抽取血液样本定义基线。然后，以15mg/kg/min的速率再输注30分钟。在输注期间，以15分钟为间隔抽取血液样本，用免疫测定法确定胰岛素水平，数据显示如表3-3、3-4。表3-3化合物3的平均值（±SD）药效学参数值胰岛素曲线下面积表3-4GLP-Ⅰ的平均值（±SD）药效学参数值胰岛素曲线下面积从表3-3、3-4可以看出，在单次皮下注射0.01mg/kg化合物3后，至少5天证明其具有促胰岛素活性，而注射GLP-Ⅰ后只有3天具有促胰岛素活性。实施例4：化合物4（Compound4）合成1a)主肽链组装：按照Fmoc/tbu策略在CS336X多肽合成仪上合成0.25mmol规模的Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(ivDDe)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(ivDDe)-Gly-Arg(pbf)-Lys(Aloc)-wangresin。1b)Aloc的脱除与Q1的引入：将1a）中所得的肽树脂加入氯仿中，氩气保护下加入Pd(PPh3)4,NMM，搅拌反应2小时，树脂用DMF,DCM洗涤后，加入Fmoc-Glu-OtBu,DIC,HOBt的NMP偶联液,偶联3小时，哌啶（piperidine）/DMF脱除Fmoc基团，加入软脂酸（palmiticacid）,DIC,HOBt,的NMP偶联液，偶联3小时，得到：Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(ivDDe)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(ivDDe)-Gly-Arg(pbf)-Lys(Palmitoyl-gama-Glu-Otbu)-wangresin。1c)ivDDe的脱除与Q2的引入：在NMP:DCM为1:1（体积比）的溶液中将由1b）产生的保护的肽基树脂洗涤两次，加入新鲜制备的2%的肼水合物NMP溶液，将该反应混合物在室温下振摇12分钟，然后过滤。将肼处理步骤重复两次。此后用NMP、DCM和NMP充分洗涤树脂。向其中加入3-马来酰亚胺丙酸,DIC,HOBt的DMF偶联液，偶联反应3小时，得到：Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(MPA)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(MPA)-Gly-Arg(pbf)-Lys(Palmitoyl-gama-Glu-Otbu)-wangresin。1d)全保护的脱除Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(MPA)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(MPA)-Gly-Arg(pbf)-Lys(Palmitoyl-gama-Glu-Otbu)-wangresin树脂加入至圆底烧瓶中,冰浴下加入切割液TFA/EDT/Phenol/Water(88/2/5/5，体积比),升温，控制裂解液温度25℃,反应90min。过滤，滤饼用少量TFA洗涤3次，合并滤液。滤液在搅拌下缓慢倒入冰乙醚中。静置1h以上,待沉淀完全。倾去上清液，沉淀离心，用冰乙醚洗涤6次，得到粗品：H-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(MPA)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(MPA)-Gly-Arg-Lys(Palmitoyl-gama-Glu)-OH。1e)精制纯化将1d中所得粗品溶于5%乙酸/H2O中，通过10μm反相C18的填充的50mmx250mm柱上进行2次半制备型HPLC而纯化。用34-46%CH3CN-0.1%TFA/H2O梯度以50ml/min将该柱洗脱45分钟，收集含有肽的馏分，浓缩除去CH3CN后冻干。得到HPLC纯度大于98%的纯品：H-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(MPA)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(MPA)-Gly-Arg-Lys(Palmitoyl-gama-Glu)-OH。用PDMS法分析分离出的产物，发现质子化分子离子峰的m/z值为4097.65±3。因此，得出实施例4制备的化合物4的分子量为4096.65±3Da（理论值为4096.65）。由金黄色葡萄球菌V8蛋白酶对目标化合物进行酶解切割，随后通过PDMS进行肽片段的质量测定，从而确定酰基化位置（Lys26、Lys34、Lys37）。从药物代谢动力学、体外活性测定、药效学分析三个实验考察了实施例4制备的化合物4的动物实验，结果分别如下：化合物4和GLP-Ⅰ药物代谢动力学分析对于雄性SD大鼠以0.1mg/kg的剂量通过静脉注射（IV）或皮下注射（SC）途径分别施用实施例4制备的化合物4与GLP-Ⅰ。在给药后的0-360小时内不同时间将动物进行放血处理，收集每个样本的血浆并用N-端特异的放射免疫测定法分析。使用模型依赖（对于IV所得的数据）和模型非依赖（对于SC所得的数据）的方法计算药物代谢动力学参数，数据如表4-1和表4-2所示。通过IV进行施用的化合物4的消除半衰期大约为18小时，GLP-Ⅰ的消除半衰期大约为12小时。而通过SC进行施用的化合物4的消除半衰期大约为14，GLP-Ⅰ消除半衰期大约为8小时。通过IV或SC途径分别施用化合物4与GLP-Ⅰ，均没有临床不良发应发生。通过表4-1和表4-2可以观察到化合物4延长消除半衰期、降低的清除率等。表4-1化合物4的平均值（±SD）药物代谢动力学实验数据表4-2GLP-Ⅰ的平均值（±SD）药物代谢动力学实验数据其中，Cmax表示所观察的血浆浓度最大值；Tmax表示所观察的达血浆浓度最大值的时间；AUC0-last表示所测定的从0到无穷大的血浆浓度-时间曲线下的面积；T1/2表示以小时计的消除半衰期；CL/F表示作为生物利用率函数的总的身体清除率；Vss/F表示作为生物利用率函数的稳态时的分布容积。化合物4和GLP-Ⅰ体外活性测定将用于CRE-荧光素酶系统的，稳定表达人GLP-Ⅰ受体的HEK-293细胞，按照每孔120μl低血清DMEMFBS培养基、30000个细胞接种到96孔板中。接种后第二天，将20μl等分试样的待测样品溶于0.5%BSA中，与该细胞混合并孵育5小时。在加入细胞以获得剂量应答曲线（从该曲线测定EC50值）之前，一般为待测化合物4制备包含从0.001nM到10nM的15种稀释液，为待测GLP-Ⅰ制备包含从0.001nM到10nM的15种稀释液，以及为Val8-GLP-Ⅰ(7-37)OH标准品准备0.3nM和3nM的10种标准溶液。在孵育之后，将100μl荧光素酶试剂直接加入每块平板中并轻轻混合2分钟。将平板放入Tri-lux发光计中并计算荧光素酶表达导致的光输出。化合物4和GLP-Ⅰ的平均EC50值分别如下：化合物4的平均EC50值分别为0.44±0.06nM；GLP-Ⅰ的平均EC50值为0.28±0.04nM。化合物4和GLP-Ⅰ药效学分析化合物4和GLP-Ⅰ，分别通过皮下注射（SC）途径按照0.01mg/kg的剂量给雄性短尾猴用药。并且通过皮下注射（SC）途径按照0.01mg/kg的剂量注射对照液磷酸盐缓冲液。皮下注射0.01mg/kg的剂量化合物4和GLP-Ⅰ后，1、2、3、5、7、10天分步输注葡萄糖液。皮下注射（SC）0.01mg/kg的剂量注射对照液后立即分步输注葡萄糖液。分步输注葡萄糖液是在禁食15小时后在给予镇静剂的猴子上进行的。在开始输注葡萄糖液10分钟之前，抽取血液样本定义基线。然后，以15mg/kg/min的速率再输注30分钟。在输注期间，以15分钟为间隔抽取血液样本，用免疫测定法确定胰岛素水平，数据显示如表4-3、4-4。表4-3化合物4的平均值（±SD）药效学参数值胰岛素曲线下面积表4-4GLP-Ⅰ的平均值（±SD）药效学参数值胰岛素曲线下面积从表4-3、4-4可以看出，在单次皮下注射0.01mg/kg化合物4后，至少7天证明其具有促胰岛素活性，而注射GLP-Ⅰ后只有3天具有促胰岛素活性。实施例5组合物配方：由浓度为0.9mg/ml实施例1制备的化合物1，浓度为8.0mM的磷酸盐缓冲液，浓度为5.0%（w/v）的苯甲酚，浓度为5.2%（w/v）的甘露醇，浓度为12.5mg/ml的丙二醇，pH为约7.5。其制备过程如下：向1000ml烧杯中加入0.9g实施例1制备的化合物1，52g甘露醇，50g苯甲酚，12.5g丙二醇，750ml水，加入磷酸盐至其浓度为8mM，并且用1NNaOH将pH调节至7.5，加注射用水定容。在过滤前，注射液中加入12.5g活性碳，在搅拌下吸附热原30分钟，脱碳过滤。滤液经0.22μm钛棒过滤器过滤，再经0.22μm微孔滤膜除菌过滤。每瓶以1.25ml的量填充入10ml玻璃小瓶，冷冻干燥，压塞，扎盖，获得实施例1制备的化合物1制剂。由实施例5制得制剂500支，通加速试验对其稳定性进行了考察。通过动物血管刺激性、肌肉刺激性、溶血及过敏性实验，对局部刺激性进行了考察。加速试验：将实施例5制备的一批样品放入温度为40±2℃、相对湿度为75%±5%的恒温恒湿箱中进行考察，分别在0、1、2、3和6个月时取样测定，结果见表5-1。表5-1实施例5样品加速试验结果通过表5-1可以看出，经加速试验考察6个月，实施例5制备的制剂，外观色泽、pH、溶液澄清度指标无明显变化，杂质无明显增加，含量无明显下降，表明本发明制备的制剂可于室温下保存，稳定性强。血管刺激性、肌肉刺激性、过敏性及溶血实验：血管刺激性：选取双耳无损伤的健康家兔6只，左侧耳缘静脉注射实施例5注射液1ml，右耳注射等容量5%葡萄糖注射液，每天1次，连续注射7天。注射期间，每天定时观察耳缘静脉的刺激性反应。第8天处死家兔，取双侧耳缘静脉及周围组织，用甲醛固定，在注射部位近心端作常规组织切片，光镜下观察有无病理变化。观察指标及判断标准见表5-2。表5-2血管刺激性评分及判断标准结果显示，家兔耳缘静脉注射实施例5注射液的刺激性，与5%葡萄糖注射液比较无明显差异。肉眼观察，未见血管充血、周围组织水肿等炎症反应。组织切片检查，未见血管结构异常、内皮损伤、血栓形成及其它病理变化。其肉眼和光镜观察的血管、周围组织的累计得分均小于0.5，表明无刺激性。肌肉刺激性：取健康家兔6只，每只家兔左侧股四头肌内注射实施例5注射液1ml，右侧注射同体积生理盐水。注射后观察注射部位肌肉有无充血、水肿等反应，半数动物48h后(第3天)放血处死，纵向切开皮肤，肉眼观察两侧注射部位有无充血、水肿等反应，并取其组织做病理检查。然后按表1-3中的标准评价该药的刺激反应。余下动物继续观察14d，于第18天放血处死后重复上述操作，评价标准见表5-3。表5-3肌肉刺激反应评价标准级别刺激反应现象0级给药部位无明显反应1级给药部位轻度充血，直径小于0.15cm2级给药部位中度充血，直径0.15～1.0cm3级给药部位重度充血、红肿、肌肉有变性4级出现肌肉褐色变性、坏死5级肌肉严重变性，出现大面积坏死结果表明，家兔左侧股四头肌内注射实施例5注射液后，肉眼观察注射部位肌肉无充血、水肿等反应，病理组织检查亦未见组织变性或坏死等明显性刺激反应，与生理盐水侧相比无显著差异。对豚鼠的致敏作用：选取健康豚鼠6只，每只腹腔注射实施例5注射液0.5ml，隔日注射1次，共注射3次。然后随机分为2组，分别在第1次给药后14或21天，静脉注射实施例5注射液1ml。观察豚鼠有无兴奋不安、呼吸困难等过敏症状。结果两组豚鼠均活动正常，未见呼吸异常等。体外溶血性试验：制备2%家兔红细胞悬液。取试管7支，按表5-4加入各种液体。将各试管轻轻摇匀，置37℃恒温水浴中孵育，观察0.5、1、2、3、6小时的结果。红细胞体外凝集与溶血的判断标准见表5-5。表5-4样品体外溶血试验加样表管号1234567实施例5(ml)0.10.20.30.40.5000.9%氯化钠注射液（ml）2.42.32.22.12.02.50蒸馏水（ml）0000002.52%红细胞悬液（ml）2.52.52.52.52.52.52.5实施例5终浓度（mg/ml）0.180.360.540.720.9000表5-5红细胞体外溶血与凝集试验判断标准结果，蒸馏水对照管在0.5小时完全溶血。生理盐水和实施例5样品各浓度在6小时内均无溶血现象。轻轻振摇，生理盐水和各浓度实施例5样品管底沉积的红细胞均能完全分散，表明本实施例制备的注射液无红细胞凝集反应。血管刺激性、肌肉刺激性、体外溶血性及过敏性实验表明，实施例5注射液无明显的刺激性、过敏性，也不会引起溶血反应。