本发明涉及一种流感病毒检测技术，尤其涉及一种流感病毒rrt-pcr检测引物和探针及检测h7n9亚型流感病毒的方法。
背景技术：
流感病毒中的a型流感病毒常常以前世界范围内的大流行，根据流感病毒表面蛋白血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)可以将a型流感病毒划分为18个ha亚型和11个na亚型。野生水禽是a型流感病毒的天然宿主，对于任何一个禽流感病毒，要实现由天然宿主一步步跨种传播感染的过程，受到很多因素的影响，包括病毒、宿主以及环境因素等。
每年都有偶发的人感染禽流感病毒病例发生。2013年我国首次在上海等地不明原因肺炎死亡病例中发现一种新型重配的h7n9亚型流感病毒是其病原，该病毒是由野鸟中的h7亚型禽流感病毒与鸭中流行的n9亚型禽流感病毒形成h7n9禽流感病毒前体病毒，该前体病毒进一步传入到鸡群中，与鸡群中流行的h9n2亚型禽病毒进一步重配，获得h9n2亚型禽流感病毒的6个内部基因形成目前在鸡群中流行的新型h7n9亚型禽流感病毒。该病毒每年冬春季都会造成人感染病例的一个流行高峰，截止到2017年2月，该病毒已经造成1258人感染，其中477人死亡。人感染该病毒后主要重症肺炎、多器官衰竭等严重临床症状，病死率高达40％，对民众健康造成重大威胁。因此如何对病例早期诊断对于指导临床治疗至关重要。发明人2013年成功研发了可以检测h7n9亚型流感病毒的检测方法，但是2017年2月19日，发明人同广东省疾病预防控制中心共同发现h7n9亚型流感病毒发生了新的变异，在其血凝素蛋白的剪切位点插入了4个氨基酸，导致剪切位点处突变为含有3个碱性氨基酸，表明病毒已经从以前对鸡不致病变成了对鸡高致病的病毒，对人的致病性影响还不清楚。随后农业部门在鸡中发现了同样的病毒，表明该病毒已经在我国部分地区的鸡群中流行，因此不仅对我国养禽业造成巨大威胁，而且会导致人的感染和死亡。因此本专利专门针对该变异高致病性病毒，应用特异性高的taqman探针以及pcr引物，能够快速特异性地检测血凝素基因突变区域，可以区别低致病性h7n9流感病毒，也可鉴别诊断其他亚型流感病毒，可以用于人感染病例的诊断以及禽类产品的检疫等，应用范围广。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种操作简单、应用方便的流感病毒rrt-pcr检测引物和探针及检测h7n9亚型流感病毒的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的流感病毒rrt-pcr检测引物和探针，包括以下一种或多种引物和探针：
针对新型高致病性h7n9亚型禽流感病毒ha基因裂解位点及附近相对保守区域设计的两组引物探针，两组引物的正向引物和探针相同，反向引物不同，即共计有正向引物一条，反向引物两条，探针一条。
本发明的应用上述的流感病毒rrt-pcr检测引物和探针检测h7n9亚型流感病毒的方法，包括步骤：
首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取h7n9亚型流感病毒rna；
然后，利用一步法rrt-pcr试剂盒加入所述引物和探针进行核酸扩增；
之后，根据ct值判断rrt-pcr检测结果，判断待检样本流感病毒是否阳性。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明所述的流感病毒rrt-pcr检测引物和探针及检测流感病毒的方法，由于包括针对新型高致病性h7n9亚型禽流感病毒ha基因相对保守区引物和探针，可以通过rrt-pcr法检测新型高致病性h7n9亚型流感病毒，操作简单、应用方便。
具体实施方式
本发明的新型高致病性h7n9亚型流感病毒rrt-pcr检测引物和探针，其较佳的具体实施方式是，包括以下一种或多种引物和探针：
针对新型高致病性h7n9亚型流感病毒ha基因相对保守区域设计的两组引物探针，正向引物一条，反向引物两条，探针一条。
所述引物和探针可以包括长度为22～23bp的寡核苷酸片段；
其中针对新型高致病性h7n9亚型流感病毒ha基因正向引物与新型高致病性h7n9亚型流感病毒ha基因的正链碱基序列一致，反向引物与负链的碱基序列一致，而探针与目的基因负链的碱基序列一致。
所述两组新型高致病性h7n9亚型流感病毒特异性引物和探针包括以下一条正向引物序列，两条反向引物序列和一条探针序列：
第一组引物序列：5’-cagttggaaaatgtccgagatat-3’；
5’-gaaacccgctatagcaccaaata-3’；
探针序列：5’fam-aggcctctcgcagtccgttttc-bhq13’；
第二组引物序列：5’-cagttggaaaatgtccgagatat-3’；
5’-gccttcccatccattttcaatga-3’；
探针序列：5’fam-aggcctctcgcagtccgttttc-bhq13’。
上述探针序列两端的标记为fam、bhq1荧光素标记。
本发明应用上述的新型高致病性h7n9亚型流感病毒rrt-pcr检测引物和探针检测新型高致病性h7n9亚型流感病毒的方法，其较佳的具体实施方式是，包括步骤：
首先，利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒rna；
然后，利用一步法rrt-pcr试剂盒加入所述引物和探针进行核酸扩增；
所述流感病毒包括新型高致病性h7n9亚型流感病毒。
本发明中的引物和探针序列(5’→3’)及其检测的靶片段如下：
具体实施例：
包括了寡核苷酸引物的设计、taqman探针的设计、待检样本的处理、检测和分析。为进一步说明流感病毒rrt-pcr检测引物及应用方法，参照下列实施例进行说明：
实施例一：新型高致病性h7n9亚型流感病毒rrt-pcr寡核苷酸引物的设计与合成
genbank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/flu/flu.html)中和中国国家流感中心病毒序列数据库中下载h7n9亚型流感病毒及新型高致病性h7n9亚型流感病毒ha基因全序列，mega软件比对分析所下载基因序列的一致性，选择在新型高致病性h7n9亚型流感病毒ha基因的切割位点设计探针，在切割位点上下游相对保守区设计引物。引物和探针设计中允许同一变异位点允许2个及2个以下简并碱基。将所提取的备选引物满足以下要求进行筛选：①探针与同链引物位置接近，pcr产物大小在100bp到150bp之间。②引物和探针的gc％在25％到75％之间；③引物长度20bp左右，tm值在58℃到60℃之间，探针长度20bp到30bp，tm值比引物高5℃到10℃；④polyn≤4bp；⑤hairpin≤4bp；⑥覆盖率>90％；⑦进行blast筛选，特异性分数>l×0.4；⑦探针5’端应避免使用碱基g。
实施例二：本发明检测未知病毒的应用举例
1.病毒rna的提取：
取病毒采样液200μl，加入500μl裂解液，按rneasyminikit(qiagen公司，catalog#74104)说明书提取病毒rna50μl。
2.rrt-pcr反应
1)体系配置：使用agpath-idtmone-steprt-pcrreagents(thermofisherscientific公司，catalog#am1005)反应液
2)rrt-pcr：将加好上述反应体系的反应管放于pcr仪进行rrt-pcr，反应程序如下
45℃作用10分钟；
95℃作用10分钟；
95℃变性15秒；
60℃延伸45秒；
回到第3步，40个循环。
3.结果判断：
阴阳对照结果成立的情况下判断结果，即阴性参照没有ct值，而阳性参照有ct值。一般情况的下ct值小于38的可以判断为阳性。
本发明提供了2套用于甄别新型高致病性h7n9亚型流感流感病毒的特异性寡核苷酸引物及探针序列；并提供了rrt-pcr的检测体系及其在流感病毒快速检测中的应用。
检测评价：
特异性评价：共选取国内近两年来流行的新型h7n9亚型流感病毒，新型高致病性h7n9亚型流感病毒及新型高致病性h5n6亚型流感病毒共11株进行检测,两套引物和探针均能检出新型高致病性h7n9亚型流感病毒，而不能检出新型h7n9亚型流感病毒以及新型高致病性h5n6亚型流感病毒。
灵敏性评价：利用a型流感病毒m基因体外转录rna标准品，以及新型高致病性h7n9亚型流感病毒a/guangdong/17sf003/2017提取的rna10倍梯度稀释液对本发明设计的两组引物探针组合的检测极限进行确定，结果证明本发明的两套引物探针可以检测低至100个rna拷贝。
本发明可以将rrt-pcr技术应用于新型高致病性h7n9亚型流感病毒的甄别、检测体系中。为新型高致病性h7n9亚型流感病毒的实验室诊断提供了有效的检测技术，为新型高致病性h7n9亚型流感病毒病例诊断、禽类产品的检疫等工作提供技术手段和检测依据。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。