技术领域：
：本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种RNA保护剂及试剂盒、应用及保存方法。
背景技术：
：：核糖核酸(缩写为RNA，即RibonucleicAcid)，存在于生物细胞和部分病毒、类病毒中的遗传信息载体，RNA是由核糖核苷酸经过磷酯键缩合而成的长链状分子，能够参与细胞的各项生命活动，是当今医学、生物学和药学领域中重点研究的对象。随着RNA的深入研究，发现具有生命活动的细胞能够将特定的RNA从细胞内分泌到循环系统或者特定的组织微环境中，这类RNA被定义为细胞外RNA(exRNA)。由于exRNA与细胞中常见的RNA具有明显的差异性，因此exRNA可以作为信号发挥各种潜在的生物学作用。目前医学和药学领域越来越重视将细胞外RNA作为潜在药物和深度测序的靶标，用于肿瘤的诊断和靶向治疗，特别是exRNA中的微小RNA的纯度和活性对于靶向药物的靶点特异性具有显著的影响。而exRNA在长期保存、冻融和纯化后经常会受到RNase的降解，这为exRNA的广泛使用、存储和运输带来极大的困难。在RNA的实际应用中，RNA的保存依赖于不含有RNase的纯水或者加入EDTA等螯合剂的水溶液来溶解RNA并可在-80℃的超低温冰箱中保存一年，而对于样本量微少的RNA来说，在室温条件下冻存至-80℃过程中会造成不可逆的RNA断裂，同样在-80℃恢复至室温条件下再次的物理性损害会破坏微小RNA原本的生物活性。目前市面上有若干商业化试剂用于保存含有RNA的生物样本，如LifeTech公司的RNAlater，Biomatrica公司的RNAstable等，无论是以液态或固态保存，这些试剂中的酶活反应抑制剂和变性剂能够保护RNA样本不受RNase的降解，但是这些试剂的缺陷在于需要将原始RNA样本进行纯化后再用于后续生物反应，而纯化过程会进一步导致exRNA样本的损失，而纯化后的exRNA特别是其中的微小RNA的固态保存对于微小RNA的长途运输和反复使用具有重要意义。综上所述，如何能够保证纯化后的exRNA样本在非超低温情况下得到保护，保证纯化后的微小RNA样本仍然保有高质量和纯度，如何在长距离运输中仍然具有高效的生物活性是至关重要的。因此，本领域迫切需要开发一种能够高效抑制RNase降解，避免反复冻融造成的RNA损伤，特别是不影响后续exRNA各种酶活反应的保护剂，这对于当今医学、药学和生物学中exRNA的各种研究是非常重要的。技术实现要素：本发明的发明目的之一，在于针对上述存在的问题，提供一种即使反复冻干仍能保证exRNA的质量和纯度，并且不影响后续各种酶活反应和exRNA生物活性的保护剂。本发明第一方面，提供一种核糖核酸保护剂，所述核糖核酸保护剂为包含：摩尔浓度为0.27-1M的海藻糖，其余为纯水。所述纯水不包含核糖核酸酶。较佳的，上述海藻糖浓度为0.27-0.5M。在具体实施例中，上述保护剂还包含核糖核酸酶抑制剂，所述核糖核酸酶抑制剂与海藻糖溶液的体积比为1：(2000-20000)。较佳的，上述保护剂中还包含乙二胺四乙酸,所述乙二胺四乙酸的含量为0.2mM-0.5mM。在具体实施例中，上述保护剂中还包含缓冲液，所述缓冲液加入保护剂后，使保护剂的pH值范围在5.2—8.0之间。上述缓冲液为TE缓冲液，乙二胺四乙酸的含量为0.2mM-0.5mM。更佳的，上述海藻糖浓度为0.5M。本发明第二方面，提供一种核糖核酸保护剂试剂盒，所述试剂盒包括上述核糖核酸保护剂。本发明的第三方面，提供上述核糖核酸保护剂在保存含有任何片段长度的核糖核酸样本中的应用。较佳的，上述核糖核酸为体外核糖核酸。本发明的第四方面，提供一种核糖核酸的保存方法，所述方法包括步骤：a)将纯化前或纯化后的体外核糖核酸样本溶于上述核糖核酸保护剂中；b)将步骤a)得到的溶液制成冻干粉；c)将步骤b)得到的冻干粉保存在室温及以下温度。上述保存温度为25℃以下。较佳的，上述保存温度为-20℃以下。上述核糖核酸为体外核糖核酸。海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等。是一种安全、可靠的天然糖类。海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，在自然界中许多可食用动植物及微生物体内都广泛存在。海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。关于海藻糖已经有很多应用。本申请的发明人通过大量实验，得到上述的技术方案。海藻糖属于化学惰性物质，溶于纯水后在室温(25℃以下)或2℃-8℃条件下具有极高的稳定性。0.27M-0.5M的海藻糖在上述环境中能够长期保存(24个月内稳定性和化学性质不变)。并且该浓度范围的海藻糖能够避免细菌等微生物的存活，具有明显的抑制细菌真菌等微生物的生长作用，这对于保护微小RNA来说是必要的，否则细菌真菌等微生物的代谢会产生RNase，不利于微小RNA的保存和反复使用。在本申请中，我们把浓度大于0.27M的海藻糖溶液称为高浓度海藻糖溶液。本发明中的溶液浓度单位“M”是“mol/L”，即摩尔浓度。实验证明，0.27M-1M的海藻糖溶液与exRNA混合后形成的干粉可在-20℃条件下保存18个月，在2℃-8℃条件下保存6个月，在室温条件下保存1个月，因此便于长距离运输或跨国邮寄。0.27M-0.5M的海藻糖就足够保护exRNA是因为其能够与核糖核酸的磷酸基团形成紧密的氢键，从而避免exRNA暴露于RNase，同时形成的磷酸基团相互排斥，因此该浓度范围内的海藻糖溶液具有比纯水更高的RNA溶解性，相同溶剂体积下，海藻糖溶液能够溶解更多的exRNA，在室温、2℃-8℃和-20℃条件下固态保存并重新溶解后，经过PAGE电泳比较RNA的特异表征，28s、18s和5s条带均无降解拖尾现象。LifeTech公司的RNAlater能够保证溶解条件下的RNA不被RNase降解，但是经过多次反复冻融却会带来RNA断裂等损伤，Biomatrica公司的RNAstable也是能够将RNA冻干成固态，但是经过多次溶解冻干却无法抑制细菌真菌等造成的RNase降解。在RNA连接反应，反转录和PCR扩增反应中，对已加入海藻糖的exRNA样本检验发现，不会影响各种聚合酶、连接酶和反转录酶的活性反应，同时由于高浓度的海藻糖能够避免RNA高级结构的形成，在反转录和连接反应中能够比常规缓冲液提高反应效率。除此之外，冻干溶解后的exRNA样本在紫外分光光度法测定时，不影响OD230/260和OD260/280的读数；在荧光法测定exRNA样本浓度和完整性时，海藻糖不影响荧光染料和exRNA单链的结合，从而可以用Qubit3.0荧光计和AgilentBioanalyzer2100进行相应数据的收集。将纯化后的exRNA样本溶解于上述保护剂中，并真空冻干成固态，在室温下保存至少1个月。将纯化后的exRNA样本溶解于上述保护剂中，并真空冻干成固态，在2℃-8℃条件下保存至少6个月。将纯化后的exRNA样本溶解于所述保护剂中，并真空冻干成固态，在-20℃条件下保存至少18个月。综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的益处是：采用本发明的保护剂，exRNA样本以固态保存于常温条件下可以完整保存1个月，于2℃-8℃条件下可以完整保存6个月，与低温-20℃条件下可以完整保存至少18个月。在这样的保护条件下，即使反复冻融细胞外RNA样本仍然具有很高的生物活性，避免了液态保存exRNA样本反复冻融造成的exRNA样本的损伤。同时在该保护剂存在的情况下，不会影响和exRNA有关的后续各种酶反应活性，并且由于海藻糖的化学性质能够提高exRNA结构稳定性并提高酶反应活性，除此之外，0.27M-0.5M的海藻糖不影响如紫外分光光度计、Qubit3.0和Agilentbioanalyzer2100等能够对exRNA样本定量定性分析的生物仪器的数据读取。由于核糖核酸以固态形式能够长期保存并且不影响exRNA的完整性和活性，该发明对核糖核酸特别是exRNA，尤其是其中的微小RNA的保存，反复使用和长途运输具有重要的应用价值。附图说明图1为exRNA在商业化试剂保存和海藻糖溶液冻干保存在-20℃条件下18个月后核糖核酸浓度比较图；图2为exRNA在商业化试剂保存和海藻糖溶液冻干保存在-20℃条件下18个月后的紫外分光法测定的OD260/280数值比较图；图3为exRNA在商业化试剂保存和海藻糖溶液冻干保存在2℃-8℃条件下6个月和室温下1个月后的聚丙烯酰氨凝胶电泳结果比较图；图4为exRNA在商业化试剂保存和海藻糖溶液冻干样本保存过程中反复冻融后RNA的浓度比较图；图5为不同活性RNase抑制剂增强海藻糖溶液抵抗RNaseA降解能力的比较图；图6为0-1M之间不同浓度海藻糖溶液溶解exRNA能力的比较图；图7为0-1M之间海藻糖溶液溶解RNA的紫外分光法测定结果；图8为聚丙烯酰氨凝胶电泳显示不同浓度海藻糖溶液保护exRNA效果的对比图；图9为QubitRNA荧光定量显示RNAstable和海藻糖溶液冻干样本保存后对exRNA浓度影响的比较图；图10为不同体积的0.5M海藻糖溶液和RNAstable对反转录反应效率的影响比较图；图11为0.27M海藻糖溶液中加入不同浓度的Tris对RNA反转录反应效率的影响比较图；图12为0.5M海藻糖溶液中加入不同浓度的EDTA对RNA反转录反应效率的影响比较图；图13为RNAstable和0.5M海藻糖溶液冻干exRNA后室温保存1个月，2℃-8℃保存6个月和-20℃保存18个月后的exRNA在文库构建过程中PCR反应成功率的比较图；图14为exRNA降解实验中，miR-21和let-7a分子拷贝数变化的比较图；图15为海藻糖冻干样本运输后exRNA样本的电泳分析结果图；图16为AgilentBioanalyzer2100显示的海藻糖冻干样本运输后样本中微小RNA的含量分析图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于说明本发明，不用于限定本发明的使用范围。实施例1各种核糖核酸保护剂的配置1.不同浓度海藻糖溶液的配置序号海藻糖(g)纯水(ml)浓度(M)14.62500.2725.13500.336.85500.448.56500.5517.11501表12.加入核糖核酸酶抑制剂的海藻糖溶液序号核糖核酸酶抑制剂(μl)海藻糖溶液(0.5M，μl)体积浓度10.120001:2000020.220001:1000030.420001:50004120001:2000表23.加入核糖核酸酶抑制剂和乙二胺四乙酸的海藻糖溶液表34.加入核糖核酸酶抑制剂和TE缓冲液的海藻糖溶液表4注：*a.Tris-EDTA缓冲液简称TE缓冲液(包含10mMTris，1mMEDTApH8.0)。*b.如需调节终溶液的pH值，使得其保持在pH5.2-8.0之间，可以通过滴加少量浓盐酸或者氢氧化钠，溶解混匀后来实现。本发明中试剂如无特别说明，均为市场上可以购买的普通试剂，所述纯水为不含核糖核酸酶的纯化水，也可以使用双蒸水。实施例2培养肿瘤细胞exRNA的纯化、定量测定和完整程度分析方法：H332，SW1910或Hela细胞培养于含有10％FBS的RPMI培养液的90mm培养皿，于5％CO2的37℃恒温培养箱中培养至90％的饱和度。48小时后收集细胞培养液，每1ml的培养液中加入500μlTrizol试剂(LifeTech)，反复用移液器吹吸后室温下静置5分钟。随后加入200μl的氯仿，剧烈震荡15秒后室温下静置10分钟。12000g在4℃离心15分钟后吸取上清至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，用移液器吹吸混匀后在-20℃保存过夜。12000g在4℃离心15分钟后除去上清。加入500μl的75％乙醇溶液震荡洗涤1分钟，10000g在4℃离心5分钟后吸去上清，室温下干燥30分钟得到纯化的exRNA。根据不同的实验目的将exRNA溶解在不同溶液中或冻干保存于不同条件下。选取的溶解exRNA的溶液有不含有RNase的纯水，LifeTech公司的RNAlater溶液，Biomatrica的RNAstable溶液(冻干后保存exRNA)，不同浓度的海藻糖溶液，及加入不同浓度的RNase抑制剂、加入Tris或EDTA的海藻糖溶液(冻干后起到保护exRNA作用)。10ng/μl以上浓度的exRNA的定量测定用紫外分光光度计，读数包括OD230/260和OD260/280。具体测定方法为：分别将1-2μl溶解exRNA的溶液和1-2μl的溶解的exRNA置于紫外分光光度计中，其中溶解exRNA的溶液作为空白对照来测定exRNA的浓度和纯度，其中OD260/280数值代表exRNA的纯度，理想化的exRNA的OD260/280数值应在1.9-2.1之间。10ng/μl以下浓度的exRNA的定量测定用Qubit3.0荧光光度计。具体测定方法为：将Qubit仪器配套的RNA试剂以1：(50-200)的比例稀释，根据说明书配制标准液并对仪器进行校准。10μl的exRNA溶液稀释到40-190μl的工作液，室温下保存2分钟后用于Qubit3.0荧光光度计中获取RNA的浓度，起始exRNA浓度根据原始的稀释比例乘以4-10后所得。实施例3不同商业化保护剂和海藻糖溶液在-20℃条件下长期保存exRNA的实验用实施例1所述方法从SW1910细胞提纯的exRNA，分别溶解于LifeTech公司的RNAlater溶液，Biomatrica的RNAstable溶液和0.5M海藻糖溶液，经紫外分光光度计测定exRNA的浓度。其中溶解于RNAlater中exRNA浓度为13.7ng/μl，OD260/280为1.91；溶解于RNAstable中的exRNA浓度为17.9ng/μl，OD260/280为1.97；溶解于0.5M海藻糖溶液中的exRNA浓度为21.2ng/μl，OD260/280为1.99(图1和2)。将RNAstable保存的exRNA和0.5M海藻糖保存的exRNA冻干成固态，RNAlater保存的exRNA仍为液态放置于-20℃低温保存18个月后，重新将冻干状态的exRNA用不含RNase的纯水溶解至冻干前体积，RNAlater保存的exRNA恢复至室温液态。重新用紫外分光法测定三种溶液中exRNA的浓度和纯度，其中溶解于RNAlater中exRNA浓度为3.1ng/μl，OD260/280为1.73；溶解于RNAstable中的exRNA浓度为11.9ng/μl，OD260/280为1.89；溶解于0.5M海藻糖溶液中的exRNA浓度为19.7ng/μl，OD260/280为1.98(图1和2)。其中溶解于RNAlater中exRNA浓度结果低于紫外分光光度计测量范围，说明该保存法无法长期对低温状态的exRNA形成保护，多数exRNA已经随着冻融而损伤并降解。在图1中，黑色柱形图代表exRNA在RNAlater溶液中的起始浓度和18个月-20℃保存后的浓度，深灰色柱形图代表exRNA在RNAstable溶液中的起始浓度和18个月-20℃保存后的浓度，浅灰色柱形图代表exRNA在0.5M海藻糖溶液中的起始浓度和18个月-20℃保存后的浓度。在图2中黑色圆圈代表exRNA在RNAlater溶液中的起始纯度和18个月-20℃保存后的纯度，深灰色正方形代表exRNA在RNAstable溶液中的起始纯度和18个月-20℃保存后的纯度，浅灰色三角形代表exRNA在0.5M海藻糖溶液中的起始纯度和18个月-20℃保存后的纯度。实施例4exRNA在不同温度和不同保护剂中的冻干保存实验用实施例1所述方法从Hela细胞和H332细胞中提纯的exRNA，分别溶解在Biomatrica的RNAstable溶液和0.5M海藻糖溶液，每份溶液等分成两份，分别冻干保存在常温下1个月和2℃-8℃下6个月，随后将冻干粉用等体积的无RNase的纯水重新溶解后，进行exRNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳(又称PAGE电泳)来检验这段时间内exRNA的降解情况。图3的电泳结果中显示，与DNAladder比较得出，在RNAstable保存期间(1和2分别代表Hela细胞的exRNA和H332细胞的exRNA，a，b和c分别代表未冻干前，冻干后常温保存1个月和冻干后2℃-8℃6个月)，exRNA均出现不同程度的降解；而在0.5M海藻糖保存的期间中，exRNA没有出现任何降解，RNA条带的亮度和未冻干前完全一致。图3是exRNA的PAGE电泳结果。其中从左到右依次是0.1μg的100bpplusDNAladder，Hela细胞未冻干的exRNA，RNAstable冻干室温保存1个月的exRNA，海藻糖冻干室温保存1个月的exRNA，RNAstable冻干2℃-8℃下6个月的exRNA，海藻糖冻干2℃-8℃下6个月的exRNA，H332细胞未冻干的exRNA，RNAstable冻干室温保存1个月的exRNA，海藻糖冻干室温保存1个月的exRNA，RNAstable冻干2℃-8℃下6个月的exRNA，海藻糖冻干2℃-8℃下6个月的exRNA。电泳条件是：200V电压下30分钟。实施例5exRNA在不同保护剂中的反复冻融后损伤结果比较等量的exRNA分别溶解于RNAlater和0.5M海藻糖溶液中，用Qubit3.0独立重复测量三次的平均结果分别为5.8ng/μl和6.0ng/μl。将以上两份样本置于-20℃十分钟后，RNAlater溶液变为固态，海藻糖溶液仍然为液态。再次将样本置于室温下15分钟待RNAlater溶液恢复液态，重复此操作5次后再次用Qubit3.0独立重复测量三次的平均结果分别为4.3ng/μl和5.9ng/μl。而后再次重复冻融操作5次后用同样的测量方法进行计数，平均结果分别为2.1ng/μl和5.9ng/μl。结果如图4所示，横轴为冻融次数，纵轴为exRNA的浓度，黑色圆圈代表溶解于RNAlater中，浅灰色正方形代表溶解于海藻糖溶液中。从图4中可以看出，经过5次和10次冻融，溶解于海藻糖溶液中的exRNA浓度几乎没有变化，而溶解于RNAlater中的exRNA浓度则分别降低了26％和64％，说明反复冻融次数越多exRNA的降解程度越严重，由此可以看出海藻糖对于exRNA的保护能力适用于exRNA的反复冻融使用。实施例6海藻糖溶液中加入RNase抑制剂能够保护exRNA免于RNaseA的降解作用等量的exRNA溶解于加入了不同浓度活性的RNase抑制剂的0.5M海藻糖溶液，经过Qubit3.0测定后配制成5ng/μl的溶液。其中RNase抑制剂的加入量分别是1U，0.5U和0.1U。随后分别再向溶液中加入100pg，10pg和1pg的RNaseA。经过1小时的室温孵育后，用PAGE电泳检查exRNA的完整性。从图5中可以看出，加入RNase抑制剂能过保护exRNA免受RNaseA的降解，加入0.1U就可以经受10pg的RNaseA的降解。从使用经济性考虑，工作浓度在0.1U的RNase抑制剂就可以发挥良好的防exRNA降解作用。实施例7海藻糖溶液浓度影响RNA的溶解性纯水溶解的RNA在经过冻干后不易溶于水，需要辅助以加热或搅拌，这些操作可能会影响RNA的稳定性从而造成降解。海藻糖由于其特有的化学性质能够使纯水溶解的RNA在经过冻干后提高其溶解。将5mgRNA溶于0.1ml的纯水后用紫外分光光度计测定该样本的RNA浓度，结果显示室温下其浓度平均为15μg/μl，OD260/280约为2.0(浓度和纯度的测定都独立重复五次)，说明该温度和正常气压下达到RNA的饱和度。随后将该RNA样本冻干后分别用0.1M，0.2M，0.25M，0.27M，0.45M，0.5M，0.75M和1M的海藻糖溶液各0.1ml分别溶解，在相同的室温和气压下重新用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度(浓度和纯度的测定都独立重复五次)，从图6和图7中可以发现，在浓度低于0.27M的海藻糖溶液和纯水对RNA的溶解性能是相似的，在浓度高于0.5M的海藻糖溶液对RNA的溶解性无异于0.27M-0.5M的海藻糖溶液，并且纯度都保持在2.0左右，由此说明0.27-1M的海藻糖溶液可以提高RNA的溶解性，且不影响RNA的浓度，而0.27M-0.5M的海藻糖溶液是更佳的选择，更为经济，而且0.5M的海藻糖溶液溶解效果最佳。图6中横轴代表海藻糖溶液的浓度，纵轴代表紫外分光光度计测定的RNA的浓度；图7中横轴代表海藻糖溶液的浓度，纵轴代表紫外分光光度计测定的OD260/280数值。实施例8海藻糖溶液浓度能够影响exRNA保存将exRNA溶解在不同浓度的海藻糖溶液中(海藻糖溶液浓度分别为0.1M，0.2M，0.25M，0.27M，0.45M，0.5M，0.75M和1M)，配制成20ng/μl的溶液后真空冻干并放置在室温下1个月。随后用无RNase的纯水重新将exRNA溶解后，用PAGE电泳检测exRNA的降解程度。从图8中能够发现，低于0.27M的海藻糖溶液不能很好保护exRNA，海藻糖溶液浓度越低，exRNA的降解越明显。高于0.27M的海藻糖溶液能够保护exRNA免于降解，超过0.5M的海藻糖溶液和0.27M的海藻糖溶液具有相似的保护exRNA能力，而超过1M的海藻糖溶液在常温下是难于配制的，因此，本发明优选0.27-1M的海藻糖溶液，更佳的，使用0.27M—0.5M的海藻糖溶液就具有良好的保存exRNA的能力，且更经济。实施例90.5M的海藻糖溶液不影响Qubit3.0荧光定量法检测exRNA的浓度存储在RNAstable和0.5M海藻糖溶液中的exRNA在冻干前先定容至5ng/μl，用Qubit3.0独立重复五次，结果显示溶于RNAstable的exRNA浓度在4.77±0.38ng/μl，溶于0.5M海藻糖的exRNA浓度在4.90±0.23ng/μl。随后分别将两份样本冻干并在室温下保存1个月后重新用等体积纯水溶解，随后再次用Qubit3.0荧光定量法对exRNA浓度进行检测。结果显示RNAstable对Qubit3.0荧光定量法检测exRNA具有一定影响，结果经过五次独立重复检测结果为3.98±0.41ng/μl，而0.5M海藻糖对该荧光定量法几乎没有任何影响，五次独立重复读取数据的结果为4.85±0.29ng/μl，仅仅比起始浓度平均值低1.1％，完全在误差范围内，而RNAstable对该荧光定量法的检测起始浓度平均值低17％，超出正常的误差范围，说明用该保护剂会造成后续实验数据的真实性。图9中比较了RNAstable和0.5M海藻糖对荧光定量法检测的影响，纵轴代表exRNA在Qubit3.0的平均读值。实施例100.5M海藻糖溶液和RNAstable对反转录反应效率的影响exRNA的定量和文库构建都依赖于将exRNA反转录成cDNA。以LifeTech公司的反转录试剂盒和说明书中的反应条件，反应体系中含有1μl的10×RTbuffer，1μl的2.5mMdNTPs，0.5μl的M-MLV反转录酶，0.1μl的RNase抑制剂，1μlRandomprimer，0.1-1μg的exRNA并定容至20μl反应体系。在总反应体系中分别加入占总体积为0％，5％，10％，20％，50％的0.5M海藻糖溶液或RNAstable溶液。其中不加入0.5M海藻糖溶液或RNAstable溶液的反应体系为阳性对照组。反转录反应条件为60℃加热5分钟，冰上孵育5分钟，42℃反应30分钟，85℃终止反应5分钟，最后恢复至室温。反应所得的cDNA进一步进行荧光定量PCR反应进行验证。LifeTech公司的SYBRGreenMasterMix，12.5μl，2μlcDNA模板，10mMlet-7a的正反向引物各0.5μl，PCR反应体系最终定容在25μl。具体荧光定量PCR反应过程为95℃10分钟，95℃15秒，60℃10秒，72℃10秒，以上三步循环40次，每个反应独立重复3次，最后72℃5分钟，95℃5分钟并最终恢复至室温。每个循环的荧光强度和最后的产物溶解曲线记录在ABI7500fast荧光定量PCR工作软件中。最终结果以36个循环数的模板计数为0，以不含0.5M海藻糖溶液和RNAstable溶液的反应值为100％，由此生成不同体积比的0.5M海藻糖溶液或RNAstable溶液的反转录反应效率。从图10中发现，5％的RNAstable溶液对反转录效率开始产生影响，20％以上的RNAstable溶液完全抑制了反转录的进行，从5％到50％的0.5M海藻糖溶液都不会抑制反转录的进行，而且加入高于20％的0.5M海藻糖还能够一定程度提高反转录的效率，由此说明exRNA作为模板时，加入0.5M的海藻糖不会影响反转录效率。图10中横轴代表海藻糖(浅灰色圆圈)或RNAstable(黑色空心圆圈)占总反应体系的百分比，纵轴代表加入海藻糖(浅灰色圆圈)或RNAstable(黑色空心圆圈)后的反转录效率和阳性对照的比。实施例110.27M海藻糖溶液中加入不同浓度Tris对反转录反应效率的影响pH值对RNA的水解有明显的影响，强碱性环境会造成核酸的水解，酸性pH的溶液则有助于保护RNA的稳定性。Tris是常用的用于稳定pH值的溶液成分，在海藻糖溶液中加入Tris可能会对下游的exRNA反转录实验造成影响。为便于比较Tris对反转录反应效率的影响，0.27M的海藻糖溶液加入不同浓度的Tris，保证pH值在8.0(PH5.2-8.0之间均可以，本实施例中取8.0)，根据实施例9中的检验反转录反应效率方法，用合成的cDNA中的let-7a的分子数目的相对定量来衡量反转录反应效率，同样使用LifeTech的反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂及其配套的ABI7500fast荧光定量PCR仪。exRNA分别溶于加入了0mM，0.1mM，0.5mM，1mM，10mM，20mM和100mMTris的0.27M海藻糖溶液中，反转录反应体系和条件，荧光定量PCR反应体系和条件与实施例9完全一致。结果仍然以36个循环数的模板计数为0，不同浓度的Tris对反转录反应效率的影响如图11。从图11中可以看出，加入高达100mM的Tris对反转录不产生任何影响，而低于0.1mM的Tris同样不影响反转录的进行，由此说明是否加入Tris不会影响exRNA的生化性质，更多是因为0.27M的海藻糖已经能够稳定exRNA的结构。图11中横轴代表加入Tris的浓度，纵轴代表let-7a的Ct值。实施例120.27M海藻糖溶液中加入不同浓度EDTA对反转录反应效率的影响EDTA是二价金属离子的螯合剂，常见的核酸酶在水解RNA时需要二价金属离子催化，因此EDTA能够阻断二价金属离子在溶液中的游离，阻断核酸酶的水解活性。因此海藻糖溶液中加入EDTA可以提高对exRNA的保护能力。但是EDTA的加入可能会对下游的exRNA反转录实验造成影响。为便于比较EDTA对反转录反应效率的影响，不同浓度的EDTA加入0.27M的海藻糖溶液，根据实施例9中的检验反转录反应效率的方法，用合成的cDNA中的let-7a的分子数目的相对定量来衡量反转录反应效率，同样使用LifeTech的反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂及其配套的ABI7500fast荧光定量PCR仪。exRNA分别溶于加入了0mM，0.01mM，0.02mM，0.05mM，0.1mM，0.2mM，0.5mM，1mM，5mM和10mM的EDTA的0.27M海藻糖溶液中，反转录反应体系和条件，荧光定量PCR反应体系和条件与实施例9和10完全一致。结果仍然以36个循环数的模板计数为0，不同浓度的EDTA对反转录反应效率的影响如图12。从图12中可以看出，加入0.5mM的EDTA对反转录开始产生抑制作用，在EDTA浓度高于1mM以后对反转录产生强烈抑制，而低于0.2mM的EDTA不影响反转录的进行，由此说明加入EDTA会影响exRNA作为模板的反转录的反应效率，其中0.2mMEDTA的加入是临界值，高于该值会对下游形成显著抑制作用。图12中横轴代表加入EDTA的浓度，纵轴代表let-7a的Ct值。实施例13冻干exRNA后保存时间影响文库构建过程中PCR反应成功率目前广泛的研究表明，exRNA在二代测序应用中能够预测肿瘤的发病进展，因此将exRNA制备成可用于二代测序仪读取的文库是非常重要的。在这过程中，PCR的成功率对文库构建的成功与否起到关键作用。将实施例2和3中exRNA从冻干状态恢复到纯水溶液后，分别先用NEB公司的单链RNA连接酶对exRNA样本进行连接实验，随后用接头分子作为引物进行PCR扩增，PCR的成功率以每个EP管中扩增出大于200bp的产物占所有扩增产物的比例为衡量标准，每个EP管中连接反应和扩增反应独立重复三次。该读数来自天能公司的凝胶成像软件分析对PCR扩增产物的PAGE电泳图进行密度和片段产物分析所得。如图13中显示，横轴代表不同保护剂分别在不冻干条件下，冻干室温保存1个月后，冻干2℃—8℃保存6个月后，冻干-20℃保存18个月后。纵轴代表三次独立重复实验中每次每EP管中的PCR成功率。在未冻干的情况下，PCR成功率都在90％—95％之间，说明该PCR正常的实验误差在5％左右，而冻干室温保存后的PCR成功率是低于低温保存的，其中-20℃保存后的PCR仍然可以达到90％以上的成功率。和0.5M的海藻糖溶液相比，冻干在RNAstable中的exRNA的PCR成功率要低13％—20％左右。而0.5M的海藻糖溶液冻干保存不同的时间后的exRNA的PCR效率仍能维持在88％以上，说明海藻糖确实能够在当今二代测序日新月异的发展中，起到长期保存样本的作用。实施例14不同保存时间内的exRNA降解程度的定量研究在实际的临床应用中，exRNA样本多数在ng或pg的数量级，常见的荧光定量PCR已经可以对pg级的RNA给出肿瘤早期诊断、个性化治疗和预后的相应信息。但是目前临床上对于微量甚至痕量exRNA的溶解保存或者冻干保护中的不适当方法，会直接影响鉴定结果的准确性和可行性。临床最常见的是将exRNA溶解在纯水中分装成不同的体积保存在低温冰箱中。这正如先前的实验中所证明的那样，反复冻融含量很低的exRNA会造成不同程度的物理损伤直至降解。本实施例的具体做法为，溶于加入RNase抑制剂的0.5M海藻糖溶液的exRNA等分成三份，溶于加入RNase抑制剂的RNAstable的exRNA等分成三份，以上六份exRNA样本分别置于室温下冻干状态1个月，2℃-8℃下冻干状态6个月并在这段时间内反复冻干4次和-20℃下冻干状态18个月并在这段时间内反复冻干4次。这段时间后用Qubit3.0对exRNA样本进行测定。结果显示在RNAstable中冻干的exRNA样本均出现不同程度的降解，其中室温保存的exRNA样本低于Qubit荧光定量法检测的极限，出现可见的明显降解。但是Qubit荧光定量法能够检测很短片段的RNA，因此降解的全貌并不能在Qubit的读数中完全体现，这也说明exRNA的质量不能只用浓度来衡量，exRNA的完整性也是非常重要的衡量exRNA质量的参数。我们使用的0.5M含有RNase抑制剂的海藻糖溶液能够避免反复冻干给exRNA带来的损伤。RNase对RNA的降解对片段长度不同的exRNA来说也是随机的，因此exRNA中的微小RNA数目能够准确反映exRNA样本的降解程度，这也是之前的实施例中采用let-7a这种exRNA中富含的微小RNA作为各项数据的考核标准。微小RNA是一类具有19-22nt，该类RNA的定量要求其必须保持完整结构，序列的任何改变都会引发检测微小RNA拷贝数的改变。我们使用的肿瘤细胞系中都是富含let-7a和miR-21，例如1pg的H332细胞外RNA含有超过2000个miR-21和超过3500个let-7a，这类微小RNA的分子数的降低能够指示exRNA的降解程度。在降解实验进行到第7天时，我们对不同保护剂中exRNA的let-7a和miR-21分子数进行相对定量分析。RNAstable在室温下的exRNA总量降至起始量的约50％，2℃-8℃下的exRNA总量降至起始量的约65％，-20℃下的exRNA总量降至起始量的约80％。而0.5M海藻糖在不同温度和保存时间内的exRNA总量均未出现明显降解。由此说明用微小RNA的分子数目比单独参考exRNA的浓度更能反映exRNA的整体性质。图14为exRNA降解实验中let-7a和miR-21的分子拷贝数的变化统计图。实施例15冻干的exRNA在长途运输后的微小RNA含量分析实验SW1910，H332和Hela细胞的exRNA分别经过Trizol提纯后，以10ng/μl的浓度溶解于0.5M海藻糖溶液中并冻干成固态。这批样本以干粉形式运往美国UCLA的癌症研究中心(根据海关和航空相关法规中，干粉样本可以用于空运和海关清关)，从国内FedEx收件到癌症研究中心签收共计历时23天。随后被试样本保存于-20℃冰箱中直至用于AgilentBioanalyzer2100上机分析。微小RNA的含量分析由UCLA的癌症研究中心平台实验室完成。电泳分析结果见图15。这批长距离跨国运输的6个exRNA样本中的微小RNA含量(用于衡量RNA降解程度)见图16。该实验中所用试剂为Agilent公司的smallRNAchip。从图14中可以看出微小RNA占整个exRNA的含量均高于50％，符合目前国际主流研究结论exRNA中超过一半为微小RNA，结果说明寄送的六个样本均在这一过程中保存完好，由此说明海藻糖溶液用于国际间的样本学术或临床交流是十分便利的。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3