一种利用固定化氢过氧化物裂解酶连续化制备天然香料的方法及其装置与流程

本发明涉及一种利用固定化氢过氧化物裂解酶将不饱和脂肪酸转化为天然香料的方法，属于生物香料制备技术领域。

背景技术：

本发明涉及制备多元不饱和脂肪酸降解产物的过程。这些降解产物是挥发性的天然风味物质，这些物质主要包括反式-2-己烯醛、顺-3-己烯醛、己醛等，是新鲜果蔬独特绿色清新气味的重要贡献者，因此又被称为“绿色信号”。目前为止，C6醛已经被广泛应用于日化工业、食品行业以及香水制品等产业中。

巨大的市场需求促使研究人员展开了大量针对C6醛生产的研究。一般而言，通过化学合成的手段获得大量稳定的C6醛是最简单也是最为直接的方法。然而在食品领域，天然手段得到的添加剂或香精香料产品更容易受到消费者的青睐。就同一种产品而言，天然产品的市场销售价格远高于化学合成品。

天然清香型香精香料的传统制备方法是直接从植物原料中提取获得，例如薄荷精油的蒸馏。但是这一方法目前也面临着诸多问题而难以满足工业化生产的需求，从而使得模拟植物体内的代谢途径，酶法催化游离不饱和脂肪酸的氧化反应及其随后的降解反应以制备己醛、己烯醛等C6醛类的方法具有很强的吸引力。

近年来，人们开始尝试通过酶法来合成醛类物质，如中国专利AN1563310A公开了一种酶催化生产烯醛类香料的方法，该法以C18-C20多远不饱和脂肪酸为原料，以从天然植物组织中提取的脂肪氧合酶与氢过氧化物裂解酶组成的酶系为催化剂，在室温15-25℃条件下，使多元不饱和脂肪酸转移地酶催化裂解成烯醛类香料。中国专利CN101225406A涉及一种利用番石榴组织中存在的酶合成天然香料的方法，该方法提供一种以亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸等具有顺顺-1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸为底物，利用番石榴组织中存在的脂肪氧合酶和氢过氧化物裂解酶降解底物，合成具有天然风味香料的方法。目前为止，氢过氧化物裂解酶的不稳定性及其反应的复杂性一直是导致产物产量过低(<20mg/L)并制约此生物合成途径实现工业化的关键因素。

技术实现要素：

本发明目的之一是提供一种连续化制备亚油酸脂质代谢产物的方法，尤其是通过固定化氢过氧化物裂解酶的催化作用将亚油酸氢过氧化物降解产生天然香料物质。

发明包括以下几个步骤：

1、脂肪酸氢过氧化物的制备：通过LOX反应制备脂肪酸氢过氧化物(HPOs)。0.1M游离亚油酸分散于pH 9.0的硼酸盐缓冲液中(0.2M)，于发酵罐中4℃下搅拌均匀后加入LOX、通氧并加压至0.3MPa进行反应。1.5h之后结束反应并取一定量产物经乙醇稀释后在234nm测定其紫外吸光度，然后根据摩尔吸光系数计算反应液中HPOs的浓度(ε＝25000cm^-1M^-1)。最后将反应产物溶液置于4℃条件下冷藏待用。

2、苋菜氢过氧化物裂解酶的提取：去掉根和茎之后，将新鲜苋菜叶切碎并与pH 8.5的Tris-HCl缓冲液(0.1M并含有0.5％(m/v)PVP K-30)按照1:3的比例混合，均浆1min(10s×6)。四层纱布过滤之后所得滤液在4℃下18000×g离心30min。离心沉淀加入一定量的磷酸盐缓冲液(PBS，0.02M，pH 6.8)，PBS中含10mM DTT以及0.5％(v/v)Triton X-100。4℃下搅拌1h之后于同样温度下18000×g离心30min，所得上清液经30％硫酸铵沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述含有DTT以及Triton X-100的PBS中，即得游离HPL粗酶液。

3、壳聚糖复合水凝胶的制备方法如下：

a.将壳聚糖和γ-卡拉胶加入到的乙酸溶液中并搅拌至完全溶解，得到混合溶液。

b.使用注射器将步骤a所得混合溶液逐滴滴入NaOH溶液中并搅拌形成直径为1–2mm的水凝胶微球。

c.在步骤b所得水凝胶微球中加入过量戊二醛，得到醛基活化水凝胶微球。

d.在步骤c所得醛基活化水凝胶微球中加入1，6-己二胺。

e.过滤得到表面连接着1，6-己二胺的壳聚糖复合水凝胶微球。

步骤a所述混合溶液中含有壳聚糖2.5wt％～7.5wt％；γ-卡拉胶2.5wt％～7.5wt％；乙酸溶液5％～25％v/v。

步骤b所述NaOH溶液的浓度为0.5M～2.5M，混合溶液与NaOH溶液的体积比1:5～10；所述搅拌过程：搅拌转速为10～50rpm，搅拌时间为1～5天。

步骤d所述1，6-己二胺的添加量为1，6-己二胺：壳聚糖中-NH₂摩尔比＝0.5～1.0:1。

4、壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶：

(一)将壳聚糖复合水凝胶微球浸入EDC水溶液中，然后加入含有HPL的PBS溶液，之后于4～10℃下震荡10～30min，过滤，得到壳聚糖复合水 凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶。

(二)用PBS及去离子水清洗壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶。清洗的目的是将其他的杂质洗去，因此清洗次数可以根据需要调整，通常清洗两次即可。

(三)清洗过后的壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶，重新悬浮于PBS中，4℃条件下贮存待用。

步骤(1)所述复合液中壳聚糖复合水凝胶微球与EDC的摩尔比为1:1～10；HPL与壳聚糖复合水凝胶微球的摩尔比为1:1。

5、己醛的连续化制备：用于己醛连续化制备的填充床柱式反应器如图1所示。4～20U的壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶被填充于长200～500mm，直径10.5～20mm的玻璃柱中。反应器的温度通过外部的循环水浴夹套控制为30～40℃。将浓度为10～50mM的13-HPOD溶液(0.02～0.2M PBS，pH 4.0～6.5含有1～3mM DTT)通过蠕动泵连续地加入到反应柱中。当体系达到稳定的时候开始收集流出液并测定其中C6醛的产量。

产物定量分析：使用顶空气相色谱法(HS-GC)测定生成的醛类物质。具体的检测步骤如下：与分光光度检测法相同的反应溶液经2min的保温之后迅速将酶灭活。反应产物使用气相色谱仪进行测定，即待测样品迅速转移至气相顶空进样器，70℃下保温平衡30min并自动进样。空白为只含游离 粗酶液或固定化酶的PBS。反应生成的己醛浓度通过以下公式进行计算：

C_s＝A_s/A₀×C₀

其中，A_s为反应样品峰面积；A₀为标准样品峰面积；C_s为反应样品浓度；C₀为标准样品浓度。

本发明目的之二是提供了一种填充床柱式反应器，将壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶用于芳香性风味成分C6醛的连续化制备，该装置由柱式原料容器(1)、导管(2)、蠕动泵(3)、循环水浴夹套装置(4)、反应器(5)和产品收集容器(6)组成。

原料容器(1)顶部通过导管(2)与蠕动泵(3)尾部相连，蠕动泵(3)顶部通过导管(2)与反应器(5)的底部相连，反应器(5)的外部夹有循环水浴夹套装置(4)，反应器(5)的顶部通过导管(2)与产品收集容器(6)的顶部相连。

反应器(5)为低压玻璃柱，其长为200～500mm，直径为10.5～20mm。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1)本发明所采用的壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶显著提高了产物的单位体积产量。

2)与游离酶搅拌式批次反应方式相比，本发明所采用的己醛连续化制备方法在提高反应单位体积产量最高可使己醛单位体积产量达到3560±102.1 并降低了反应过程中的需酶量。

3)本发明所设计的柱式反应器可实现己醛的连续化制备，整个制备过程操作简单，易于控制且成本较低。

附图说明

图1使用固定化氢过氧化物裂解酶连续化生产己醛的简图。

图2柱式反应器中酶用量对己醛单位体积产量的影响。

图3柱式反应器中酶用量对底物转化率的影响。

图4柱式反应器中底物浓度对需酶量的影响。

图5柱式反应器中底物浓度对转化率的影响。

具体实施例

下面通过具体实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例仅仅是用于本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的改进或简化都属于本发明要求保护的范围。

本发明脂肪酸氢过氧化物的制备方法为：通过LOX反应制备脂肪酸氢过氧化物(HPOs)。0.1M游离亚油酸分散于pH 9.0的硼酸盐缓冲液中(0.2M)，于发酵罐中4℃下搅拌均匀后加入LOX、通氧并加压至0.3MPa进行 反应。1.5h之后结束反应并取一定量产物经乙醇稀释后在234nm测定其紫外吸光度，然后根据摩尔吸光系数计算反应液中HPOs的浓度(ε＝25000cm-1M-1)。最后将反应产物溶液置于4℃条件下冷藏待用。

本发明苋菜氢过氧化物裂解酶的提取方法为：去掉根和茎之后，将新鲜苋菜叶切碎并与pH 8.5的Tris-HCl缓冲液(0.1M并含有0.5％(m/v)PVP K-30)按照1:3的比例混合，均浆1min(10s×6)。四层纱布过滤之后所得滤液在4℃下18000×g离心30min。离心沉淀加入一定量的磷酸盐缓冲液(PBS，0.02M，pH 6.8)，PBS中含10mM DTT以及0.5％(v/v)Triton X-100。4℃下搅拌1h之后于同样温度下18000×g离心30min，所得上清液经30％硫酸铵沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述含有DTT以及Triton X-100的PBS中，即得游离HPL粗酶液。

本发明C6醛产物定量分析的方法为：使用顶空气相色谱法(HS-GC)测定生成的醛类物质。具体的检测步骤如下：与分光光度检测法相同的反应溶液经2min的保温之后迅速将酶灭活。反应产物使用气相色谱仪进行测定，即待测样品迅速转移至气相顶空进样器，70℃下保温平衡30min并自动进样。空白为只含游离粗酶液或固定化酶的PBS。反应生成的己醛浓度通过以下公式进行计算：

C_s＝A_s/A₀×C₀

其中，A_s为反应样品峰面积；A₀为标准样品峰面积；C_s为反应样品浓度；C₀为标准样品浓度。

实施例1

制备壳聚糖复合水凝胶：将2.5g壳聚糖和2.5gγ-卡拉胶加入到100g含有5％v/v的乙酸溶液中并搅拌至完全溶解，得到混合溶液。随后使用注射器逐滴滴加50ml混合溶液至500ml浓度为0.5M的NaOH溶液中并缓慢搅拌(50rpm)1天，以形成直径为1–2mm的水凝胶微球。使用过量的戊二醛活化水凝胶微球表面的氨基以引入醛基，随后加入7.75mmol的1，6-己二胺，反应后1，6-己二胺(HMDA)通过活性醛基被连接在壳聚糖复合水凝胶微球的表面。

氢过氧化物裂解酶的固定化：将15.5mmol表面连接着1，6-己二胺(HMDA)的壳聚糖复合水凝胶微球浸入300ml含有155mmol EDC的水溶液中，然后加入100ml含有15.5mmol HPL的PBS溶液，之后于4℃震荡30min，过滤，得到壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶；用PBS及去离子水清洗壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶两次；清洗过后的壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶，重新悬浮于PBS中，4℃条件下贮存待用。壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶的稳定性大幅提高。

己醛的连续化制备：用于己醛连续化制备的填充床柱式反应器如图1所示。18U的壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶被填充于长200mm，直径10.5mm的玻璃柱中。反应器的温度通过外部的循环水浴夹套控制为30℃。将浓度为50mM的13-HPOD溶液(0.02M PBS，pH 6.5含有1mM DTT)通过蠕动泵连续地加入到反应柱中。当体系达到稳定的时候开始收集流出液并测定其中C6醛的产量。

由表1可知，与游离酶搅拌式批次反应方式相比，本发明所采用的柱式连续化反应提高了反应过程中产物的单位体积产量以及单位酶活产量并降低了反应过程中的需酶量。

表1生成1g己醛所需要的苋菜原料

实施例2

制备壳聚糖复合水凝胶：将7.5g壳聚糖和7.5gγ-卡拉胶加入到100g含有25％v/v的乙酸溶液中并搅拌至完全溶解，得到混合溶液。随后使用注射器逐滴滴加50ml混合溶液至250ml浓度为2.5M的NaOH溶液中并缓慢 搅拌(10rpm)5天，以形成直径为1–2mm的水凝胶微球。使用过量的戊二醛活化水凝胶微球表面的氨基以引入醛基，随后加入46.56mmol的1，6-己二胺，反应后1，6-己二胺(HMDA)通过活性醛基被连接在壳聚糖复合水凝胶微球的表面。

氢过氧化物裂解酶的固定化：将46.56mmol表面连接着1，6-己二胺(HMDA)的壳聚糖复合水凝胶微球浸入300ml含有46.56mmol EDC的水溶液中，然后加入100ml含有46.56mmol HPL的PBS溶液，之后于10℃震荡10min，过滤，得到壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶；用PBS及去离子水清洗壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶两次；清洗过后的壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶，重新悬浮于PBS中，4℃条件下贮存待用。所得壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶的稳定性大幅提高。

己醛的连续化制备：用于己醛连续化制备的填充床柱式反应器如图1所示。20U的壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶被填充于长500mm，直径20mm的低压玻璃柱中。反应器的温度通过外部的循环水浴夹套控制为40℃。将浓度为10mM的13-HPOD溶液(0.2M PBS，pH 4.0含有3mM DTT)通过蠕动泵连续地加入到反应柱中。当体系达到稳定的时候开始收集流出液并测定其中C6醛的产量。

实施例3

制备壳聚糖复合水凝胶：将3.0g壳聚糖和4.0gγ-卡拉胶加入到100g含有10％v/v的乙酸溶液中并搅拌至完全溶解，得到混合溶液。随后使用注射器逐滴滴加50ml混合溶液至400ml浓度为1.0M的NaOH溶液中并缓慢搅拌(45rpm)1.5天，以形成直径为1–2mm的水凝胶微球。使用过量的戊二醛活化水凝胶微球表面的氨基以引入醛基，随后加入18.63mmol的1，6-己二胺，反应后1，6-己二胺(HMDA)通过活性醛基被连接在壳聚糖复合水凝胶微球的表面。

氢过氧化物裂解酶的固定化：将18.63mmol表面连接着1，6-己二胺(HMDA)的壳聚糖复合水凝胶微球浸入300ml含有93.15mmol EDC的水溶液中，然后加入100ml含有18.63mmol HPL的PBS溶液，之后于5℃震荡25min，过滤，得到壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶；用PBS及去离子水清洗壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶两次；清洗过后的壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶，重新悬浮于PBS中，4℃条件下贮存待用。所得壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶的稳定性大幅提高。

己醛的连续化制备：用于己醛连续化制备的填充床柱式反应器如图1所示。4U的壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶被填充于长250 mm，直径15mm的玻璃柱中。反应器的温度通过外部的循环水浴夹套控制为35℃。将浓度为30mM的13-HPOD溶液(0.03M PBS，pH 6.0含有1.5mM DTT)通过蠕动泵连续地加入到反应柱中。当体系达到稳定的时候开始收集流出液并测定其中C6醛的产量。

由图2和图3可知，在己醛合成反应的初始阶段，产物产量及底物转化率随着壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶用量的增加而迅速增大，在酶用量为16U，底物浓度为10mM时底物转化率可达100％。

由图4和图5可知，该壳聚糖复合水凝胶微球固定化氢过氧化物裂解酶在本申请所述连续化生产过程中，底物浓度较低时连续化操作稳定性较好。