在双链核酸分子的两端使用纳米孔和锚分子来表征所述双链核酸的方法与流程

文档序号:12285408阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种使用膜中的跨膜孔表征目标双链多核苷酸的方法,包括:

a)提供一端具有Y适配体和另一端具有发夹环适配体的所述目标双链多核苷酸,其中所述Y适配体包括用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第一锚,其中所述发夹环适配体包括用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第二锚,并且其中将所述发夹环适配体耦合到所述膜的强度比将所述Y适配体耦合到所述膜的强度大;

b)将在步骤a)中提供的所述多核苷酸与所述跨膜孔接触,使得所述多核苷酸的至少一条链移动穿过所述孔;和

c)随着所述多核苷酸的至少一条链相对于所述孔移动,获取一个或多个测量值,其中所述测量值表示所述多核苷酸的至少一条链的一个或多个特征且由此表征所述目标双链多核苷酸。

2.根据权利要求1所述的方法,其中(a)所述发夹环适配体比所述Y适配体包括更多的锚,(b)将所述一个或多个第二锚耦合到所述膜的强度比将所述一个或多个第一锚耦合到所述膜的强度大,(c)将所述一个或多个第二锚耦合到所述发夹环适配体的强度比将所述一个或多个第一锚耦合到所述Y适配体的强度大,(d)所述一个或多个第一锚和一个或多个第二锚通过杂交将它们各自的适配体耦合到所述膜,且所述一个或多个第二锚中的杂交强度大于所述一个或多个第一锚中的杂交强度,(e)所述一个或多个第一锚包括一个或多个刚性连接体,且所述一个或多个第二锚包括一个或多个柔性连接体,或(f)(a)至(e)的任何组合。

3.根据权利要求2所述的方法,其中(i)使用胆固醇将所述一个或多个第二锚耦合到所述膜,且使用棕榈酸酯将所述一个或多个第一锚耦合到所述膜,(ii)使用单酰基物质将所述一个或多个第二锚耦合到所述膜,且使用二酰基物质将所述一个或多个第一锚耦合到所述膜,(iii)所述一个或多个第一锚包括一个或多个多核苷酸连接体,且所述一个或多个第二锚包括一个或多个柔性连接体,所述柔性连接体包括一个或多个间隔区9(iSp9)基团或一个或多个间隔区18(iSp18),(iv)(i)和(iii)的组合,或(v)(ii)和(iii)的组合。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤a)包括,修饰所述目标双链多核苷酸,使得其一端包括Y适配体和另一端包括发夹环适配体。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤b)包括将在步骤a)中提供的所述多核苷酸与跨膜孔接触,使得所述多核苷酸的两条链移动穿过所述孔,且步骤c)包括随着所述多核苷酸的两条链相对于所述孔移动,获取一个或多个测量值,其中所述测量值表示所述多核苷酸的链的一个或多个特征,且由此表征所述目标多核昔酸。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述一个或多个特征选自:(i)所述多核苷酸的长度,(ii)所述多核苷酸的同一性,(iii)所述多核苷酸的序列,(iv)所述多核苷酸的二级结构,以及(v)所述多核苷酸是否被修饰。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述多核苷酸的所述一个或多个特征通过电测量和/或光学测量进行测量。

8.根据权利要求7所述的方法,其中所述电测量是电流测量、阻抗测量、隧道测量或场效应晶体管(FET)测量。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤b)进一步包括将在步骤a)中提供的所述多核苷酸与多核苷酸结合蛋白接触,使得所述蛋白控制所述多核苷酸的至少一条链移动穿过所述孔。

10.根据权利要求9所述的方法,其中所述方法包括:

b)将在步骤a)中提供的所述多核苷酸与跨膜孔和多核苷酸结合蛋白接触,使得所述多核苷酸的至少一条链移动穿过所述孔,且所述蛋白控制所述多核苷酸的至少一条链移动穿过所述孔;和

c)随着所述多核苷酸的至少一条链相对于所述孔移动,测量穿过所述孔的电流,其中所述电流表示所述多核苷酸的至少一条链的一个或多个特征,且由此表征所述目标双链多核苷酸。

11.根据权利要求9或10所述的方法,其中所述多核苷酸结合蛋白衍生自解旋酶。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述膜是两亲性层或固态层。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述跨膜孔是跨膜蛋白孔。

14.根据权利要求13所述的方法,其中所述跨膜蛋白孔衍生自耻垢分枝杆菌孔蛋白(Msp),α-溶血素(α-HL)或胞溶素。

15.一种修饰目标双链多核苷酸以使用膜中的跨膜孔进行表征的方法,包括将Y适配体接合到所述多核苷酸的一端,且将发夹环适配体接合到所述多核昔酸的另一端,其中所述Y适配体包括用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第一锚,其中所述发夹环适配体包括用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第二锚,且其中将所述发夹环适配体耦合到所述膜的强度比将所述Y适配体耦合到所述膜的强度大,且由此提供经修饰的目标双链多核苷酸。

16.一种修饰目标双链多核昔酸以使用膜中的跨膜孔进行表征的方法,包括

(a)将Y适配体接合到所述多核苷酸的一端,且将发夹环适配体接合到所述多核苷酸的另一端;和

(b)向所述Y适配体上连接用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第一锚,向所述发夹环适配体上连接用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第二锚,且由此提供经修饰的目标双链多核苷酸;

其中将所述发夹环适配体耦合到所述膜的强度比将所述Y适配体耦合到所述膜的强度大。

17.根据权利要求15或16所述的方法,其中所述适配体和/或锚如权利要求2或3中所定义。

18.一种目标双链多核昔酸,使用权利要求15至17中任一项所述的方法进行修饰。

19.一种修饰目标双链多核苷酸以使用膜中的跨膜孔进行表征的方法,包括将所述目标多核苷酸与MuA转座酶和一组双链MuA底物接触,其中所述组中底物的一部分是含有将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第一锚的Y适配体,其中所述组中底物的一部分是含有将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第二锚的发夹环适配体,并且其中将所述发夹环适配体耦合到所述膜的强度比将所述Y适配体耦合到所述膜的强度大,且由此产生多个经修饰的双链多核苷酸。

20.一种修饰目标双链多核苷酸以使用膜中的跨膜孔进行表征的方法,包括:

(a)将所述目标多核苷酸与MuA转座酶和一组双链MuA底物接触,其中所述组中底物的一部分是Y适配体,且其中所述组中底物的一部分是发夹环适配体,使得所述转座酶将所述目标多核苷酸片段化,且将底物接合到所述双链片段的一端或两端,且由此产生多个片段/底物构建体;和

(b)向所述多个片段/底物构建体中的所述Y适配体上连接一个或多个第一锚,且向所述多个片段/底物构建体中的发夹环适配体上连接一个或多个第二锚,且由此产生多个修饰的双链多核苷酸;

其中将每个发夹环适配体耦合到所述膜的强度比将每个Y适配体耦合到所述膜的强度大。

21.根据权利要求19或20所述的方法,其中所述组中的每个底物包括通用核苷酸的至少一个突出端,使得所述转座酶将所述目标多核苷酸片段化,且将底物接合到所述双链片段的一端或两端,并由此产生多个片段/底物构建体,且其中所述方法进一步包括将所述突出端接合到所述构建体中的片段,并由此产生多个修饰的双链多核苷酸。

22.权利要求19或20所述的方法,其中所述组中的每个底物包括(i)至少一个突出端,和(ii)与所述至少一个突出端在同一链中的至少一个核苷酸,其包括不存在于所述目标多核苷酸中的核苷,使得所述转座酶将所述目标多核苷酸片段化,且将底物接合到所述双链片段的一端或两端,且由此产生多个片段/底物构建体,且其中所述方法进一步包括:

(a)通过选择性地去除所述至少一个核苷酸从构建体去除突出端,且由此产生包含单链空位的多个双链构建体;和

(b)修复所述构建体中的所述单链空位,并由此产生多个修饰的双链多核昔酸。

23.使用根据权利要求19至22中任一项所述的方法修饰的多个多核苷酸。

24.一种使用膜中的跨膜孔表征目标双链多核苷酸的方法,包括:

a)提供在一端具有Y适配体和在另一端具有发夹环适配体的所述目标双链多核苷酸,其中所述Y适配体包括用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第一锚,其中所述发夹环适配体包括用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第二锚,且其中将所述发夹环适配体耦合到所述膜的强度比将所述Y适配体耦合到所述膜的强度大;

b)将在步骤a)中提供的所述多核苷酸与所述跨膜孔、聚合酶和标记的核苷酸接触,使得当通过所述聚合酶将核苷酸加入到所述多核苷酸时,磷酸盐标记的物质依次释放,其中所述磷酸盐物质含有对每个核苷酸具有特异性的标记;和

c)使用所述孔检测所述磷酸盐标记的物质,且由此表征所述目标双链多核苷酸。

25.一个适配体对,用于修饰目标双链多核苷酸以使用膜中的跨膜孔进行表征,其中一个适配体是Y适配体,所述Y适配体包含用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第一锚,其中另一个适配体是发夹环适配体,所述发夹环适配体包含用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第二锚,并且其中将所述发夹环适配体耦合到所述膜的强度比将所述Y适配体耦合到所述膜的强度大。

26.一个适配体组,用于修饰目标双链多核苷酸以使用膜中的跨膜孔进行表征,其中所述适配体中的一部分是Y适配体,其包含用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第一锚,其中所述适配体中的一部分是发夹环适配体,其包含用于将所述多核苷酸耦合到所述膜的一个或多个第二锚,且其中将所述发夹环适配体耦合到所述膜的强度比将所述Y适配体耦合到所述膜的强度大。

27.根据权利要求25所述的适配体对,或根据权利要求26所述的适配体组,其中每个适配体包括双链MuA底物。

28.根据权利要求27所述的适配体对或适配体组,其中每个适配体如权利要求21或22中所定义。

29.一个用于修饰目标多核苷酸的试剂盒,包括(a)根据权利要求28所述的适配体对或适配体组,和(b)MuA转座酶。

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