1.一种可溶性重组蛋白P-selectin-Fc tag,其特征在于,为分子量为140KD的P-选择素蛋白。
2.按权利要求1所述的溶性重组蛋白P-selectin-Fc tag,其特征在于,通过下述方法制备:
采用基因工程方法,用E.coli(DH5α)制备P-selectin目的DNA质粒,然后与表达载体重组,转化相应的表达细胞,筛选高表达工程菌或工程细胞;工程菌或工程细胞经扩增,收集表达相,应用分离纯化方法获得高纯度可溶性P-Selectin蛋白。
3.按权利要求1或2所述的溶性重组蛋白P-selectin-Fc tag,其特征在于,制备可溶性重组P-选择素蛋白的方法其表括步骤:
1)可溶性P-Selectin蛋白的表达
采用基因工程手段,用E.coli(DH5α)制备P-selectin目的DNA的质粒,载体(vector)带G418抗生素行抗药性筛选:
以Dg44CHO cell line为真核工具细胞株,所述质粒转染该细胞株,MTX 1uM刺激细胞株表达P-selectin-Fc,选择表达量最高的克隆进行筛选鉴定,获得稳定的高表达的细胞株;
2)获得的细胞于75cm2的培养瓶中传代扩增,收集CHO cell培养上清,获得可溶性分泌型蛋白P-selectin-Fc tag;
3)可溶性P-Selectin蛋白的吸附洗脱
将上述细胞培养上清过蛋白吸附凝胶柱,所述可溶性P-Selectin蛋白被凝胶吸附;
用蛋白洗脱缓冲液从柱子上洗脱蛋白;PBS透析过夜,去除蛋白洗脱缓冲液;
获得的蛋白液用紫外分光光度计测定OD值,初步估计蛋白量;蛋白液置入蛋白专用浓缩离心管在4℃3,000r.p.m.离心15分钟进行蛋白液浓缩;
4.)可溶性P-Selectin蛋白的鉴定
取蛋白液进行考马斯亮蓝染色,以及Western Blot鉴定,所述的可溶性 P-Selectin蛋白为分子量为140K D的P-选择素蛋白;
5.)去除内毒素
将蛋白液滤过内毒素吸附柱子,去除内毒素;使用内毒素测试棒行内毒素测试过关试验检测过关后;BCA法进行蛋白浓度定量测定,确定为P-选择素蛋白,分装后-80℃冻存,备体内实验用。
4.权利要求1的可溶性重组蛋白P-selectin-Fc tag在制备治疗子宫内膜异位症的药物中的用途。
5.按权利要求4所述的用途,其特征在于,所述的可溶性重组蛋白P-selectin-Fc tag,改善内异症模型小鼠热痛觉过敏并抑制病灶生长。
6.按权利要求4所述的用途,其特征在于,所述的可溶性重组蛋白通过拮抗血小板,封闭P-选择素结合位点作用抑制血小板在内异症病灶聚集,减少炎症细胞在病灶的浸润,减轻病灶炎症反应,减少血管生成及细胞增殖,减轻病灶纤维化。