具有抗鞘翅目昆虫活性的杀虫毒素蛋白的制作方法

本申请要求2014年3月28日提交的美国临时申请序列No.61/971,855的优先权，所述申请以引用的方式整体并入本申请。

序列表的并入

含有计算机可读形式的序列表的名称为“38_21_59428_ST25.txt”的文件创建于2015年3月23日。此文件是135,562字节(如在操作系统中所测量)，同时通过电子提交方式提交(使用美国专利局EFS-Web提交系统)并且以引用的方式整体并入本申请。

发明领域

本发明总体上涉及昆虫抑制性毒素蛋白的领域。公开了展现针对农作物和种子的农业相关害虫的昆虫抑制活性的一类新颖的蛋白质。具体地说，所公开类别的蛋白质具有针对农作物和种子的农业相关害虫、具体地鞘翅目昆虫害虫的杀虫活性。提供含有编码所述毒素蛋白中的一种或多种的多核苷酸构建体的植物、植物部分和种子。

发明背景

苏云金芽孢杆菌(“Bt”)菌株是昆虫抑制性毒素蛋白的丰富来源。这些蛋白质可用于通过将含有这些蛋白质的制剂喷洒到植物上或通过在植物和种子中表达这些蛋白质来控制农作物的农业相关害虫。值得注意的是，目前仅一些毒性蛋白在商业上用于控制鞘翅目昆虫，如玉米根虫。这类当前利用的毒性蛋白包括Cry3Bb1(一种修饰的Cry3A)、eCry3.1Ab和二元毒素Cry34Ab1/Cry35Ab1(需要针对毒性活性的两种不同的蛋白质)。这些蛋白质有效用于控制侵扰玉米根的叶甲(Diabrotica)属，不论是单一利用还是呈不同组合以降低发展抗性的可能性。虽然这些蛋白质已成功地在转基因作物中利用为昆虫控制剂，但是可能发展对其作用的抗性。

对所利用的毒素(无论是化学品还是蛋白质)的抗性更可能在增强抗性发展的多种情况下发展。一般来说，抗性的发展直接依赖于毒素被利用至环境中的时间长度。抗性发展还更可能在毒素的剂量不足以确保消耗含有所述毒素的组织的单次叮咬的害虫的死亡率的情况下增加。因此，关键的是在每次叮咬递送致死剂量的毒素，否则发展对特定毒素的抗体更可能发生。在共同地理区域内或在对共同地理区域内的相同或类似害虫敏感的多种植物物种之上或之中重复使用同一毒素更可能引起对所述毒素的抗性的快速发展，特别是在在单个生长季节内存在特定目标害虫的多个传代的气候中。更靠近赤道的地理区域倾向于具有有助于植物生长和栽培的较长和更一致的光周期和气候，并且这些区域中的害虫倾向于比在暴露于减少在类似时间段遭遇的繁殖周期的数目的更剧烈气候变化的其他位置中更短的时间段内具有多个传代。出于所有前述原因，对有限数目的毒性蛋白或毒性化学品的依赖可导致发展对这些害虫控制剂的抗性。

在本领域中公开的声称展示对玉米根虫的毒性作用的其他蛋白质包括马铃薯糖蛋白、TIC100/101二元毒素、ET33/34二元毒素、TIC863、ET80/76二元毒素、ET70、Cry3Bb(美国专利No.6,501,009)、Cry1C变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、Axmi184、Axmi205、AxmiR1、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC3131、DIG-10、eHIP(美国专利申请公布No.2010/0017914)以及ω-Hexatoxin-Hv1a(美国专利申请公布US2014-0366227A1)。这些蛋白质可在后续商业实施方案中单独提供或与其他毒性剂组合提供以确保根虫抗性产物的持久性且降低抗性发展的可能性。然而，这些另外蛋白质中没有一种已被观察到提供当前利用的商业毒素蛋白所展示的针对玉米根虫的低剂量毒性作用，并且因此尚未被认为是商业上有用的。

因此，在本领域中需要发现、研发且商业利用新的毒性剂，特别是当单独使用或以与一种或多种补充毒性剂的各种组合使用时具有针对广泛昆虫害虫物种(特别是已被观察到发展对当前利用的毒素的抗性的那些害虫物种-如鞘翅目物种)的活性的环境友好的、高度选择性的和特异性的毒素蛋白或化学品。

技术实现要素：

本文提供昆虫抑制性毒素蛋白(即，TIC2463相关毒素蛋白)，所述毒素蛋白源自各种芽孢杆菌(Bacillus)物种，包括源自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(“Bt”)，所述毒素蛋白展示针对一种或多种鞘翅目植物害虫(包括但不限于科罗拉多马铃薯甲虫和玉米根虫幼虫)的出人意料的低剂量功效。本发明的毒素蛋白各自展示与彼此的实质性氨基酸序列百分比同一性并且可各自单独使用或在待施加至植物和种子表面的各种制剂中与所命名的蛋白质毒素属的其他蛋白质组合使用或通过在植物和种子中表达这些蛋白质来使用以控制目标鞘翅目害虫。

TIC2463相关毒素蛋白可从被设计用于在植物中表达的重组DNA构建体在植物中(in planta)表达以实现转基因植物的产生，所述转基因植物由于在所述转基因植物的相关细胞和组织内表达杀虫有效量的本文公开的毒素蛋白而体现抵抗鞘翅目昆虫害虫侵扰的能力。这些蛋白质可单独或彼此结合或与其他毒性蛋白和毒性剂组合用于制剂和植物中，从而提供当前用于农业系统中的已知鞘翅目毒性蛋白和杀虫剂化学品的替代物。

提供用于表达本文公开的TIC2463相关毒素蛋白的重组核酸分子。在一个实施方案中，提供包含(即，含有至少)可操作地连接至多核苷酸区段的异源启动子的重组核酸分子，所述多核苷酸区段具有编码至少一种TIC2463相关蛋白毒性部分的核苷酸序列。编码本文公开的TIC2463相关蛋白毒性部分的核苷酸序列包括在以下SEQ ID号的每个中列出的那些：SEQ ID NO:1从位置100-945、SEQ ID NO:3从位置100-939、SEQ ID NO:5从位置85-1011、SEQ ID NO:7从位置94-948、SEQ ID NO:9从位置79-978、SEQ ID NO:11从位置100-942、SEQ ID NO:13从位置100-939、SEQ ID NO:15从位置100-939、SEQ ID NO:17从位置85-1011、SEQ ID NO:19从位置85-1011、SEQ ID NO:21从位置79-978、SEQ ID NO:23从位置79-978、SEQ ID NO:25从位置100-963、SEQ ID NO:27从位置100-963、SEQ ID NO:29从位置100-963、SEQ ID NO:31从位置1-846、SEQ ID NO:33从位置1-843、SEQ ID NO:35从位置226-1065、SEQ ID NO:37从位置187-1023、SEQ ID NO:39从位置1-846、SEQ ID NO:41从位置100-939且具有占据位置781-783的除TAA、TAG或TGA以外的任何密码子、SEQ ID NO:43从位置100-945、SEQ ID NO:44从位置100-939、SEQ ID NO:45从位置85-1011、SEQ ID NO:46从位置94-948、SEQ ID NO:47从位置79-978、SEQ ID NO:48从位置1-852、SEQ ID NO:50从位置1-852、SEQ ID NO:52从位置1-852、SEQ ID NO:54从位置1-933、SEQ ID NO:56从位置100-939、SEQ ID NO:58从位置100-939以及SEQ ID NO:60从位置100-939。

用于表达每种此类TIC2463相关毒素蛋白的构建体通常将包含至少可操作地连接至编码杀虫多肽的多核苷酸区段的异源启动子。在某些构建体中，所述杀虫多肽将具有对应于用于将TIC2463相关蛋白的毒素部分分泌至亚细胞区室(例如，输入植物细胞器如叶绿体、质体、线粒体或造粉体)中的适用信号肽或可替代地适用于用于从细菌细胞质中分泌出且进入周质(在革兰氏阴性细菌的情况下)或进入细胞外空间中的细菌系统的信号肽的氨基酸的氨基末端区段。由本文所述的核苷酸序列表达的杀虫多肽将包含至少在以下中的每个中列出的成熟氨基酸序列：如在SEQ ID NO:2从氨基酸位置34-315、SEQ ID NO:4从氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:6从氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:8从氨基酸位置34-316、SEQ ID NO:10从氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:12从氨基酸位置34-314、SEQ ID NO:14从氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:16从氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:18从氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:20从氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:22从氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:24从氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:26从氨基酸位置34-321、SEQ ID NO:28从氨基酸位置34-321、SEQ ID NO:30从氨基酸位置34-321；SEQ ID NO:32从氨基酸位置1-282；SEQ ID NO:34从氨基酸位置1-281；SEQ ID NO:36从氨基酸位置76-355；SEQ ID NO:38从氨基酸位置62-341；SEQ ID NO:49从氨基酸位置1-283；SEQ ID NO:51从氨基酸位置1-283；SEQ ID NO:53从氨基酸位置1-283；SEQ ID NO:55从氨基酸位置1-310；SEQ ID NO:57从氨基酸位置34-313；SEQ ID NO:59从氨基酸位置34-313以及SEQ ID NO:61从氨基酸位置34-313中列出的氨基酸序列。提及成熟氨基酸序列意图指所述蛋白质是从编码前体蛋白质的核苷酸序列表达的，即包含成熟区段以及展示长度为约25至约35个氨基酸(在细菌或酵母表达系统的情况下)或长度为约25至约80个氨基酸(在植物或酵母表达系统的情况下)的可操作地连接的N末端氨基酸区段的蛋白质。所述N末端区段是使相关蛋白质的成熟毒素部分靶向至周质或细胞外空间(参考细菌或酵母表达系统)或至亚细胞区室如线粒体、叶绿体、质体、液泡或造粉体(在植物或酵母表达系统的情况下，如适用的情况下)所需的。

本文所述的蛋白质将从包含至少可操作地连接至编码杀虫多肽的多核苷酸区段的异源启动子(不与天然毒素编码序列天然相关的启动子)的构建体表达。所述杀虫多肽将包含与如在SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、49、51、53、55、57、59和61中的任一个中列出的氨基酸序列具有至少44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。异源启动子可以是从本发明的开放阅读框(“ORF”)中的任一个的5’端获得的用于在芽孢杆菌宿主细胞中表达的天然Bt启动子。

本文所述的编码TIC2463相关毒素的多核苷酸区段将杂交至编码任何其他TIC2463相关毒素的任何其他多核苷酸区段。使用本文所述的多核苷酸序列的杂交方法适用于检测具有TIC2463相关毒素编码序列的细菌菌株且适用于检测包含编码TIC2463相关毒素蛋白的开放阅读框的全部或一部分的克隆的DNA区段。杂交(Hybridization)或杂交(hybridize)意图指在严格杂交条件下，通过反向补体比对进行的两个不同多核苷酸分子(无论是DNA与DNA、RNA与RNA或DNA与RNA)的非共价键合。彼此杂交的两个多核苷酸分子将各自具有沿杂交部分的长度展示与彼此的至少约50％同一性的核苷酸序列。本文所述的对应于芽孢杆菌序列的分子特别适用于检测和鉴别其他紧密相关或远缘相关的TIC2463相关毒素蛋白家族成员。特别有用的杂交条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl和1％SDS中在约37℃下杂交4至12小时，以及在0.1x SSC中在约60℃至约65℃的温度下洗涤。

本文所述的重组核酸分子可具有核苷酸序列，所述核苷酸序列任选地：

a)为已被设计用于在植物中表达的合成序列；

b)选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、

19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、43、44、45、46、47、48、50、52、54、56、58和60；

c)在植物细胞中表达；或

d)还包含编码异源多肽的核苷酸序列。

本文所述的重组核酸分子可存在于宿主细胞内(转基因、重组或转化的宿主细胞，即不天然地包含这种重组核酸分子的细胞)。所述宿主细胞意图包括但不限于细菌宿主细胞、真菌宿主细胞和植物宿主细胞。所述植物宿主细胞通常存在于植物、植物组织如木质部、韧皮部、叶、茎、花或花部分(包括雌蕊、雄蕊、花瓣、雌性配子或花粉或其等效物)、根或种子。所述植物、植物组织或种子意图包括但不限于玉米、高粱、小麦、卷心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、土豆、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、任何水果或蔬菜、任何产种子或坚果植物以及油菜(oilseed rape)(油菜(canola))。

TIC2463相关多肽将展示杀虫活性。所述多肽将优选地展示如在SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、49、51、53、55、57、59和61的序列中的每个中列出的成熟氨基酸序列或将展示与这些代表性氨基酸序列中的任一个至少约44％至约99％或甚至约100％氨基酸序列同一性。氨基酸的成熟区段在以下区段中例示：SEQ ID NO:2从氨基酸位置34-315、SEQ ID NO:4从氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:6从氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:8从氨基酸位置34-316、SEQ ID NO:10从氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:12从氨基酸位置34-314、SEQ ID NO:14从氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:16从氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:18从氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:20从氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:22从氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:24从氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:26从氨基酸位置34-321、SEQ ID NO:28从氨基酸位置34-321、SEQ ID NO:30从氨基酸位置34-321；SEQ ID NO:32从氨基酸位置1-282；SEQ ID NO:34从氨基酸位置1-281；SEQ ID NO:36从氨基酸位置76-355；SEQ ID NO:38从氨基酸位置62-341、SEQ ID NO:49从氨基酸位置1-283、SEQ ID NO:51从氨基酸位置1-283、SEQ ID NO:53从氨基酸位置1-283、SEQ ID NO:55从氨基酸位置1-310、SEQ ID NO:57从氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:59从氨基酸位置34-313以及SEQ ID NO:61从氨基酸位置34-313。

重组TIC2463相关多肽可包含异源氨基酸序列，即，不天然存在于TIC2463相关蛋白内的序列。例如，TIC2463相关毒素蛋白可进行修饰以包含相对于天然存在于所述蛋白质序列内的氨基酸位置保守的氨基酸。熟练的技术人员将了解所允许的取代并且能够针对特定蛋白质耐受这类取代而不损害TIC2463相关毒素蛋白的毒性特性的能力进行测试。多种TIC2463相关毒素蛋白可取得且比对以构建由两种或更多种不同的TIC2463相关毒素蛋白的部分组成的嵌合体。例如，TIC2463(SEQ ID NO:4)的一部分可被TIC1825(SEQ ID NO:2)的相应部分取代，如通过两种不同蛋白质的比对所测定，从而产生展示相对于所述部分所源自的原始蛋白质相同或改进的毒性特性的嵌合蛋白质。

考虑了包含TIC2463相关毒素蛋白或其变体的组合物。所述组合物可被配制成粉末、粉尘、球粒、颗粒、喷雾、乳液、胶体或溶液，各自呈农业上可接受的制剂形式以用于局部施加至植物、植物部分、土壤或用作种子包衣或种子处理。所述组合物可通过表达重组TIC2463或相关蛋白的细菌细胞的培养物的干燥、冻干、均质化、萃取、过滤、离心、沉降或浓缩来制备。这类细菌细胞包括但可不限于根定殖细菌如土壤杆菌属(Agrobacterium)或根瘤菌属(Rhizobium)、各种芽孢杆菌属包括苏云金芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等、大肠杆菌等。还可以可能的是在酵母或昆虫细胞培养物系统如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastorus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisea)或草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)中产生这类组合物。所述组合物将包含约1重量％至约99重量％的TIC2463相关毒素蛋白。

提供用于使用TIC2463相关毒素蛋白控制鞘翅目害虫群体的方法。每种此类方法依赖于使靶向鞘翅目害虫与杀虫/杀虫有效量的毒素蛋白相接触。通常，所述接触步骤将在提供至害虫的饲料中提供有效量的毒素蛋白，所述饲料呈所述毒素蛋白已覆盖或所述毒素蛋白已与其相互混合的人工饲料的形式。或者，所述饲料可以是表达杀虫有效量的毒素蛋白的植物。所述植物的细胞将被目标害虫摄取。优选地，所述饲料的单次叮咬将足以引起目标害虫的发病、死亡、繁殖力下降(fecundicity)或萎缩。

提供用于产生TIC2463相关毒素蛋白的方法。通常，获得并且在有助于表达和累积足够量的毒素蛋白的条件下培养转化成包含编码前体TIC2463或相关蛋白的构建体的宿主细胞。所述毒素蛋白可在宿主细胞中累积或可分泌至围绕宿主细胞的细胞外空间中。在任何情况下，如此产生的毒素蛋白可使用本领域中已知的方法捕获且配制(按原样)或从宿主细胞或从培养基纯化。所述纯化的毒素蛋白或前体然后可用作各种饲料组合物中的样品且与其他毒素蛋白或毒性剂相比以各种浓度使用，以用于与其他TIC2463相关毒性蛋白比较，并且尤其用于产生用于特异性结合的抗体或类似试剂(如抗体、抗体结合片段(f-Ab’s)、凝集素、脂质运载蛋白、半胱氨酸结蛋白、α体等)。

提供转基因或重组植物，所述转基因或重组植物具有编码本发明的一种或多种TIC2463相关毒素蛋白的稳定地并入植物基因组或并入植物叶绿体基因组的DNA构建体。所述植物展示鞘翅目害虫抗性的性状。来自所述植物的种子可增加，只要所述种子也包含编码TIC2463或相关毒素蛋白的特定DNA构建体，并且所述增加的种子可用于育种计划中以使鞘翅目抗性性状基因渗入类似植物的其他品种/种质，通过将所述植物和种子与同一品种的含有其他重组性状如另外鞘翅目抗性性状(例如，对玉米根虫或科罗拉多马铃薯甲虫、跳甲、象甲虫、金针虫等的抗性)、鳞翅目抗性性状、半翅目和同翅目抗性性状、线虫纲抗性性状、真菌抗性性状、除草剂耐受性性状(如对麦草畏、草甘膦、保试达(basta)、草铵膦、2,4-D等的耐受性)，以及产率和应力、水利用、氮利用效率，以及本领域中已知的其他转基因性状的其他转基因植物一起培育来杂交。

所述植物被保护免于鞘翅目昆虫害虫侵扰并且可通过与含有其他性状的不同转基因事件一起培育而组合。或者，其他性状可作为另外的DNA构建体包含于连接至含有TIC2463相关毒素蛋白编码区段的构建体的载体中(载体堆叠或相关性状)，从而有助于出于育种目的降低成本且增加效率。

不同于TIC2463相关毒性蛋白的对鞘翅目物种毒性的化学剂和蛋白质毒性剂可以与本文所述的蛋白质的各种组合采用(植物内和植物离体)。化学剂可选自由以下组成的组：有机氯化物、有机磷酸酯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、新烟碱、莱恩碱(ryanoid)以及靶向在被靶向以用于控制的植物害虫中抑制的特异性基因的dsRNA分子。蛋白质毒性剂可选自由以下组成的组：马铃薯糖蛋白、TIC100/101二元毒素、ET33/34二元毒素、TIC863、ET80/76二元毒素、ET70、Cry3Bb(美国专利No.6,501,009)、Cry1C变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、Axmi184、Axmi205、AxmiR1、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC3131、DIG-10、eHIP以及ω-Hexatoxin-Hv1a毒素蛋白和用于控制鳞翅目或半翅目植物害虫的Cry蛋白毒素。

在本文具体涵盖用于增加从植物产生的种子、水果、浆果、坚果、蔬菜、油或棉绒作物的产率的方法。任何这种方法包括至少在田地中种植植物。一般来说，所述植物包含稳定地并入所述植物的细胞的基因组中的DNA构建体。所述构建体编码杀虫蛋白，所述杀虫蛋白包含至少选自由以下组成的组的氨基酸序列：如在SEQ ID NO:2从氨基酸位置34-315、SEQ ID NO:4从氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:6从氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:8从氨基酸位置34-316、SEQ ID NO:10从氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:12从氨基酸位置34-314、SEQ ID NO:14从氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:16从氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:18从氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:20从氨基酸位置29-337、SEQ ID NO:22从氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:24从氨基酸位置27-326、SEQ ID NO:26从氨基酸位置34-321、SEQ ID NO:28从氨基酸位置34-321、SEQ ID NO:30从氨基酸位置34-321、SEQ ID NO:32从氨基酸位置1-282、SEQ ID NO:34从氨基酸位置1-281、SEQ ID NO:36从氨基酸位置76-355、SEQ ID NO:38从氨基酸位置62-341、SEQ ID NO:49从氨基酸位置1-283、SEQ ID NO:51从氨基酸位置1-283、SEQ ID NO:53从氨基酸位置1-283、SEQ ID NO:55从氨基酸位置1-310、SEQ ID NO:57从氨基酸位置34-313、SEQ ID NO:59从氨基酸位置34-313以及SEQ ID NO:61从氨基酸位置34-313中列出的氨基酸序列。所述TIC2463相关毒素蛋白展示与在SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、49、51、53、55、57、59和61中列出的成熟毒素蛋白中的任一个至少约44％至约100％氨基酸序列同一性。在这类条件下生长的植物理想地暴露于受害虫侵扰的田地，所述TIC2463相关毒素蛋白具有针对所述害虫的杀虫活性并且所述植物被保护免于侵扰。

本文还提供重组杀虫多肽，所述杀虫多肽包含与SEQ ID NO:4的至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、97％或99％同一性，并且还包含在饲料生物测定中与以下相比高至少约1.5、2、3、4、5、6、10、15、25或50倍的杀虫活性：TIC2463、马铃薯糖蛋白、TIC100/101二元毒素、ET33/34二元毒素、TIC863、ET80/76二元毒素、ET70、Cry3Bb、Cry1C变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、Axmi184、Axmi205、AxmiR1、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC3131、DIG-10、eHIP或ω-Hexatoxin-Hv1a。在一些方面，这些重组杀虫多肽包含针对鞘翅目物种的杀虫活性。在一些方面，这些重组杀虫多肽的杀虫活性通过被称为在饲料生物测定中引起目标昆虫的50％死亡率的杀虫多肽致死浓度的LC₅₀进行测量。在其他方面，这些重组杀虫多肽的杀虫活性通过被称为在饲料生物测定中引起目标昆虫蜕皮的50％抑制的杀虫多肽浓度的MIC₅₀进行测量。

本文还提供重组杀虫多肽，所述杀虫多肽包含与SEQ ID NO:4的至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、97％或99％同一性，并且还包含等于或高于以下的植物中杀虫活性的植物中杀虫活性：TIC2463、马铃薯糖蛋白、TIC100/101二元毒素、ET33/34二元毒素、TIC863、ET80/76二元毒素、ET70、Cry3Bb、Cry1C变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、Axmi184、Axmi205、AxmiR1、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC3131、DIG-10、eHIP或ω-Hexatoxin-Hv1a。本文还提供包含前述重组杀虫多肽中的任何一种或多种的杀虫组合物。

本文还提供重组核酸分子，所述重组核酸分子包含可操作地连接至编码第一杀虫多肽的异源启动子，所述第一杀虫多肽包含与SEQ ID NO:4的至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、97％或99％同一性，并且还包含在饲料生物测定中与以下相比高至少约1.5、2、3、4、5、6、10、15、25或50倍的杀虫活性：TIC2463、马铃薯糖蛋白、TIC100/101二元毒素、ET33/34二元毒素、TIC863、ET80/76二元毒素、ET70、Cry3Bb、Cry1C变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、Axmi184、Axmi205、AxmiR1、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC3131、DIG-10、eHIP或ω-Hexatoxin-Hv1a。在一些方面，这些重组核酸分子针对植物中表达进行密码子优化。还提供包含一种或多种前述重组核酸分子的植物或其部分。在一些方面，杀虫多肽靶向这些植物的叶绿体。在其他方面，这些植物或其部分包含两种或更多种具有不同作用模式的杀虫多肽或还包含能够抑制鞘翅目物种中的必需基因的dsRNA。一方面，本文公开的包含于植物中的杀虫多肽和dsRNA对相同鞘翅目物种具有毒性。另一方面，本文公开的包含于植物中的杀虫多肽和dsRNA对不同鞘翅目物种具有毒性。

附图简述

图1示出TIC2463相关蛋白的氨基酸序列比对，使SEQ ID NO和蛋白质名称与每个特异性氨基酸序列相关，并且在图1D中以粗体字示出在实施例3中提及的氨基酸。

序列简述

SEQ ID NO:1是从苏云金芽孢杆菌物种获得的重组多核苷酸序列，所述重组多核苷酸序列编码来自在核苷酸位置1-945处的开放阅读框和翻译终止密码子的TIC1825蛋白。

SEQ ID NO:2是来自如在SEQ ID NO:1中列出的开放阅读框的TIC1825蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:3是从苏云金芽孢杆菌物种获得的重组多核苷酸序列，所述重组多核苷酸序列编码来自在核苷酸位置1-939处的开放阅读框和翻译终止密码子的TIC2463蛋白。

SEQ ID NO:4是来自如在SEQ ID NO:3中列出的开放阅读框的TIC2463蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:5是从苏云金芽孢杆菌物种获得的重组多核苷酸序列，所述重组多核苷酸序列编码来自在核苷酸位置1-1011处的开放阅读框和翻译终止密码子的TIC2461蛋白。

SEQ ID NO:6是来自如在SEQ ID NO:5中列出的开放阅读框的TIC2461蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:7是从苏云金芽孢杆菌物种获得的重组多核苷酸序列，所述重组多核苷酸序列编码来自在核苷酸位置1-948处的开放阅读框和翻译终止密码子的TIC3037蛋白。

SEQ ID NO:8是来自如在SEQ ID NO:7中列出的开放阅读框的TIC3037蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:9是从苏云金芽孢杆菌物种获得的重组多核苷酸序列，所述重组多核苷酸序列编码来自在核苷酸位置1-978处的开放阅读框和翻译终止密码子的TIC2228蛋白。

SEQ ID NO:10是来自如在SEQ ID NO:9中列出的开放阅读框的TIC2228蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:11是从苏云金芽孢杆菌物种获得的重组多核苷酸序列，所述重组多核苷酸序列编码来自在核苷酸位置1-942处的开放阅读框和翻译终止密码子的TIC3005蛋白。

SEQ ID NO:12是来自如在SEQ ID NO:11中列出的开放阅读框的TIC3005蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:13是从苏云金芽孢杆菌物种获得的重组多核苷酸序列，所述重组多核苷酸序列编码来自在核苷酸位置1-939处的开放阅读框和翻译终止密码子的TIC2593蛋白。

SEQ ID NO:14是来自如在SEQ ID NO:13中列出的开放阅读框的TIC2593蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:15是从苏云金芽孢杆菌物种获得的重组多核苷酸序列，所述重组多核苷酸序列编码来自在核苷酸位置1-939处的开放阅读框和翻译终止密码子的TIC2598蛋白。

SEQ ID NO:16是来自如在SEQ ID NO:15中列出的开放阅读框的TIC2598蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:17是从苏云金芽孢杆菌物种获得的重组多核苷酸序列，所述重组多核苷酸序列编码来自在核苷酸位置1-1011处的开放阅读框和翻译终止密码子的TIC3891蛋白。

SEQ ID NO:18是来自如在SEQ ID NO:17中列出的开放阅读框的TIC3891蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:19是从苏云金芽孢杆菌物种获得的重组多核苷酸序列，所述重组多核苷酸序列编码来自在核苷酸位置1-1011处的开放阅读框和翻译终止密码子的TIC3090蛋白。

SEQ ID NO:20是来自如在SEQ ID NO:19中列出的开放阅读框的TIC3090蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:21是从苏云金芽孢杆菌物种获得的重组多核苷酸序列，所述重组多核苷酸序列编码来自在核苷酸位置1-978处的开放阅读框和翻译终止密码子的TIC3626蛋白。

SEQ ID NO:22是来自如在SEQ ID NO:21中列出的开放阅读框的TIC3626蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:23是从苏云金芽孢杆菌物种获得的重组多核苷酸序列，所述重组多核苷酸序列编码来自在核苷酸位置1-978处的开放阅读框和翻译终止密码子的TIC2081蛋白。

SEQ ID NO:24是来自如在SEQ ID NO:23中列出的开放阅读框的TIC2081蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:25是编码在SEQ ID NO:2中列出的TIC1825氨基酸序列的氨基酸序列变体的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:26是来自如在SEQ ID NO:25中列出的开放阅读框的TIC1825变体蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:27是编码在SEQ ID NO:2中列出的TIC1825氨基酸序列的氨基酸序列变体的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:28是来自如在SEQ ID NO:27中列出的开放阅读框的TIC1825变体蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:29是编码在SEQ ID NO:2中列出的TIC1825氨基酸序列的氨基酸序列变体的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:30是来自如在SEQ ID NO:29中列出的开放阅读框的TIC1825变体蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:31是编码在SEQ ID NO:4中列出的TIC2463氨基酸序列的氨基酸序列变体的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:32是来自如在SEQ ID NO:31中列出的开放阅读框的TIC2463变体蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:33是编码在SEQ ID NO:4中列出的TIC2463氨基酸序列的氨基酸序列变体的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:34是来自如在SEQ ID NO:33中列出的开放阅读框的TIC2463变体蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:35是编码来自在核苷酸位置1-225处的开放阅读框的造粉体靶肽的多核苷酸序列，以及编码在核苷酸位置226-1065处的开放阅读框的TIC2463蛋白的合成核苷酸序列。

SEQ ID NO:36是来自如在SEQ ID NO:35中列出的开放阅读框的靶肽和TIC2463蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:37是编码来自在核苷酸位置1-183处的开放阅读框的叶绿体靶肽的多核苷酸序列，以及编码在核苷酸位置184-1023处的开放阅读框的TIC2463蛋白的合成核苷酸序列。

SEQ ID NO:38是来自如在SEQ ID NO:37中列出的开放阅读框的靶肽和TIC2463蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:39是从苏云金芽孢杆菌物种获得的重组多核苷酸序列，所述重组多核苷酸序列编码在核苷酸位置1-846处的开放阅读框和翻译终止密码子的TIC1373蛋白。

SEQ ID NO:40是来自如在SEQ ID NO:39中列出的开放阅读框的TIC1373蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:41是从蜡样芽孢杆菌物种获得的重组多核苷酸序列，所述重组多核苷酸序列编码在核苷酸位置1-780处的开放阅读框和翻译终止密码子的WP_000699779蛋白。

SEQ ID NO:42是来自如在SEQ ID NO:41中列出的开放阅读框的WP_000699779蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:43是编码TIC1825蛋白的合成核苷酸序列。

SEQ ID NO:44是编码TIC2463蛋白的合成核苷酸序列。

SEQ ID NO:45是编码TIC2461蛋白的合成核苷酸序列。

SEQ ID NO:46是编码TIC3037蛋白的合成核苷酸序列。

SEQ ID NO:47是编码TIC2228蛋白的合成核苷酸序列。

SEQ ID NO:48是编码在SEQ ID NO:2中列出的TIC1825氨基酸序列的氨基酸序列变体的合成多核苷酸序列。

SEQ ID NO:49是来自如在SEQ ID NO:48中列出的开放阅读框的TIC1825变体蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:50是编码在SEQ ID NO:2中列出的TIC1825氨基酸序列的氨基酸序列变体的合成多核苷酸序列。

SEQ ID NO:51是来自如在SEQ ID NO:50中列出的开放阅读框的TIC1825变体蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:52是编码在SEQ ID NO:2中列出的TIC1825氨基酸序列的氨基酸序列变体的合成多核苷酸序列。

SEQ ID NO:53是来自如在SEQ ID NO:52中列出的开放阅读框的TIC1825变体蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:54是编码在SEQ ID NO:6中列出的TIC2461氨基酸序列的氨基酸序列变体的合成多核苷酸序列。

SEQ ID NO:55是来自如在SEQ ID NO:54中列出的开放阅读框的TIC2461变体蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:56是编码在SEQ ID NO:4中列出的TIC2463氨基酸序列的氨基酸序列变体的合成多核苷酸序列。

SEQ ID NO:57是来自如在SEQ ID NO:56中列出的开放阅读框的TIC2463变体蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:58是编码在SEQ ID NO:4中列出的TIC2463氨基酸序列的氨基酸序列变体的合成多核苷酸序列。

SEQ ID NO:59是来自如在SEQ ID NO:58中列出的开放阅读框的TIC2463变体蛋白的氨基酸序列翻译。

SEQ ID NO:60是编码在SEQ ID NO:4中列出的TIC2463氨基酸序列的氨基酸序列变体的合成多核苷酸序列。

SEQ ID NO:61是来自如在SEQ ID NO:60中列出的开放阅读框的TIC2463变体蛋白的氨基酸序列翻译。

具体实施方式

农业害虫控制领域中的问题的特点是需要新的毒素蛋白，所述毒素蛋白是针对目标害虫有效的、展示针对目标害虫物种的广谱毒性、能够在植物中表达而不会引起不希望的农艺学问题，并且提供与在植物中商业上使用的当前毒素相比的替代作用模式。由TIC2463例示的新颖杀虫蛋白在本申请中公开并且解决了这些需求中的每种，特别是针对广泛鞘翅目昆虫害虫，并且更具体地针对玉米根虫害虫物种。

本申请中公开和要求保护的蛋白质家族是从展示杀虫活性的细菌菌株鉴别的。所述细菌菌株的基因组文库是在载体中产生的，从所述载体中鉴别了当引入苏云金芽孢杆菌的无晶体(acrystalliferous)菌株中时恢复在天然存在的细菌菌株中观察到的杀虫活性的克隆。对此类克隆的DNA进行测序且用于鉴别编码疑似杀虫蛋白的一个或多个开放阅读框(ORF)。此类ORF的来自其他细菌来源的DNA序列用于探测其他细菌菌株中类似ORF的存在。类似ORF的鉴别导致发现编码也展示鞘翅目毒性活性的类似蛋白的另外DNA序列。

如在本申请中进一步描述，鉴别了展示杀虫活性的苏云金芽孢杆菌(Bt)菌株，菌株EG3957。从所述菌株的基因组构建的文库产生了包含编码新颖Bt蛋白TIC1373(SEQ ID:40)的ORF的克隆的鉴别。所述TIC1373氨基酸序列展示与被称为Cry60和Cry15Aa1的已知Bt杀虫毒素(已知展示仅杀蚊活性的蛋白质)的远缘关系(小于29％氨基酸序列同一性)。假设TIC1373(SEQ ID NO:40)与Cry60和Cry15pfam的这种远缘关系表明可从自质粒表达TIC1373肽观察到杀虫活性，所述质粒含有指导苏云金芽孢杆菌的无晶体菌株中的TIC1373开放阅读框的表达的Bt孢子形成启动子。

当针对一连串植物害虫在生物测定中进行测试时，所得到的重组菌株未能展示任何杀虫活性，并且对应于预测的TIC1373的质量的蛋白质未在培养上清液或孢子/细胞沉淀中检测到。TIC1373的预测氨基酸序列与现有技术中作为NCBI WP_003308447已知的未表征的蛋白质基本上相同，其在2009年首次公布在NCBI网站上且在Zwick等人(Genome Res.22:1512-1524(2012))中提及。

TIC1373蛋白质序列与ETX/MTX型毒素Cry60的远缘关系表明所述TIC1373蛋白可展示一些异常的或难以表征的杀虫活性。然而，如以上所解释，TIC1373肽未展示针对在一连串昆虫生物测定中测试的任何昆虫的杀虫活性，所述测试包括针对鞘翅目、鳞翅目和半翅目害虫物种的测试。假设与TIC1373肽相关的蛋白质可存在于其他微生物菌株中并且相关蛋白质的氨基酸序列内存在的变异可能产生毒素活性。因此，TIC1373蛋白编码序列被用于鉴别包含与预测的TIC1373蛋白同源的相关序列的其他微生物菌株。对此类同源物进行克隆和测序，并且鉴别编码与TIC1373蛋白相似的蛋白质的ORF。

所鉴别的一种另外的同源蛋白质在SEQ ID NO:2中列出，其在本文被指定为TIC1825。如在SEQ ID NO:1中列出的编码TIC1825的序列是从Bt菌株EG5015获得的。所预测的TIC1825蛋白氨基酸序列展示与TIC1373的实质同一性(跨TIC1373蛋白的长度77％同一性)。出人意料地，与TIC1373蛋白相比，TIC1825包含额外的31个N末端氨基酸。来自苏云金芽孢杆菌的无晶体菌株的TIC1825蛋白的表达出人意料地在细胞沉淀以及培养上清液中展示鞘翅目杀虫活性，从而表明所述蛋白质毒素可被分泌至培养基中。

从培养上清液收集TIC1825蛋白并且所述蛋白质的N-末端氨基酸序列分析指示从TIC1825基因ORF预测的TIC1825蛋白是包含在苏云金芽孢杆菌的无晶体菌株中表达时可能负责靶向新生TIC1825蛋白以分泌至培养上清液中的33个氨基酸的信号肽的前体蛋白。据确定全长TIC1825开放阅读框(SEQ ID NO:1从核苷酸位置1-945)编码加工成由核苷酸100-945编码的成熟毒素蛋白的毒素前体蛋白。分泌的蛋白质氨基末端序列信息与ORF编码在所述蛋白质的分泌形式中不存在的N-末端肽区段的事实相结合，表明预测的氨基末端肽区段是由如在SEQ ID NO:1中列出的核苷酸1-99编码的三十三(33)个氨基酸的分泌信号肽。

基于所述TIC1825数据，由从其鉴别TIC1373的Bt菌株EG3957获得另外的序列信息。据确定另外的序列信息存在于原始TIC1373克隆的上游，所述克隆包含编码类似于由TIC1825编码序列编码的N-末端信号肽区段的N-末端氨基酸区段的序列。包含TIC1825的核苷酸1-99的人工编码序列的组件框内可操作地连接至产生编码TIC2463的ORF(SEQ ID NO：4)的TIC1373编码序列。出人意料地，含有编码TIC2463的ORF(SEQ ID NO:3从核苷酸位置1至939)的克隆的表达产生对鞘翅目物种毒性的杀虫活性，存在于培养上清液以及部分地保留在无晶体Bt培养物的细胞沉淀中。

分泌信号可能需要以用于回收这类蛋白质毒素的生物活性的信息允许针对编码与TIC1825以及TIC2463同源的蛋白质的另外DNA区段的存在进行的更广泛的芽孢杆菌菌株搜索。通过用TIC2463和TIC1825编码序列探测其相应基因组鉴别了包含这类同源序列的Bt菌株，并且获得了对应于这些同源序列的克隆DNA区段。对这些另外克隆中的每一个进行测序以确定开放阅读框的存在，并且从这些开放阅读框预测的蛋白质翻译鉴别了展示与TIC1825和TIC2463蛋白的结构特征类似的结构特征的蛋白质。因此发现了蛋白质的鞘翅目毒素家族，包括TIC1825(SEQ ID NO:2)、TIC2463(SEQ ID NO:4)、TIC2461(SEQ ID NO:6)、TIC3037(SEQ ID NO:8)、TIC2228(SEQ ID NO:10)、TIC3005(SEQ ID NO:12)、TIC2593(SEQ ID NO:14)、TIC2598(SEQ ID NO:16)、TIC3891(SEQ ID NO:18)、TIC3090(SEQ ID NO:20)、TIC3626(SEQ ID NO:22)以及TIC2081(SEQ ID NO:24)。这些蛋白质中的每种展示针对一种或多种鞘翅目害虫的鞘翅目毒性活性。

包含这些蛋白质、由这些蛋白质组成、与这些蛋白质基因上同源、类似于这些蛋白质或源自这些蛋白质的任何新颖的杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白在本文中统称为TIC2463相关毒性蛋白，并且或者被称为TIC2463相关蛋白毒素类别或家族、TIC2463相关毒素蛋白、TIC2463相关蛋白质属、与TIC2463毒素蛋白相关的毒素蛋白、与TIC2463相关的蛋白质、TIC2463相关毒素多肽、TIC2463相关杀虫蛋白等；每个提及具有基本上相同的含义。TIC2463相关蛋白毒素类别包括TIC1825(SED ID NO:2)、TIC2463(SEQ ID NO:4)、TIC2461(SEQ ID NO:6)、TIC3037(SEQ ID NO:8)、TIC2228(SEQ ID NO:10)、TIC3005(SEQ ID NO:12)、TIC2593(SEQ ID NO:14)、TIC2598(SEQ ID NO:16)、TIC3891(SEQ ID NO:18)、TIC3090(SEQ ID NO:20)、TIC3626(SEQ ID NO:22)以及TIC2081(SEQ ID NO:24)、赋予针对鞘翅目害虫的活性的其杀虫或昆虫抑制区段、其组合或其变体(如在本申请中公开的变体)，包括展示杀虫或昆虫抑制活性的任何蛋白质(当与所述TIC2463相关蛋白中的任一种相比时，如果所述蛋白质与TIC2463相关蛋白的比对产生约34％至约100％百分比的任何分数百分比的氨基酸序列同一性)。所述TIC2463相关蛋白包括前体形式以及所述蛋白质的成熟长度形式。本文所公开的新颖蛋白质总结在实施例1以及表1(1-A和1-B)和表2中。

这些不同毒素蛋白家族成员与本领域中已知的蛋白质的氨基酸序列的比较仅鉴别了从公开的核苷酸序列信息预测的两种未表征的氨基酸区段。第一区段是以上提及的未表征的NCBI蛋白质WP_003308447，其与TIC1373(SEQ ID NO:40)基本上相同并且由在SEQ ID NO:39中列出的DNA区段编码。如本申请中所公开，对从可操作地连接至在苏云金芽孢杆菌的无晶体菌株的芽孢杆菌中起作用的异源启动子的构建体表达编码如在SEQ ID NO:39中列出的位置1-846的氨基酸区段(SEQ ID NO:40，TIC1373)的尝试未检测到从所述开放阅读框表达的任何蛋白质，并且在体外生物测定中在培养物上清液或在细胞/孢子沉淀中未检测到针对鞘翅目物种如科罗拉多马铃薯甲虫或玉米根虫幼虫的杀虫活性。然而，产生将来自如在SEQ ID NO:39中列出的核苷酸位置7-846的TIC1373阅读框连接至编码源自本文所述的TIC2463相关毒素蛋白(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15从核苷酸位置1-99；SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19从核苷酸位置1-84；SEQ ID NO:7从核苷酸位置1-93；以及SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23从核苷酸位置1-78)中的任一种的信号肽的DNA区段的构建体以及在苏云金芽孢杆菌的无晶体菌株中表达所述构建体出人意料地产生如在SEQ ID NO:40从氨基酸位置3至氨基酸位置282中列出的TIC1373蛋白区段的杀虫生物活性。所述肽区段与如在SEQ ID NO:4(TIC2463)中列出的对应区段相同。在实施例中描述的数据表明该蛋白质家族的毒素部分的分泌是强制性的，以便使毒素蛋白的成熟分泌形式展示杀虫活性，无论所述蛋白质是在植物中还是在细菌宿主细胞内表达。

第二未表征的氨基酸区段(SEQ ID NO:42)是由如在SEQ ID NO:41中列出的开放阅读框预测的。如在SEQ ID NO:42中列出的氨基酸的预测区段源自蜡样芽孢杆菌细菌，并且由包含如在SEQ ID NO:41中列出的核苷酸位置781-783处的终止密码子(TAA)的隐蔽序列编码，这预测所述编码的蛋白质将包含与在SEQ ID NO:4(TIC2463)从氨基酸位置1至260中列出的序列相同的氨基酸序列。然而，从在SEQ ID NO:41从核苷酸位置1-780中列出的开放阅读框翻译的、在SEQ ID NO:42处列出的氨基酸区段未能编码如在SEQ ID NO:4(TIC2463)中列出的氨基酸261至313。因此该预测的截短/隐蔽蛋白质不太可能展示任何杀虫活性。

在本申请中描述的蛋白质通过以下各项彼此相关：(a)来源或起源(即，来自细菌的芽孢杆菌物种，并且特别是细菌的Bt菌株)；(b)表征为针对鞘翅目昆虫害虫物种的杀虫活性的生物活性；(c)在可用作用于鉴别所述属的其他成员的查询序列的本领域中的其他蛋白质中不存在的结构特征；(d)氨基酸序列长度；(e)至少充当信号多肽的N-末端氨基酸区段的存在，所述信号多肽用于新生氨基酸链中以用于使毒素区段分泌至细胞外空间或至芽孢杆菌的表面(在本文分别称为信号氨基酸序列、信号序列、信号肽或信号多肽，每个术语是指基本上相同或相似的或相关的结构)；以及(f)成熟多肽(在本文不同地称为成熟多肽氨基酸序列、成熟毒素区段、成熟多肽或成熟蛋白质；每个术语基本上是指相同或相似的或相关的结构)的存在，从而当分泌至孢杆菌的表面或围绕芽孢杆菌的周围细胞外空间时充当毒素的活性形式。

TIC2463相关蛋白毒素类别的全长和成熟蛋白质也可通过一级结构(保守氨基酸基序)、长度(对于成熟蛋白质约295个氨基酸且对于全长蛋白质约320个氨基酸)和其他特征相关。来自本发明的全长蛋白质具有约35k道尔顿的质量，成熟蛋白质具有约32k道尔顿的质量。TIC2463相关蛋白毒素类别的全长和成熟形式的特征在表1-A和1-B中报告。

表1-A–全长蛋白质的特征

表1-B–成熟蛋白质的特征

在本申请中应注意编码TIC2463或相关毒素蛋白的仅成熟毒素区段的核苷酸区段尚未发现适用于产生杀虫有效量的毒素组分。杀虫有效量的毒素仅在所述成熟毒素区段可操作地连接至分泌信号肽且被靶向以用于分泌(在细菌系统中)或当在植物细胞内表达时被靶向以用于插入亚细胞区室中(例如，使用叶绿体或质体靶向肽靶向叶绿体或质体结构，或使所述成熟毒素区段靶向另一个亚细胞区室如造粉体或线粒体结构)时产生。从编码连接至所述成熟毒素区段且与所述成熟毒素区段同框的信号肽(出于细菌表达目的)或靶向肽(出于植物亚细胞区室定位目的)的核苷酸区段表达本发明的任何毒素区段提供杀虫有效量的毒素组分。

基于在本申请中呈现的数据，并且不受任何理论限制，TIC2463相关毒素可能需要从提供前体或前形式多肽的基因或DNA构建体表达，所述前体或前形式多肽随后进行加工以从蛋白质的前体形式释放毒素区段。在特定宿主细胞内将可能存在用于通过从成熟毒素区段裂解信号肽区段来引起这种释放的蛋白酶。在一些实施方案中，可能需要在成熟毒素区段与靶向肽之间提供工程化的裂解位点。在本发明的特定毒素的前体形式被提供至害虫的意义上，可能需要目标害虫中的蛋白酶来在工程化的裂解位点处裂解前体形式，从而释放活化的毒素区段。在其他实施方案中，所述前体形式将在特定宿主细胞内表达，并且所述宿主细胞内的一种或多种酶将在从成熟毒素区段裂解N末端氨基酸区段方面活性的。在每种情况下，从N末端分泌或靶向区段释放成熟毒素区段将活化所述成熟毒素区段，从而产生展示鞘翅目害虫抑制活性的完全功能性毒素蛋白。

信号序列的裂解可通过包括但不限于化学试剂和蛋白水解酶的试剂来介导。这些酶中的一些可存在于目标害虫消化系统中，例如存在于宿主细胞内的在从所述宿主细胞内的mRNA翻译新生前体时或在促进毒素蛋白的成熟形式的分泌时在所述前体正被易位跨过所述宿主细胞内的一个或多个膜时裂解前体蛋白的酶。

在本申请中提及术语“活性的”或“活性”、“杀虫活性(pesticidal activity)”或“杀虫的(pesticidal)”或“杀虫活性(insecticidal activity)”、“昆虫抑制”或“杀虫的(insecticidal)”是指毒性剂如蛋白质毒素在抑制(抑制生长、摄食、繁殖力或存活力)、遏制(遏制生长、摄食、繁殖力或存活力)、控制(控制害虫侵扰、控制含有有效量的TIC2463相关蛋白的特定作物上的害虫摄食活动)或杀死害虫(引起害虫的发病、死亡或繁殖力降低)。这些术语意图包括将杀虫有效量的毒性蛋白提供至害虫的结果，其中使所述害虫暴露于所述毒性蛋白导致发病、死亡、繁殖力降低或萎缩。这些术语还包括作为将杀虫有效量的毒性蛋白提供在植物之上或之中的结果来将害虫从植物、植物的组织、植物部分、种子、植物细胞或从所述植物可能生长的特定地理位置中排斥出。一般来说，杀虫活性是指毒性蛋白有效于抑制以特定目标害虫的所述蛋白质、蛋白质片段、蛋白质区段或多核苷酸为食的昆虫(包括但不限于鞘翅目昆虫)的生长、发育、存活力、摄食行为、交配行为、繁殖力或由其引起的不良作用的任何可测量的降低的能力。所述毒性蛋白可由植物产生或可被施加至所述植物或施加至所述植物所位于的位置内的环境。术语“生物活性”、“有效的(effective)”、“有效的(efficacious)”或其变化形式也是在本申请可互换使用的术语以描述本发明的蛋白质对目标昆虫害虫的作用。

当提供至目标害虫时，杀虫有效量的毒性剂在所述毒性剂接触所述害虫时展示杀虫活性。毒性剂可以是杀虫蛋白或本领域中已知的一种或多种化学试剂。杀虫化学试剂和杀虫蛋白试剂可单独使用或与彼此组合使用。化学试剂包括但不限于有机氯化物、有机磷酸酯和氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、新烟碱、莱恩碱以及靶向用于在目标害虫中抑制的特异性基因的dsRNA分子。杀虫蛋白质试剂包括在本申请中列出的蛋白质毒素，以及与TIC2463相关毒素蛋白靶向相同害虫的其他蛋白质毒性剂。这类其他蛋白质毒性剂包括但不限于马铃薯糖蛋白、TIC100/101二元毒素、ET33/34二元毒素、TIC863、ET80/76二元毒素、ET70、Cry3Bb(美国专利No.6,501,009)、Cry1C变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、Axmi184、Axmi205、AxmiR1、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC3131、DIG-10、eHIP以及ω-Hexatoxin-Hv1a毒素蛋白。

意图提及害虫，特别是作物植物的害虫意指作物植物的昆虫害虫，特别是通过来自TIC2463相关蛋白质毒素类别的蛋白质控制的那些，但当靶向这些害虫的毒性剂与TIC2463相关毒素蛋白或同TIC2463相关毒素蛋白约34％至100％同一性的蛋白质毒素一起共定位或存在时，也可包括其他害虫如植物的鳞翅目、半翅目、同翅目或缨翅目昆虫害虫以及线虫和真菌。

此外，在本申请中提及“分离的DNA分子”或等效术语或短语意图指所述DNA分子是单独或与其他组合物组合存在、但不存在于其天然环境中的一种DNA分子。例如，在生物体的基因组的DNA内天然发现的核酸元件如编码序列、内含子序列、非翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等不被认为是“分离的”，只要所述元件在所述生物体的基因组内且在天然发现其的基因组内的位置处。然而，这些元件中的每种和这些元件的子部分将在本公开的范围内是“分离的”，只要所述元件不在所述生物体的基因组内或在天然发现其的基因组内的位置处。类似地，编码杀虫蛋白或所述蛋白质的任何天然存在的杀虫变体的核苷酸序列将是分离的核苷酸序列，只要所述核苷酸序列不在从其天然发现编码所述蛋白质的序列的细菌的DNA内。编码天然存在的杀虫蛋白的氨基酸序列的合成核苷酸序列将出于本公开的目的被认为是分离的。出于本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，即插入植物或细菌的细胞的基因组中或存在于染色体外载体中的DNA的核苷酸序列将被认为是分离的核苷酸序列，无论其存在于质粒内还是用于转化所述细胞的类似结构内、所述植物或细菌的基因组内、或以可检测的量存在于源自所述植物或细菌的组织、子代、生物样品或商品产品中。

所述TIC2463相关蛋白和多肽通过一级结构相关，包括但不限于沿形成特定蛋白质区段的连接的氨基酸的特定长度氨基酸同一性的数字、第一蛋白质区段(主题)相对于第二蛋白质区段的氨基酸序列(查询)的氨基酸序列同一性百分比、相对于第二蛋白质区段的氨基酸的长度特定第一蛋白质区段的氨基酸的长度或其任何组合。

术语“区段”或“片段”在本申请中用于描述比描述TIC2463相关蛋白的完整氨基酸或核酸序列短的连续氨基酸或核酸序列。展示昆虫抑制活性的区段或片段也在本申请中公开，如果所述区段或片段与TIC2463相关蛋白的相应部分的比对在所述区段或片段与所述TIC2463相关蛋白的相应部分之间产生约34％至约100％的任何分数百分比的氨基酸序列同一性。

与TIC2463相关蛋白类似的蛋白质可通过使用本领域中已知的基于计算机的算法彼此比较来鉴别。在本申请中报告的氨基酸同一性时使用以下这些默认参数进行Clustal W比对的结果：权重矩阵：blosum；空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：0.05；亲水性空位：On；亲水性残基：GPSNDQERK；残基特异性空位罚分：On(Thompson等人(1994)Nucleic Acids Research,22:4673-4680)。通过测定作为将表示查询与主题蛋白质之间的氨基酸同一性的数字除以主题蛋白质的长度的结果获得的商、然后将如此获得的商乘以100来进一步计算氨基酸同一性百分比。应了解这种算法的使用不是限制性的并且还考虑本领域的普通技术人员已知的替代比对算法。

意图展示针对鞘翅目昆虫物种的昆虫抑制活性的蛋白质与TIC2463相关蛋白相关，如果所述蛋白质用于查询、例如Clustal W比对中，并且本发明的蛋白质中的至少一种在这种比对中被鉴别为命中，其中所述查询蛋白质沿TIC2463相关蛋白的长度展示约34％、35％、40％、50％、60％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、或此范围中的任何分数百分比的氨基酸同一性。

在本申请中描述的蛋白质与彼此的比对产生产生针对每一对的氨基酸同一性，如由表2中所示的矩阵所表示。表2的左侧上的竖直列和跨所述表的顶部的行通过SEQ ID NO和TIC数目两者列出单独蛋白质。两种不同蛋白质之间的相对氨基酸序列同一性百分比反映在相应行和列交叉的方框中。这种表示示出TIC2463家族成员通过低至44％同一性至高达99％-100％同一性范围内的百分比同一性彼此相关。这些百分比同一性相对于此家族组内的其他全长蛋白质示出。一般来说，蛋白质之间的同一性百分比在仅比对相应蛋白质的毒素部分时增加。

TIC2463相关毒素蛋白家族成员还通过展示由长度为约27或28个氨基酸至约33至35个氨基酸组成的信号肽序列、一级结构(保守氨基酸基序)、长度(蛋白质的毒素部分展示约269个氨基酸至约315个氨基酸的长度；这些家族成员的信号肽展示与彼此的约65％至约100％氨基酸序列同一性)以及其他特征相关。

如先前在本申请中所指示，TIC2463相关毒素蛋白的天然信号序列可彼此取代而不牺牲前体蛋白(无论是天然的还是嵌合的)在细菌的芽孢杆菌菌株中表达式起作用的能力。此外，与TIC2463相关毒素蛋白中的任一种相关的天然信号序列可被有助于输入植物宿主细胞内的叶绿体或造粉体中的非天然序列取代。能够使蛋白质靶向特异性细胞内区室或实现分泌或插入膜或实现在翻译后加工中的修饰的信号肽的实例是本领域中已知的。在一个实施方案中，TIC2463的天然信号肽被其他信号肽序列取代。如在SEQ ID NO:36(从氨基酸位置1-75)中所列出，靶向肽的植物造粉体共价连接至由氨基酸位置76至355(SEQ ID NO:36)组成的成熟TIC2463毒素区段。如在SEQ ID NO:38中所列出，靶向来自氨基酸位置1-61的肽的植物叶绿体或质体共价连接至来自氨基酸位置62至341的成熟TIC2463氨基酸序列。这些嵌合前体中的每种在植物宿主细胞、植物、植物部分和种子中有效表达，并且成熟蛋白质定位至相应亚细胞区室。

TIC2463相关毒素蛋白通过共同功能相关并且展示针对鞘翅目昆虫害虫(包括成虫、蛹、幼虫和新生体)的昆虫抑制活性。鞘翅目昆虫包括但不限于，地老虎属(Agrotis spp.)、花象属(Anthonomus spp.)、甜菜隐食甲(Atomaria linearis)、甜菜胫跳甲(Chaetocnema tibialis)、根颈象属(Cosmopolites spp.)、象甲属(Curculio spp.)、皮蠹属(Dermestes spp.)、叶甲属(Diabrotica spp.)、食植瓢虫属(Epilachna spp.)、Eremnus属、马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、稻水象甲属(Lissorhoptrus spp.)、鳃金龟属(Melolontha spp.)、锯谷盗属(Orycaephilus spp.)、耳象属(Otiorhynchus spp.)、斑象属(Phlyctinus spp.)、弧丽金龟属(Popillia spp.)、蚤跳甲属(Psylliodes spp.)、蛀长蠹属(Rhizopertha spp.)、金龟子科(Scarabaeidae)、米象属(Sitophilus spp.)、麦蛾属(Sitotroga spp.)、粉甲虫属(Tenebrio spp.)、拟谷盗属(Tribolium spp.)和斑皮蠹属(Trogoderma spp.)，特别是当害虫是玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera)(西部玉米根虫(Western Corn Rootworm)，WCR)、北美玉米根叶甲(Diabrotica barberi)(北部玉米根虫(Northern Corn Rootworm)，NCR)、Diabrotica virgifera zeae(墨西哥玉米根虫，MCR)、黄瓜条叶甲(Diabrotica balteata)、(巴西玉米根虫，BZR)、十一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpunctata howardii)(南部玉米根虫，SCR)以及由Diabrotica viridula和南美叶甲(Diabrotica speciosa)组成的巴西玉米根虫复合物(BCR)。

考虑在本申请中描述的蛋白质可展示针对除了鞘翅目昆虫以外的昆虫物种的毒性、昆虫害虫控制特性。例如，鳞翅目、半翅目、同翅目、缨翅目等中的昆虫是植物害虫并且可对这些毒素蛋白、特别是进行修饰以展示扩大的宿主范围的TIC2463相关蛋白敏感。这类修饰可包括缺失或插入一个或多个氨基酸、氨基酸取代以及使用来自TIC2463相关蛋白家族的一个成员的一个或多个区段与来自所述TIC2463相关蛋白家族的一个或多个其他成员中的任一个的一个或多个适用区段的组合、或与来自本领域中已知的任何其他毒素蛋白的一个或多个适用区段组合来构建嵌合蛋白一站式害虫控制特性(例如像，展示杀虫生物活性的任何Cry或Cyt蛋白质家族成员，如在用于苏云金芽孢杆菌毒素命名法的苏塞克斯大学生命科学网站(Sussex University’s life sciences website for Bacillus thuringiensis toxin nomenclature)Sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html上所叙述)。本发明的蛋白质可在组合物(包括植物)中与一种或多种不同的毒性剂如dsRNA或不同的鞘翅目昆虫毒性蛋白组合以控制玉米根虫或科罗拉多马铃薯甲虫，并且与除鞘翅目昆虫毒性蛋白以外的蛋白质组合以控制来自其他昆虫目的一种或多种害虫，包括蛋白质如Cry1’s、Cry2’s、Cry9’s、TIC807或其衍生物、TIC1415及相关蛋白等，并且与编码对除草剂如麦草畏、草甘膦、草铵膦、2,4-D等的耐受性的基因及其衍生物等组合。

本公开还考虑使用本领域中已知的分子方法来工程化和克隆包含来自杀虫蛋白的蛋白质的嵌合体的商业上有用的蛋白质，例如所述嵌合体可从TIC2463相关蛋白的区段组装以获得另外有用的实施方案，包括将TIC2463相关蛋白的区段与不同于TIC2463相关蛋白的多种蛋白质的区段组装。TIC2463蛋白质家族可经受与彼此以及与其他Bt杀虫蛋白的比对(无论这些是系统发生上密切相关的还是远缘相关的)，并且可鉴别可适用于取代的每种此类蛋白质的区段，从而产生嵌合蛋白的构建。所述嵌合蛋白可经受害虫生物测定分析并且针对与相比嵌合体中的每种此类区段所源自的亲本蛋白质增加的生物活性或扩大的目标害虫范围的存在进行表征。所述多肽的杀虫活性可通过与其他蛋白质交换结构域或区段、通过氨基酸取代、缺失或添加或通过使用本领域中已知的定向进化方法来针对对特定害虫或对更广泛范围的害虫的改进的活性进行进一步工程化。

生物功能上等效的蛋白质毒素时展示与一种或多种TIC2463相关蛋白质毒素的实质性氨基酸序列同一性且展示与与其进行这种比较的一种或多种蛋白质基本上相同或相同或甚至更大杀虫活性的那些。这类功能上等效的蛋白质包括具有保守氨基酸取代且不展示相对于比较蛋白质的功能损失的那些。熟练的技术人员将容易地理解术语“保守氨基酸。”可容纳取代的氨基酸、氨基酸的区段(如取代的信号肽序列)、或N-或C-末端缺失以获得生物等效物的蛋白质的实例包括但不限于如在以下中的任一项中列出的蛋白质序列：SEQ I D NO:2(TIC1825)、SEQ ID NO:4(TIC2463)、SEQ ID NO:6(TIC2461)、S EQ ID NO:8(TIC3037)、SEQ ID NO:10(TIC2228)、SEQ ID NO:12(TIC3005)、SEQ ID NO:14(TIC2593)、SEQ ID NO:16(TIC2598)、SEQ ID NO:18(TIC3891)、SEQ ID NO:20(TIC3090)、SEQ ID NO:22(TIC3626)、SE Q ID NO:24(TIC2081)、SEQ ID NO:26(TIC1825_G233A，还被称为TIC1825v1)、SEQ ID NO:28(TIC1825_P234A，还被称为TIC1825v2)、SEQ ID NO:30(TIC1825_K224T_D226N_G233A_P234A_L246T_T248V，还被称为TI C1825v3)、SEQ ID NO:32(TIC2463_3)、SEQ ID NO:34(TIC2463_4)、SE Q ID NO:49(TIC1825_12)、SEQ ID NO:51(TIC1825_13)、SEQ ID NO:53(TIC1825_15)、SEQ ID NO:55(TIC2461_5)、SEQ ID NO:57(TIC2463_8)、SEQ ID NO:59(TIC2463_9)、SEQ ID NO:61(TIC2463_10)。

提供用于发现TIC2463相关蛋白类别的新成员的方法。可获得任何细菌基因组的DNA序列并且将数据组装成序列信息的连续区段。基因组重叠群内的DNA序列可被鉴别为包含编码预期蛋白质序列的预测的ORF。可将预期编码的蛋白质序列与在本申请中作为TIC2463相关毒素蛋白公开的蛋白质进行比较，并且编码这类预期蛋白质的序列可进行克隆且在任何数目的细菌表达系统中表达，并且可将从所述克隆表达的所得蛋白质针对杀虫活性进行测试。展示杀虫活性且展示与本申请中公开的一种或多种蛋白质的至少约44％至约100％氨基酸序列同一性的预期蛋白质被认为在TIC2463相关毒素蛋白类别的范围内。或者，由对应于本文在SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和23中的任一个中列出的序列的约20至约900个核苷酸组成的DNA区段可用作探针或引物以用于检测或扩增(视情况而定)来自多种细菌物种(包括芽孢杆菌物种)的DNA序列。检测与这类探针杂交的DNA序列或在适用的热扩增反应中使用这类引物扩增DNA区段为熟练的技术人员提供用于捕获DNA的可组装成编码氨基酸序列的连续核苷酸序列的必要区段的材料，所述氮基酸序列可与本申请中描述的蛋白质的氨基酸序列进行比较。可测试以此方式发现的蛋白质的杀虫活性。展示杀虫活性且展示与本申请中公开的TIC2463相关蛋白质毒素中的任一种的约44％或更大氨基酸序列同一性的蛋白质是TIC2463相关蛋白质毒素成员。

产生特异性地结合本申请中描述的一种或多种蛋白质的试剂(例如像，抗体、α体、脂质运载蛋白、抗运载蛋白等)在本领域的技能之内。特异性地结合的这类试剂可用于筛选或发现TIC2463属的其他成员。所述结合试剂可用于特异性地结合可充当本申请中公开的全长蛋白质的表位的一种或多种TIC2463相关蛋白或肽片段。所述抗体、脂质运载蛋白、抗运载蛋白、α体等的结合可通过使用与ELISA类似的方法来检测。

本发明的实施方案包括编码TIC2463相关蛋白的重组多核苷酸组合物。例如，所述TIC2463相关蛋白可从重组DNA构建体表达，其中具有编码所述蛋白质的ORF的多核苷酸分子可操作地连接至元件如启动子和用于在所述构建体所意图用于的系统或宿主细胞类型中表达的任何其他必要的调控元件。具体地考虑被设计用于在含有可操作地连接至编码TIC2463相关蛋白的多核苷酸区段的植物功能性启动子的植物中表达的构建体。可在用于在植物中使用的此类构建体中有用的其他元件包括增强子、内含子、非翻译前导序列、编码的蛋白质固定标签(HIS-标签)、编码的亚细胞易位肽(即，质体转运肽、信号肽)、翻译后修饰酶的编码的多肽位点、核糖体结合位点以及RNAi靶位点，其各自可操作地连接至每种此类构建体中的适用调控或表达元件。

提及“被设计用于在植物中表达”意图从细菌系统或其他宿主系统获得的可编码TIC2463或相关蛋白的核苷酸序列可展示已显示降低植物细胞中意图蛋白质的表达水平的某些有害序列。用于设计基因以避免这类问题序列的这类实施方案和方式在美国专利5,500,365中列出。虽然设计避免这类问题序列的基因在本领域的技能之内但当查阅‘365专利时，数百或数千或甚至数百万个满足在‘365专利中列出的标准的不同的序列是可能的，并且意图这些实施方案中的每个包括在关于编码被设计用于在植物中表达的TIC2463或相关蛋白的本申请的范围之内。

包含TIC2463相关蛋白编码序列的重组DNA构建体还可包含DNA的编码一种或多种昆虫抑制剂的区域，所述区域可被配置成同时表达或共表达编码TIC2463相关蛋白的DNA序列、昆虫抑制性dsRNA分子或辅助蛋白。辅助蛋白包括但不限于用于例如通过帮助昆虫抑制剂的表达、影响其在植物中的稳定性、优化低聚的自由能、增强其毒性以及增加其活性范围来帮助其有效性的辅因子、酶、结合配偶体或其他试剂。辅助蛋白可促进一种或多种昆虫抑制剂的摄取，例如或增强毒性剂的毒性作用。

可组装重组DNA构建体以使得所有蛋白质或RNA分子从单个启动子表达或每种蛋白质或dsRNA分子在单独的启动子或其一些组合的控制下。本申请的蛋白质可从多基因表达系统表达，其中一种或多种TIC2463相关蛋白从共同核苷酸区段表达，所述核苷酸区段还包含其他ORF和启动子，这取决于所选择的表达系统的类型。例如，细菌多基因表达系统可利用单个启动子来驱动从单个操纵子内表达多重连接的/串联ORF。在另一个实例中，植物多基因表达系统可利用多重连接的表达盒，各表达盒表达不同的蛋白质或其他试剂如一种或多种dsRNA分子。

含有编码TIC2463相关蛋白的核苷酸序列的重组多核苷酸或重组DNA构建体可通过载体例如质粒、杆状病毒、人工染色体、病毒粒子、粘粒、噬菌粒、噬菌体或细菌噬菌体或病毒载体递送至宿主细胞。所述载体可用于实现TIC2463相关蛋白的稳定或瞬时表达。引入宿主细胞中的任何这种DNA构建体被称为“转基因”并且所述构建体的宿主细胞受体是“转基因细胞”或“转基因宿主细胞”。

在本申请中具体地考虑包含被设计用于表达TIC2463相关蛋白的任何重组多核苷酸的转基因细菌、植物细胞、植物和植物部分，包括花和花器以及种子。术语“细菌细胞”或“细菌”意图包括但不限于土壤杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属或根瘤菌属细胞。术语“植物细胞”或“植物”可包括但不限于苜蓿、香蕉、大麦、豆、花椰菜、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈树、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽(加拿大低酸油菜籽)、稻、根茎、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、小黑麦、草坪草、西瓜以及小麦植物细胞或植物。特别感兴趣的是具有针对鞘翅目的一种或多种昆虫的增强的杀虫抗性的棉花、苜蓿、玉米、大豆或甘蔗植物。提供含有表达TIC2463相关毒素蛋白的多核苷酸构建体的转基因植物和从转基因植物细胞再生的转基因植物部分。转基因植物可通过繁殖、插枝、折断、研磨或以其他方式解离来自所述植物的细胞、部分或组织来从转基因种子获得。所述植物部分可以是种子、圆荚、叶、花或花器、茎、根、穗丝、胚芽或其任何部分，或转基因植物部分的非再生部分。如在这种背景下使用，转基因植物部分“非再生”部分是不能诱导来形成完整植物或不能诱导来形成能够有性和/或无性繁殖的完整植物的部分。在某些实施方案中，植物部分的非再生部分是转基因种子、圆荚、叶、花、茎或根的一部分。

在本申请中提供用于制备包含昆虫或鞘翅目昆虫抑制量的TIC2463相关蛋白的转基因植物的方法。这类植物可通过将编码任何TIC2463相关蛋白的重组多核苷酸引入植物细胞并且选择源自所转化的植物细胞的表达昆虫或鞘翅目昆虫抑制量的TIC2463相关杀虫蛋白的植物来制备。植物可通过再生、种子、花粉或分生组织转化技术自所述植物细胞获得。用于转化植物的方法是本领域中已知的(例如，用于将转基因DNA引入组织中的土壤杆菌属介导的转化、基因枪法和浸泡或吸胀方法)。在某些实施方案中，转基因植物可具有使用本领域中已知的位点特异性整合方法独立地引入植物基因组内的基本上同一位置中的两种或更多种构建体。表达本发明的一种或多种TIC2463或相关蛋白的转基因植物可通过常规育种或通过将定点插入在先前存在的转基因事件附近引入表达本发明的蛋白质的构建体中来与本领域中已知的任何转基因玉米植物组合，所述先前存在的转基因事件包括但不限于事件176、事件4114、事件BT11、MIR162、MIR604、事件CBH-351、事件DAS-06275-8、事件DAS-59122-7、事件DBT418、事件MIR162、事件MIR604、事件MON810、事件MON863、事件MON88017、事件MON89034以及事件TC1507或其适用组合。

还提供加工的植物产物，所述植物产物包含可检测量的本文所述的一种或多种多核苷酸或蛋白质、昆虫抑制区段或其片段、或其任何显著部分。所述加工的产物选自由以下组成的组：植物生物质、油、膳食、动物饲料、面粉、薄片、糠、棉绒、外壳以及加工的种子，并且所述产物可以是非再生的。其显著部分可包括如在SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24中的任一项中列出的至少10、20、30、50、100、200或甚至250个连续氨基酸的任何一种或多种多肽。

还在本申请中考虑加工的植物产物(还被称为商品)，其中所述加工的产物包含可检测量的TIC2463相关蛋白、其区段、其昆虫抑制片段或其任何显著部分。在某些实施方案中，所述加工的产物选自由以下组成的组：植物生物质、油、膳食、糖、动物饲料、面粉、薄片、糠、棉绒、外壳、加工的种子以及种子。所述植物产物可包含源自转基因植物或转基因植物部分的商品或其他商业产物，其中所述商品或其他产物可通过检测编码或包含TIC2463相关蛋白的显著部分的核苷酸区段或表达的RNA或其他蛋白质来通过商业追踪。“玉米商品”通常是玉米植物的被提供用于除种子以外的商业的任何部分以及谷物或植物的副产物。玉米商品包括但不限于植物物质、谷物或谷物的任何分裂片。实例可包括但不限于全谷物、带有可溶物的干燥谷物酒槽(“DDGS”)、青贮饲料、用于例如寝具、燃料或饲料的秸秆、玉米糖、玉米淀粉、乙醇以及本领域中已知的其他非种子玉米产物和副产物。

还在本申请中提供表达昆虫或鞘翅目昆虫抑制量的本文所述的一种或多种杀虫蛋白的转基因植物控制昆虫或鞘翅目昆虫侵扰的用途。任何上述转基因植物可用于用以保护植物免于昆虫或鞘翅目昆虫侵扰的方法中。获得表达鞘翅目昆虫活性蛋白如TIC2463相关蛋白的转基因植物的方法是本领域中已知的。

包含编码和表达在本申请中描述的一种或多种TIC2463相关毒素蛋白的重组多核苷酸序列的转基因植物(i)展示与对照植物相比增强的性状；并且(ii)产生含有所述重组多核苷酸序列的转基因种子和单倍体花粉。通过选择具有增强的性状的转化的植物或子代种子来鉴别具有增强的性状的这类植物。为了效率，选择方法被设计成评价包含重组DNA的多种转基因植物(事件)(例如，2至20或更多种转基因事件的多种植物)。从本申请中提供的转基因种子生长的转基因植物展现增强的性状。提及“增强的性状”意图指特定转基因植物展示有助于增加的杀虫耐受性或增加的收获产率(例如，与缺乏重组多核苷酸序列的植物相比，增加量的收获作物、油、碳水化合物、蛋白质、水果、浆果、坚果、谷物、种子或棉绒)或者提供增加的植物价值(包括例如，改进的种子、胚芽、油、碳水化合物、蛋白质或商品质量)的其他性状的农艺性状特征的改进。

提供用于从包含编码对应于本申请中提供的TIC2463相关毒素蛋白的杀虫多肽的重组多核苷酸分子的种子产生植物和收获作物的方法。所述方法包括以下步骤：通过将含有用于表达TIC2463相关蛋白的构建体的昆虫抗性第一植物与缺乏任何这种构建体的第二植物一起育种来进行杂交，获得源自所述杂交的至少一种子代植物，并且选择表达必需毒素蛋白的子代。所述子代是针对对TIC2463相关毒素蛋白敏感的一种或多种目标昆虫抗性的。种植种子以产生来自从所述种子种植的植物的作物并且收获所述作物(谷物、水果、浆果、蔬菜、碳水化合物、蛋白质、油、棉绒等)的步骤包括于所述方法中。在任何这种作物中收获的至少约50％的谷物意图包含所述重组多核苷酸分子。

还在本申请中公开了用TIC2463相关蛋白控制昆虫、特别是对作物植物有害的鞘翅目昆虫的方法。一种方法包括生长含有昆虫或鞘翅目昆虫抑制量的TIC2463相关蛋白的植物且将所述植物提供于目标昆虫的饲料中。在某些实施方案中，所述方法还可包括以下中的任何一个或多个：(i)将包含或编码TIC2463相关蛋白的任何组合物施加至所述植物或产生所述植物的种子；以及(ii)用编码TIC2463相关蛋白的多核苷酸转化所述植物或产生所述植物的植物细胞。所述植物可以是瞬时或稳定转化的转基因植物，所述植物包含表达昆虫或鞘翅目昆虫抑制量的TIC2463相关蛋白的转基因。所述植物还可以是包含TIC2463相关蛋白的组合物已施加至其的非转基因植物。在一个实施方案中，所述植物是玉米并且所述害虫物种是鞘翅目物种，特别是玉米根萤叶甲或相关物种。

在某些实施方案中，TIC2463相关蛋白的重组核酸分子是通过培养在适合于表达TIC2463相关毒素蛋白的条件下转化以表达所述TIC2463相关毒素蛋白的重组芽孢杆菌或任何其他重组细菌细胞而制备的昆虫抑制组合物的杀虫活性成分。所述方法可包括通过表达和产生重组多肽的重组苏云金芽孢杆菌细胞的培养物的干燥、冻干、均质化、萃取、过滤、离心、沉降或浓缩来制备。所述方法可产生苏云金芽孢杆菌细胞提取物、细胞悬浮液、细胞匀浆、细胞溶解产物、细胞上清液、细胞滤液或细胞沉淀。通过获得如此产生的重组多肽和蛋白质，包含所述重组多肽和蛋白质的组合物可包括细菌细胞、细菌孢子和芽孢样包涵体并且可被配制用于各种用途，包括农业杀虫喷雾产品或作为饲料生物测定中的昆虫抑制制剂。

在一个实施方案中，为了降低抗性发展的可能性，包含TIC2463相关蛋白的昆虫抑制组合物还可包含至少一种另外的多肽，所述多肽展示针对相同鞘翅目昆虫物种的昆虫抑制活性但不同于所述TIC2463相关毒素蛋白。用于这种组合物的可能的另外多肽包括昆虫抑制性蛋白和昆虫抑制性dsRNA分子。使用这类核糖核苷酸序列来控制昆虫害虫的一个实例描述于Baum等人(美国专利公布2006/0021087A1)中。用于控制鞘翅目害虫的这种另外多肽可选自由以下组成的组：昆虫抑制性蛋白如但不限于马铃薯糖蛋白、TIC100/101二元毒素、ET33/34二元毒素、TIC863、ET80/76二元毒素、ET70、Cry3Bb(美国专利No.6,501,009)、Cry1C变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、Axmi184、Axmi205、AxmiR1、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC3131、DIG-10、eHIP以及ω-Hexatoxin-Hv1a。

在其他实施方案中，这种组合物/制剂还可包含展示对不受本发明的另外昆虫抑制性蛋白抑制的昆虫的昆虫抑制活性的至少一种另外的多肽以扩大所获得的昆虫抑制的范围。例如，为了控制鳞翅目害虫，本发明的昆虫抑制性蛋白的组合可与用于控制鳞翅目害虫的另外多肽一起使用，但不限于如Cry1A(美国专利No.5,880,275)、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B(美国专利公布No.10/525,318)、Cry1C(美国专利No.6,033,874)、Cry1D、Cry1Da及其变体、Cry1E、Cry1F、及Cry1A/F嵌合体(美国专利No.7,070,982；6,962,705；和6,713,063)、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry1型嵌合体(如但不限于TIC836、TIC860、TIC867、TIC869和TIC1100、Cry2A、Cry2Ab(美国专利No.7,064,249)、Cry2Ae、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9)、Cry15、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET66、TIC400、TIC400、TIC800、TIC834、TIC1415、TIC3242、Vip3A、VIP3Ab、VIP3B、AXMI-184、AXMI-196、DIG-3、DIG-4、DIG-5、DIG-11、AfIP-1A及其衍生物(美国专利公布2014-0033361A1)、AfIP-1B及其衍生物(美国专利公布2014-0033361A1)、PIP-1APIP-1B(美国专利公布2014-0007292A1)、PSEEN3174(美国专利公布2014-0007292A1)、AECFG-592740(美国专利公布2014-0007292A1)、Pput_1063(美国专利公布2014-0007292A1)、Pput_1064(美国专利公布2014-0007292A1)、GS-135及其衍生物(美国专利公布2012-0233726A1)、GS153及其衍生物(美国专利公布2012-0192310A1)、GS154及其衍生物(美国专利公布2012-0192310A1)、GS155及其衍生物(美国专利公布2012-0192310A1)、如描述于美国专利公布2012-0167259A1中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于美国专利公布2012-0047606A1中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于美国专利公布2011-0154536A1中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于美国专利公布2011-0112013A1中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于美国专利公布2010-0192256A1中的SEQ ID NO:2和4及其衍生物、如描述于美国专利公布2010-0077507A1中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于美国专利公布2010-0077508A1中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于美国专利公布2009-0313721A1中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于美国专利公布2010-0269221A1中的SEQ ID NO:2或4及其衍生物、如描述于美国专利No.7,772,465(B2)中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于WO2014/008054A2中的CF161_0085及其衍生物、如描述于美国专利公布US2008-0172762A1、US2011-0055968A1和US2012-0117690A1中的鳞翅目毒性蛋白及其衍生物；如描述于US7510878(B2)中的SEQ ID NO:2及其衍生物、如描述于美国专利No.7812129(B1)中的SEQ ID NO:2及其衍生物等。此外，为了控制半翅目害虫，本发明的昆虫抑制性蛋白的组合可与半翅目活性蛋白如TIC1415(美国专利申请公布No.2013/0097735)、TIC807(美国专利No.8609936)和TIC834(美国专利申请公布No.2013/0269060)一起使用。用于控制鞘翅目、鳞翅目和半翅目昆虫害虫的另外多肽可在Neil Crickmore维护的苏云金芽孢杆菌毒素命名法网站上找到(万维网btnomenclature.info)。

一种昆虫抗性管理策略是采用表达通过不同作用模式操作的两种不同昆虫抑制剂的转基因作物。已在本领域中记录了昆虫发展对某些杀虫剂的抗性的可能性。因此，具有对所述昆虫抑制剂中的任一种的抗性的任何昆虫可通过另一种昆虫抑制剂进行控制。另一种昆虫抗性管理策略采用未针对靶向鞘翅目害虫物种进行保护以提供针对此类未保护的植物的防护的植物的使用。一个具体实例描述于美国专利No.6,551,962中，所述专利以引用的方式整体并入。

被设计用于控制也受本文公开的蛋白质控制的害虫的待与种子处理中的蛋白质、喷涂、浸涂或涂擦制剂一起使用的其他实施方案如局部施加的杀虫化学品可直接施加至土壤(土壤浇灌)、施加至表达本文公开的蛋白质的生长中植物或被配制成施加至含有编码所公开的一种或多种蛋白质的一种或多种转基因的种子。用于在种子处理中使用的这类制剂可用本领域中已知的各种粘附剂和增粘剂来施加。所述制剂可包含在作用模式上与所公开的蛋白质协同作用的杀虫剂，以使得制剂杀虫剂通过不同的作用模式起作用来控制可通过所公开的蛋白质控制的相同或类似的害虫，或以使得所述杀虫剂用于控制未通过TIC2463相关杀虫蛋白质有效控制的更广泛的宿主范围或植物害虫物种。

包含重组多肽和蛋白质的害虫抑制性组合物或制剂可进一步与农业上可接受的载体(如粉末、粉尘、球粒、颗粒、喷雾、乳液、胶体或溶液)、芽孢杆菌孢子/晶体制剂、经转化以表达一种或多种所述蛋白质的种子处理、重组植物细胞/植物组织/种子/植物、或经转化以表达一种或多种所述蛋白质的细菌组合。取决于重组多肽中固有的杀虫或除虫抑制的水平以及待施加至植物或饲料测定的制剂的水平，所述组合物或制剂可包含各种按重量计量的重组多肽，例如，0.0001重量％至0.001重量％至0.01重量％至1重量％至99重量％的重组多肽分子。

还在本申请中提供用于检测对应于TIC2463相关蛋白或其显著昆虫抑制片段或区段的DNA、RNA或蛋白质实施方案的方法或试剂盒，用于鉴别在本申请中描述的蛋白质属的另外成员的方法，用于鉴别与属家族成员相关的新颖蛋白质的方法，用于测试昆虫生长或侵扰的控制的方法以及用于提供对植物和其他受体宿主的所述控制的方法。

如上文所提及，TIC2463相关蛋白可用于产生特异性地结合这种类别/属的蛋白质的抗体(或类似的特异性结合剂如抗运载蛋白、脂质运载蛋白和/或α体)，并且这些抗体可用于筛选且发现所述属的其他成员。在本文中提及词语“抗体”意图指可通过任何方式进行修饰以实现与靶分子的抗原或表位的特异性结合的任何类别的蛋白质，包括动物抗体(包括IgA、IgE、IgG和IgM型抗体)以及植物和细菌蛋白质结构如抗运载蛋白、脂质运载蛋白和α体以及凝集素)。具体地考虑了与本文公开的一种或多种重组多肽的表位特异性地结合作为TIC2463相关毒素蛋白或其部分的单独或呈抗体混合物的抗体。还考虑了使用单独或呈抗体混合物的这种抗体检测或定量共享本文公开的蛋白质的表位的蛋白质的方法。这种检测或定量方法可包括以下步骤：使样品与所述抗体相接触并且使用本领域中熟知的检测装置来检测抗体与所述样品中的多肽靶标的结合。在考虑一种或多种表位且其组合用于这种方法的情况下，识别不同表位的抗体或抗体混合物的结合可鉴别展示与本文描述的重组多肽的同源性的多肽。

提供了用于检测疑似含有TIC2463或相关多肽靶标的样品中的多肽靶标的存在的试剂盒。所述试剂盒将包括用于表位检测的一种或多种试剂以及一种或多种对照试剂以显示所述检测在统计方差内操作。考虑可包括于所述试剂盒中的试剂储存、检测装置和试剂的用途的说明书以及另外的部件和工具。

提供测试方法来测试本文描述的TIC2463相关多肽的杀虫活性。所述方法在本文单独地称为“生物测定(bioassay)”并且多个测试称为“生物测定(bioassays)”。本文描述测量生长抑制、死亡率或两者的组合的定性昆虫生物测定。在以下实施例中测试的昆虫目包括鞘翅目。饲料配方和制备、测试样品和对照样品的制备、昆虫准备以及用于进行测定的程序通常依赖于经受任何特定评价的昆虫和/或害虫的类型和大小。

根据上述内容，本领域技术人员应了解，在不脱离本文所述的实施方案的精神和范围的情况下可在已公开并仍获得类似或相似结果的特定方面中做出改变。因此，在以下描述的实验实施例中公开的具体细节不意图是限制性的，也不应被解释为限制性的。

实施例

根据上述内容，本领域技术人员应了解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可在已公开并仍获得类似或相似结果的特定方面中做出改变。因此，本文公开的具体结构和功能细节不应被解释为限制性的。应了解本文引用的每个参考文献的完整公开内容并入本申请的公开内容。

实施例1

TIC2463相关杀虫蛋白的发现、克隆和表达

鉴别了展示独特属性、特别是杀虫活性的苏云金芽孢杆菌(“Bt”)菌株，并且针对每种菌株构建了基因组文库。所述细菌菌株的基因组文库是在载体中产生的，从所述载体鉴别了包含编码假设展示杀虫活性的氨基酸序列的开发阅读框(“ORF”)的克隆。

发现一种Bt菌株EG3957展示鞘翅目杀虫活性。从所述菌株的基因组构建的文库产生了似乎包含编码新颖Bt蛋白TIC1373(SEQ ID:40)的ORF的克隆的鉴别。所述TIC1373氨基酸序列似乎展示与被称为Cry60的已知Bt杀虫毒素的远缘关系(小于29％氨基酸序列同一性)。Cry60蛋白包含为梭菌属ε毒素ETX家族成员以及灭蚊毒素MTX家族成员(pfam03318)的特征的肽元件。Cry60蛋白还与Cry15Aa1蛋白相关，因为Cry60和Cry15Aa1两者包含ETX/MTX pfam特征。尚不了解Cry60和Cry15蛋白是杀虫的，对蚊幼虫可能例外。因此，这种明显新颖的Bt蛋白TIC1373(SEQ ID NO:40)与Cry60和Cry15pfam的远缘关系暗示杀虫活性可从自质粒表达TIC1373肽观察到，所述质粒含有指导苏云金芽孢杆菌的无晶体菌株中的TIC1373ORF的表达的Bt孢子形成启动子。当针对一连串植物害虫在生物测定中进行测试时，所得到的重组菌株未能展示任何杀虫活性，并且对应于预测的TIC1373的质量的蛋白质未在培养上清液或孢子/细胞沉淀中检测到。

TIC1373蛋白质序列与ETX/MTX型毒素Cry60的远缘关系表明所述TIC1373蛋白可展示一些异常的或难以表征的杀虫活性。然而，如先前所解释，TIC1373肽未展示针对在一连串昆虫生物测定中测试的任何昆虫的杀虫活性，所述测试包括针对鞘翅目、鳞翅目和半翅目害虫物种的测试。假设与TIC1373肽相关的蛋白质可存在于其他微生物菌株中并且相关蛋白质的氨基酸序列内存在的变异可能产生毒素活性。因此，TIC1373蛋白编码序列被用于鉴别包含与预测的TIC1373蛋白同源的相关序列的其他微生物菌株。对这类同源序列进行克隆和测序，并且鉴别了与TIC1373开放阅读框类似的开放阅读框。

所鉴别的一种另外的同源蛋白质在SEQ ID NO:2中列出，其在本申请中被指定为TIC1825。如在SEQ ID NO:1中列出的编码TIC1825的序列是从Bt菌株EG5015获得的。所预测的TIC1825蛋白氨基酸序列展示与TIC1373的实质同一性(跨TIC1373蛋白的长度77％同一性)。出人意料地，与TIC1373蛋白相比，TIC1825包含额外的31个N末端氨基酸。来自Bt的无晶体菌株的TIC1825蛋白的表达出人意料地在细胞沉淀以及培养上清液中展示鞘翅目杀虫活性，从而表明所述蛋白质毒素可被分泌至培养基中。

从培养上清液收集TIC1825蛋白并且所述蛋白质的N-末端氨基酸序列分析指示从TIC1825基因ORF预测的TIC1825蛋白是包含在苏云金芽孢杆菌的无晶体菌株中表达时可能负责靶向新生TIC1825蛋白以分泌至培养上清液中的33个氨基酸的信号肽的前体蛋白。据确定全长TIC1825开放阅读框(SEQ ID NO:1从核苷酸位置1-945)编码加工成由核苷酸100-945编码的成熟毒素蛋白的毒素前体蛋白。分泌的蛋白质氨基末端序列信息与ORF编码在所述蛋白质的分泌形式中不存在的N-末端肽区段的事实相结合，表明预测的氨基末端肽区段是由如在SEQ ID NO:1中列出的核苷酸1-99编码的分泌信号肽。

基于所述TIC1825数据，从Bt菌株EG3957获得了另外的序列信息，已最初总所述菌株获得了TIC1373数据。据确定另外的序列信息存在于原始TIC1373克隆的上游，所述克隆包含编码类似于由TIC1825编码序列编码的N-末端信号肽区段的N-末端氨基酸区段的序列。将所述另外信息与TIC1373序列信息组装在一起产生编码TIC2463(SEQ ID NO:4)的ORF。出人意料地，含有编码TIC2463的ORF(来自核苷酸位置1至939的SEQ ID NO:3)的克隆的表达产生对鞘翅目物种毒性的杀虫活性，存在于培养上清液以及部分地保留在培养物的细胞沉淀中。

针对TIC2463相关毒素蛋白的存在筛选展示鞘翅目毒性活性的另外Bt菌株。表3总结所发现的Bt菌株和毒素。

表3Bt菌株、与TIC2463相关的蛋白质和SEQ ID NO

实施例2

TIC2463相关蛋白在昆虫生物测定中展示鞘翅目活性

TIC2463相关杀虫蛋白在Bt中表达且针对对不同鞘翅目物种的毒性进行测定。将来自Bt的每种毒素的制剂针对鞘翅目物种马铃薯甲虫(科罗拉多马铃薯甲虫，CPB)、玉米根萤叶甲(西部玉米根虫，WCR)和十一星叶甲食根亚种(南部玉米根虫，SCR)进行测定。

如在实施例1中所描述发现的蛋白质是从用编码相应TIC2463相关蛋白的载体转化的重组无晶体Bt菌株产生的。蛋白质是从重组细菌发酵提取的且用于饲料生物测定中。

用于饲料生物测定的蛋白质样品被提供为孢子晶体蛋白质悬浮液或用过的细菌生长培养基中的可溶性蛋白。在Tris-HCl(10mM,pH＝8)、EDTA(0.1mM)、Triton-X 100(0.005％v/v)和benzonase(0.001％w/v)的缓冲液中制备蛋白质的晶体孢子蛋白质悬浮液。测定蛋白质浓度且使用悬浮缓冲液稀释为适当。

将蛋白质的测试样品覆盖至单独生物测定区室的饲料表面上。通过将等份的悬浮缓冲液或用过的生长培养基(在适当的情况下)覆盖至饲料表面上来制备对照样品。将每个区室用单一昆虫物种侵扰，孵育且针对死亡率和萎缩评分。

对于CPB测定，将每个样品孔用八个新生体侵扰。将样品区室置于25C和70％相对湿度下的无光照的受控环境中持续五天时间段。对于WCR测定，将每个样品孔用八个新生体侵扰。将样品区室在25C和70％相对湿度下的无光照的受控环境中孵育六天时间段。对于SCR测定，将五至七个洗涤多的卵置于每个样品区室的饲料表面上。将所述板储存在25C和70％相对湿度下的无光照的受控环境中持续约二十四小时的时间段且针对孵化进行监测。在孵化后六天对所述测定评分。

通过针对死亡计数(仅基于受侵扰的孔)和萎缩水平对样品进行评分来测量CPB和WCR测定中的杀虫活性。对于SCR测定，昆虫死亡率仅基于被观察到已孵化的卵的数目。对萎缩(表示针对未处理的标本的大小，存活昆虫的相对大小)进行视觉估计。

将TIC1825(SEQ ID NO:2)和TIC2463(SEQ ID NO:4)在如所描述的饲料生物测定中针对抗CPB功效进行测试。TIC1825被提供为晶体孢子悬浮液。在至少0.008微克蛋白质/毫升饲料的蛋白质浓度下观察到死亡。在所测试的所有浓度下观察到萎缩。在缓冲液对照样品情况下未观察到萎缩或死亡。TIC2463被提供为晶体孢子制剂和用作的培养基中的可溶性蛋白。所述晶体孢子制剂以及用过的培养基均展示显著死亡。所述晶体孢子制剂在低至0.162微克蛋白质/毫升饲料的浓度下展示死亡。用过的培养基在低至0.600微克/毫升饲料的浓度下展示死亡。在缓冲液对照样品情况下未观察到萎缩或死亡。TIC2463和TIC1825两者均展现针对CPB的杀虫活性。

制备了另外的TIC2463相关毒素且针对抗CPB和WCR功效进行了测试。这些生物测定实验的结果报告在表4中。除TIC1825和TIC2463之外，TIC3891(SEQ ID NO:18)、TIC2461(SEQ ID NO:6)、TIC3626(SEQ ID NO:22)、TIC3037(SEQ ID NO:8)、TIC1825v1(SEQ ID NO:26)、TIC1825v2(SEQ ID NO:28)和TIC1825v3(SEQ ID NO:30)也展示杀虫活性。

表4.TIC2463家族蛋白质的杀虫活性

仅CPB和WCR饲料测定

M–在所测试的浓度下观察到的死亡率(对比缓冲液对照)

S–在所测试的浓度下萎缩的幸存者(对比缓冲液对照)

NA–如所测试无活性

NT–未测试

+-有效结果

实施例3

TIC1825氨基酸序列变体

此实施例示出某些TIC1825氨基酸序列变体在生物测定中与天然TIC1825蛋白相比展示针对玉米根虫的改进的杀虫活性。

对应于TIC2463相关毒素蛋白家族成员中的每种的毒性部分的氨基酸区段的比对显示所述家族成员之间的氨基酸序列差异。采用如在图1中列出的比对数据连同如在以上表4中列出的毒性概况数据，观察到在对应于如在TIC2463的SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列位置233的位置处包含丙氨酸的TIC2463相关蛋白当针对CPB和玉米根虫进行测试时展示毒性。这表明如果在TIC1825中的氨基酸位置233处或附近的氨基酸更密切地类似在TIC2463中的对应位置处的氨基酸，则展示针对CPB但不针对CRW的毒性活性的蛋白质如TIC1825可展示更广泛的宿主范围和可能更大的毒性作用。

为了测试这种假设，产生了含有与TIC2463内的类似位置一致的各种氨基酸取代的TIC1825蛋白并且包括于针对玉米根虫和CPB的生物测定中。使TIC1825编码序列(SEQ ID NO:1)经受修饰，所述修饰导致编码在位置233处的氨基酸甘氨酸(G)的密码子改变为丙氨酸(A)并且编码在位置234处的氨基酸脯氨酸(P)的密码子改变为丙氨酸。这些修饰中的每种引起TIC1825蛋白在这些位置处更密切地类似TIC2463。TIC1825_G233A变体(TIC1825v1，SEQ ID NO:26)被构建为仅包含在位置233处的G至A改变(由SEQ ID NO:25编码)。TIC1825_P234A变体(TIC1825v2，SEQ ID NO:28)被构建为仅包含在位置233处的P至A改变(由SEQ ID NO:27编码)。构建了第三变体(TIC1825v3，SEQ ID NO:30，由SEQ ID NO:29编码)，其中在位置233和234处引入丙氨酸取代，连同在位置224处苏氨酸(T)取代赖氨酸(K)，在位置226处天冬酰胺(N)取代天冬氨酸(D)，在位置246处苏氨酸(T)取代亮氨酸(L)，以及在位置248处缬氨酸(V)取代苏氨酸(T)。这些变化由图1D中对应于TIC1825_V1、_V2和_V3的行上的粗体指明的存在反映。

编码这些氨基酸序列变体的构建体在苏云金芽孢杆菌的无晶体菌株中表达。将对应于从这些重组菌株的发酵产生的TIC1825变体的蛋白质分离以用于在针对玉米根虫以及其他叶甲属物种的饲料生物测定中随后测试。所述变体被观察到展示玉米根虫生物活性，并且所述结果在表4的最后三行中示出。

可使用类似的取代和针对玉米根虫的生物活性的确认来测试在对应氨基酸位置233处不包含丙氨酸且不展示玉米根虫生物活性的TIC2463相关毒素蛋白家族成员。预计将其他TIC2463相关毒素蛋白家族成员修饰为在氨基酸位置233处包含丙氨酸将产生针对玉米根虫的杀虫活性。

实施例4

当在稳定转化的玉米植株中表达时，TIC2463相关蛋白展现针对鞘翅目害虫的活性

此实施例证明当在植物中表达时，也展示实施例2中所示的TIC2463相关毒素蛋白和实施例3中列出的TIC1825变体的体外生物活性。当被鞘翅目害虫物种如玉米根虫侵扰时，表达这些蛋白质的玉米植株显示显著减少的根损伤。

编码源自芽孢杆菌细菌系统的蛋白质的多核苷酸序列对于在植物中表达来说是无效的(U.S.5,500,365)。已经构建了包含被设计用于在植物中使用的编码TIC2463相关蛋白毒素的人工多核苷酸序列的表达盒。在本文提供如在SEQ ID NO 33、35、43、44、45、46和47中列出的多核苷酸序列。这些多核苷酸序列中的每种编码TIC2463相关蛋白毒素，并且各自可被引入含有至少可操作地连接至编码所述毒素蛋白的多核苷酸序列的植物功能启动子的DNA构建体中。编码所述TIC2463相关毒素蛋白的多核苷酸序列还将在所述毒素编码序列的3’端处包含翻译终止密码子(TAA、TAG或TGA)，其之后是且可操作地连接至对应于植物功能性3’转录终止和多腺苷酸化序列的DNA区段。所述表达盒可通过微粒轰击法、输注或本领域的普通技术人员已知的其他转化方法直接引入植物细胞中。所述表达盒可通过微粒轰击法、输注或本领域的普通技术人员已知的其他转化方法直接引入植物细胞中。在任一情况下，将所述构建体稳定且可遗传的引入植物基因组中允许选择一种或多种转基因事件，可针对TIC2463相关毒素蛋白的杀虫有效量的表达对所述转基因事件进行测试。在所述植物中表达的TIC2463相关毒素蛋白可被设计成表达天然信号肽或异源信号肽或靶向肽。所述异源信号肽可以是源自不同TIC2463相关毒素蛋白的信号肽、芽孢杆菌物种中功能性的其他细菌信号肽、植物功能性信号肽或靶向肽。对于适用宿主细胞，这些信号/靶向肽将通过将TIC2463相关毒素蛋白的成熟毒素区段分泌至亚细胞细胞器或区室如叶绿体、质体、线粒体、液泡或造粉体中来插入。

将表达Cry3Bb的F1转基因玉米植株用作阳性对照。阴性对照不包含编码杀虫毒素蛋白的转基因。将转化为包含表达TIC2463相关蛋白的构建体的F1玉米植株与阴性对照和Cry3Bb转基因事件进行比较。将所述F1植株转移至笼形盆中的土壤，每盆用六十个WCR新生体侵扰，并且在受控的温室条件下生长十三天。在六十天之后将植株针对根损伤进行评价并且使用由Oleson等人(Journal of Economic Entomology(2005)98(1):1-8)描述的评定量表进行评分。得分零与无损伤一致，得分三与三个或更多个接点已被修剪至杆的1.5英寸内的观察结果一致。通过计数在评价周期结束时仍存在的3龄幼虫的数目来评定昆虫死亡率。

针对单独事件计算F1测定结果。所测试的表达TIC2463的八个不同转基因事件中的三个展示与阴性对照相比显著减少的根损伤。表达TIC1825的九个单独事件各自展示比在阴性对照中观察到的损伤一样或更坏的损伤。

还获得了重组/转基因植物，所述植物分别从如在SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37中列出的编码序列表达靶向造粉体(SEQ ID NO:36)或叶绿体(SEQ ID NO:38)的TIC2463。将转基因植物事件针对对玉米根虫侵扰的抗性进行测试。当与缺乏TIC2463蛋白的植株进行比较时，所述转基因植物被观察到对根虫侵扰具有抗性。

类似地，将玉米植株进行转化并且获得了表达以下TIC2463相关蛋白变体的转基因植株：TIC1825_12(SEQ ID NO:49)、TIC1825_13(SEQ ID NO:51)、TIC1825_15(SEQ ID NO:53)、TIC2461_5(SEQ ID NO:55)、TIC2463_3(SEQ ID NO:32)、TIC2463_4(SEQ ID NO:34)、TIC2463_8(SEQ ID NO:57)、TIC2463_9(SEQ ID NO:59)和TIC2463_10(SEQ ID NO:61)。在测试时，当与缺乏TIC2463相关蛋白的植株进行比较时，这些转基因植物被发现对玉米根虫损伤具有抗性。

获得了表达具有如在SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30中列出的氨基酸序列的TIC1825氨基酸序列变体的转基因事件并且将所述转基因事件与表达靶向叶绿体的TIC1825天然毒素区段或靶向叶绿体的TIC2463毒素进行比较。转化为包含TIC1825氨基酸序列变体的植株将展示与表达天然TIC1825毒素蛋白的植物相比显著改进的玉米根虫抗性。

本公开因此特别地考虑表达TIC2463相关蛋白的转基因事件(用被设计用于表达TIC2463相关蛋白的多核苷酸转化的玉米植株)。所述植株可具有表达TIC2463相关蛋白的直接连接至至少一种另外构建体的构建体，所述至少一种另外的构建体被设计用于表达另外的毒性剂，如被设计用于特异性地靶向抑制鞘翅目害虫中的关键基因的dsRNA(所述鞘翅目害虫可与靶向通过TIC2463相关毒素蛋白控制的害虫相同或不同的害虫)。或者，被设计用于表达另外的毒性剂的连接的另外构建体可编码一种或多种另外的毒素蛋白，并且至少一种壳与TIC2463相关毒素互补，从而提供将降低靶向鞘翅目害虫对由所述植株产生的鞘翅目特异性毒素中的任一种的抗性发展的可能性的另外作用模式。所述一种或多种另外的毒素蛋白还可包含针对不同物种如鳞翅目、半翅目、同翅目或缨翅目害虫物种的害虫或植物病原性线虫或真菌植物病原体具有活性的毒素。转化为表达所述TIC2463相关毒素的植株还可通过与其他性状一起培育来进行组合，所述性状包括但不限于与TIC2463相关毒素作用模式互补的鞘翅目特异性性状、鳞翅目性状、对增加产率具有特异性的性状、降低对干旱的敏感性、增加氮利用等的效率以及本领域中已知的提供对除草剂施加的耐受性的性状。具体地考虑补充TIC2463相关毒素作用模式的毒性活性的种子处理和局部施加的制剂，以及用于控制植物中的基因(具体地说dsRNA施加)或用于控制如上所述的其他害虫物种的化学品。

实施例5

TIC2463的最小活性核心

此实施例说明TIC2463杀虫活性的最小活性核心序列。

设计、克隆且表达了TIC2463相关蛋白缺失突变体以测定针对西部玉米根虫(WCR)的活性所需的最小蛋白质序列。为了研究TIC2463的活性核心，选择了在蛋白质的六个区域中具有缺失的突变体以用于WCR生物测定测试。将表达蛋白质的缺失突变体纯化且标准化至50ppm且在WCR饲料生物测定中进行测试，其中TIC2463(SEQ ID NO:4)作为比较者。生物测定萎缩数据表明推定分泌信号位点和C末端的缺失维持针对WCR的活性。这些缺失突变体蛋白的萎缩得分是2-3，而野生型是3。此外，在氨基酸40处的缺失不显示活性，从而指示氨基酸40对于活性来说是关键的。在序列的中部和朝向蛋白质的N末端的环附近的缺失导致活性丧失。这些缺失突变体蛋白的萎缩得分是0-1，而野生型是3。

基于此生物测定数据，从氨基酸残基40至309的中心序列似乎是TIC2463的具有杀虫活性的最小核心。