本发明涉及酰化含有氨基的环状肽的方法以及所述方法在制备阿尼芬净和米卡芬净中的应用。
背景技术：
：环状肽是天然存在的化合物但也可通过完全合成或通过对天然产生或天然存在的前提的合成或遗传修饰来获得。后一种类型被称为半合成环状肽。当环状肽含有一个或多个脂质尾或酰基链时，这种环状肽被称为环状脂肽。具有抗生素和/或抗真菌活性的环状脂肽包括化合物如达托霉素和安福霉素并且环状脂肽的出色示例是棘白菌素类，其是强效抗真菌剂。棘白菌素类是具有n-连接的酰基脂质侧链并且分子量为1000-1400da的两性六肽。医学上可用的棘白菌素类的示例是环状六肽阿尼芬净(式(a))、卡泊芬净、西洛芬净(cilofungin)和米卡芬净(式(b))，其可用于治疗真菌感染，尤其是由曲霉属(aspergillus)、芽生菌属(blastomyces)、念珠菌属(candida)、孢子菌属(coccidioides)和组织胞浆菌属(histoplasma)引起的感染。阿尼芬净(1-[(4r，5r)-4，5-二羟基-n2-[[4″-(戊氧基)[1，1′：4，1″-三联苯基]-4-基]羰基]-l-鸟氨酸]棘白菌素b)、卡泊芬净(1-[(4r，5s)-5-[(2-氨基乙基)氨基]-n2-(10，12-二甲基-1-氧代四-癸基)-4-羟基-l-鸟氨酸]-5-[(3r)-3-羟基-l-鸟氨酸]纽莫康定b0)和米卡芬净(1-[(4r，5r)-4，5-二羟基-n2-[4-[5-[4-(戊氧基)苯基]-3-异噁唑基]苯甲酰基]-l-鸟氨酸]-4-[(4s)-4-羟基-4-[4-羟基-3-(磺氧基)苯基]-l-苏氨酸]纽莫康定a0)都是可从天然存在的棘白菌素类如棘白菌素b、纽莫康定(pneumocandin)a0、纽莫康定b0或fr901379衍生的半合成环状六肽。在工业上，fr901379是硫酸氢5-((1s，2s)-2-{{2r，6s，9r，11r，12r，14as，15s，16s，20s，23s，25as)-20-((r)-3-氨基-1-羟基-3-氧代-丙基)-2，11，12，15-四羟基-6-((r)-1-羟基乙基)-16-甲基-5，8，14，19，22，25-六-氧代-9-棕榈酸酰胺基二十四碳氢-1h-二吡咯并[2，1-c：2′，1′-1][1，4，7，10，13，16]六氮杂-环汉尼可辛(clohenicosin)-23-基)-1，2-二羟基乙基)-2-羟基苯基酯(cas144371-88-0；c51h82n8o21s)的一般公认代码。一般由微生物产生天然环状脂肽。由土壤细菌玫瑰孢链霉菌(streptomycesroseosporus)产生达托霉素。由暗灰链霉菌(streptomycescanus)产生安福霉素。天然棘白菌素类如棘白菌素b、棘白菌素c、阿库来菌素aγ、纽莫康定b0和fr901379也一般由各种微生物产生。例如，棘白菌素b由真菌构巢曲霉(aspergillusnidulans)产生，并且fr901379由真菌鞘茎点霉(coleophomaempetri)产生。环状脂肽的酰基链已经显示是抗真菌活性和毒性的重要决定因素(debonom.和gordeer.s.，annu.rev.microbiol.48，471(1994))。例如，含与n-末端连接的脂肪酸酰基的天然存在的环状抗真菌脂肽fr901379显示强效的体内抗真菌活性(iwamoto，t.，fujiea.，nitta，k.，hashimoto，s.，okuhara，m.，kohsaka，m.，j.antibiot.47，1092(1994))。不幸的是，就像一些其他天然存在的棘白菌素类那样，其也显示出高溶血活性。酶促去除脂肪酸链并替换为辛氧基苯甲酰基酰基链显示保留了fr901379的原始活性但显著降低了溶血活性。另一个示例是米卡芬净，其通过将fr901379的脂质尾交换成复杂的3，5-二苯基取代的异噁唑酰基基团来产生(fujie，pureappl.chem.79，4期，第603-614页(2007))。因此，环状脂肽的天然酰基链的脱酰允许导入替代的侧链，其改善了抗真菌功效并降低溶血活性。已经通过来自犹他游动放线菌(actinoplanesutahensis)的阿库来菌素a酰基转移酶的手段实现了环状脂肽，如棘白菌素类的脱酰。jp4228072(a)公开了催化脂质环状肽代谢物，如棘白菌素b和阿库来菌素的脂质酰基部分的脱酰的酶。jp4075585描述这种酰基转移酶可在作为宿主生物体的链霉菌中培养。在从培养溶液中收集阿库来菌素a酰基转移酶之后，其直接用于对底物脱酰。在优化酶促脱酰的过程中，发现一些链霉菌物种的酰基转移酶是更高效的。ep0885957a1描述了来自链霉菌属的环状脂肽酰基转移酶，其能够对环状脂肽化合物的酰基链脱酰，例如，上述棘白菌素fr901379或其类似物，以及包括使用所述酰基转移酶生产环状肽化合物的方法。最后，已在wo2014/044803中报道了通过提供在工业上优选的生产宿主如假单胞菌中应用以有功能形式生产的酰基转移酶的方法在工业规模上对环状脂肽脱酰。后续的酰化导入替代侧链已经是几个报道的主题。在us5,965,525中，描述了使用4″-(戊氧基)-[1，1′：4′，1″-三联苯基]-4-羧酸的2，4，5-三氯苯酚酯对一种被称为棘白菌素b核的化合物(c34h51n7o15；式(c)；(2r，6s，9r，11r，12r，14as，15s，16s，20s，23s，25as)-9-氨基-23-((1s，2s)-1，2-二羟基-2-(4-羟基苯基)乙基)-2，11，12，15-四羟基-6，20-双((r)-1-羟基乙基)-16-甲基十六碳氢-1h-二吡咯并[2，1-c：2′，1′-1][1，4，7，10，13，16]六氮杂环汉尼可辛-5，8，14，19，22，25(9h，25ah)-己烷)的阿尼芬净前体的酰化以产生阿尼芬净。类似地，在us6,107,458和us6,265,536中，已经描述了使用4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯甲酸的苯并三唑活化对fr179642(cas168110-44-9；c35h52n8o20s；式(d)；硫酸氢5-((1s，2s)-2-((2r，6s，9r，11r，12r，14as，15s，16s，20s，23s，25as)-9-氨基-20-((r)-3-氨基-1-羟基-3-氧代丙基)-2，11，12，15-四羟基-6-((r)-1-羟基乙基)-16-甲基-5，8，14，19，22，25-六氧代二十四碳氢-1h-二吡咯并[2，1-c：2′，1′-1][1，4，7，10，13，16]-六氮杂环汉尼可辛-23-基)-1，2-二羟基乙基)-2-羟基苯基酯)的米卡芬净前体酰化以产生米卡芬净。在us7,199,248中描述了米卡芬净的改进生产。这种方法也包括向脱酰的米卡芬净肽核心添加分离的活化的米卡芬净侧链，即1-[4-[5-(4-戊氧基)苯基)异噁唑-3-基]苯甲酰基氧基]-1h-1，2，3-苯并三唑的步骤。ohigashi等(organicprocessresearch&development9，179(2005))公开了优化的工业米卡芬净生产过程，其也包括分离活化的米卡芬净侧链。在wo2012/136498中，显示了一种方法，包括在碳二亚胺偶联剂存在下活化米卡芬净侧链并随后在一锅法过程中偶联至米卡芬净肽核心。酰化上述具有氨基的环状肽的方法具有使用有害化学物的缺陷。虽然碳二亚胺是通常用于肽化学中的脱水剂，它们的缺陷在于许多(即，二环己基碳二亚胺)是强效变应原。已经公开了关于无法进入使用肽偶联剂的房间的个体的几份临床报告。因此，需要在米卡芬净生产中避免使用碳二亚胺基偶联剂。苯并三唑衍生的活化剂在另一方面一般具有爆炸性并且出于该原因不适用于工业或甚至是实验室使用，除非安装了繁琐并且昂贵的安全装置和工艺。因此，需要避免有害辅助化学物的缺陷的酰化含氨基的环状肽的改进的方法。发明详述在本发明的内容中，属于“含氨基的环状肽”是指具有至少一个基团-nh2(也称为游离胺基)的环状肽。在第一方面中，本发明提供了酰化含氨基的环状肽的方法，包括以下步骤：(a)使酸r1co2h与通式(1)的化合物反应以得到通式(2)的化合物(b)混合所述通式(2)的化合物和所述含氨基的环状肽以形成环状脂肽，其中基团r1是包含10-25个碳原子，优选14-23个碳原子的烷基，包含10-25个碳原子，优选14-23个碳原子的取代的烷基，包含10-25个碳原子，优选14-23个碳原子的芳基，或包含10-25个碳原子，优选14-23个碳原子的取代的芳基。优选地，r1是在按照本发明的方法获得的环状肽中存在的基团。因此，优选的化合物r1co2h是长链脂肪酸，如10，12-二甲基十四烷酸和取代的苯甲酸如4-(辛氧基)苯甲酸、4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯甲酸和4″-(戊氧基)-[1，1′：4′，1″-三联苯基]-4-羧酸。最优选地，r1co2h是4″-(戊氧基)-[1，1′：4′，1″-三联苯基]-4-羧酸或4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯甲酸，前者是阿尼芬净中存在的酰胺侧链，后者是米卡芬净中存在的酰胺侧链。基团r2是羧酸保护基团，如烷基或取代的烷基、芳基或取代的芳基。优选地，r2是短链烷基，如异丁基、正丁基、仲丁基、叔丁基、乙基、甲基、异丙基或正丙基，更优选地，r2是乙基。基团r3和r4可同时是氢，然而，优选地，r3或r4或者r3和r4或者选择使得它们影响通式(1)的化合物的反应性。本领域技术人员知晓如何实现这种目的以获得对特定底物的所需反应性。r3和r4可以是具有电子效应的基团，如吸电子基团或供电子基团或具有位阻效应的基团。优选的取代基r3和r4(也参见palakurthy等，eur.j.org.chem.2013，2627-2633)是烷基如乙基和甲基，取代的烷基像叔丁基和异丙基，卤素像溴、氯、氟和碘以及硝基(no2)。在本发明的内容中，优选地，r3是氢、甲基或no2并且r4是氢、甲基或no2。最优选地，r3是氢并且r4是no2或r3是no2并且r4是氢。在一些实施方式中，分离步骤(b)中获得的环状脂肽，例如，使用以下技术如沉淀、结晶、冻干等。因此，第一方面的方法还包括分离环状脂肽的步骤。优选的待酰化的环状肽是形成医学上可用的棘白菌素类阿尼芬净、卡泊芬净、西洛芬净和米卡芬净的核心结构的环状肽。因此，优选的环状肽是棘白菌素b核(脱酰化棘白菌素b；(c))、fr179642(d)、脱酰的纽莫康定a0和脱酰的纽莫康定b0。并且，根据底物和产物的溶解性，本发明的方法也可在不同溶剂中进行。一个优选的示例是n，n-二甲基甲酰胺。通常，产生通式(2)的化合物的反应第一步骤快速进行并且可在1-60分钟内，优选5-30分钟内完成。通常与环状肽的后续反应可在30分钟至6小时内完成。前述的时间范围是在环境温度，如20±5℃下。也可使用较低温度以防止出现底物和/或产物降解。优选地，本发明的方法在碱的存在下进行。优选的碱是二异丙胺。可按照已知过程如沉淀或结晶等来实现对最终产物环状脂肽的分离。在一些实施方式中，分离通式(2)的中间体活化的羧酸化合物。虽然在wo2012/136498中已经针对4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯甲酸提出了这些取代的苯甲酸的所谓oxyma-酯的化学结构，现有技术中还没有描述实际分离。优选地，通式(2)的化合物的中间体分离可用于按需引入其他纯化。另外，中间体分离对于解决某些后勤学问题而言有优势。从devd.等(j.org.chem.79，5420(2014))知晓通过用通式(1)的化合物活化羧酸的酰化的一般概念。该文献公开了2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧基亚氨基)乙酸乙酯(o-nosyloxy)用于从醇和酸形成多种酯和从胺和酸形成酰胺的用途。然而，该研究没有指出o-nosyloxy在其中一个底物上存在多个反应基团的更复杂情况中的合适性。因为o-nosyloxy-活化的酸显示出与所有测试的胺的反应性，重要的是也包括所有测试的醇，无法预期这种方法适于选择性地在像包含单个氨基和9个各种反应性的羟基的fr179642(或其他含氨基的环状肽)的分子中形成酰胺。此外，fr179642也包括磺酸基团，其对o-nosyloxy-活化的酸的反应性未知，使得该技术应用于含氨基的环状肽的酰化的合适性没有先例。首先，在与o-nosyloxy-活化的酸反应之前保护羟基和磺酸基将是显而易见的。令人惊讶的是，然而，根据本发明，含多个全部易于酰化的官能团的复杂底物可以高产率在单个氨基处被选择性酰化，而不需要对其他官能团进行保护。本发明的方法方便地避免了使用变应性的碳二亚胺或危险的苯并三唑衍生物。此外，本发明的方法是多能的，因为其可应用于还使用中间体纯化的活化侧链的一锅法工艺。在第二方面中，本发明提供了通式(2)的化合物，其中r1是9，11-二甲基十三烷基、4-(辛氧基)苯基或4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯基并且其中r2是乙基或甲基。在优选的实施方式中，本发明提供了通式(2)的化合物，其中r1是4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯基并且其中r2是乙基或甲基。在第三方面，本发明提供了通式(2)的化合物在制备阿尼芬净和米卡芬净中的用途。在一个实施方式中，本发明提供了通式(2)的化合物在制备阿尼芬净中的用途，其中r1是4-(戊氧基)-1，1′：4′，1″-三联苯-4″-基并且r2是乙基或甲基。由于4-(戊氧基)-1，1′：4′，1″-三联苯-4″-基一般用于阿尼芬净，在第一方面的方法的替代方法中可使用通式(2)的化合物，其中r1是4-(戊氧基)-1，1′：4′，1″-三联苯-4″-基。在另一个实施方式中，本发明提供了通式(2)的化合物在制备米卡芬净中的用途，其中r1是4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯基并且其中r2是乙基或甲基。由于4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯基一般用于米卡芬净，在第一方面的方法的替代方法中可使用通式(2)的化合物，其中r1是4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯基。例如，其中除胺基以外的官能团被保护的fr179642-样结构也可用通式(2)的化合物酰化，其中r1是4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯基。因此，在本发明的第一实施方式中，提供了制备阿尼芬净或其药学上可接受的盐的方法，包括以下步骤：(a)在碱存在下，使棘白菌素b核的化合物(c34h51n7o15；式(c)；(2r，6s，9r，11r，12r，14as，15s，16s，20s，23s，25as)-9-氨基-23-((1s，2s)-1，2-二羟基-2-(4-羟基苯基)乙基)-2，11，12，15-四羟基-6，20-双((r)-1-羟基乙基)-16-甲基十六碳氢-1h-二吡咯并[2，1-c：2′，1′-1][1，4，7，10，13，16]六氮杂环汉尼可辛-5，8，14，19，22，25(9h，25ah)-己烷)与通式(2)的化合物接触其中r1是并且r2是乙基或甲基；(b)分离步骤(a)中获得的阿尼芬净盐；(c)将步骤(b)中获得的阿尼芬净盐转化成阿尼芬净的药学上可接受的盐；(d)分离步骤(c)中获得的所述阿尼芬净的药学上可接受的盐。在本发明的第二实施方式中，提供了制备米卡芬净或其药学上可接受的盐的方法，包括以下步骤：(a)在碱存在下，使fr179642与通式(2)的化合物接触其中r1是并且r2是乙基或甲基；(b)分离步骤(a)中获得的米卡芬净盐；(c)将步骤(b)中获得的米卡芬净盐转化成米卡芬净的药学上可接受的盐；(d)分离步骤(c)中获得的所述米卡芬净的药学上可接受的盐。优选地，上述实施方式中的所述碱是胺，其优选示例是三烷基胺，如三乙胺和二异丙基乙胺。所述第三方面的方法产生阿尼芬净或米卡芬净或其药学上可接受的盐的组合物，其是高纯度的并且仅含非常低的痕量的本发明的烷化剂或其残余物。因此，本发明提供了药物组合物，包含：(a)阿尼芬净或米卡芬净；(b)通式(2)的化合物在上式中，在阿尼芬净的情况中，r1是并且在米卡芬净的情况中，r1是在两种情况中，r1也可以是oh。取代基r2可以是乙基或甲基并且所述通式(2)的化合物相对于所述组合物的总重量的量为0.01％w/w至0.3％w/w，优选0.015％w/w至0.2％w/w，最优选0.01％w/w至0.15％w/w，还最优选0.005％w/w至0.1％w/w。本发明由以下非限制性实施例说明。实施例通过使用fusionorbitrap的直接输注来进行对精确m/z值的测定。使用连续输注来分析1mg/ml溶液(使用的溶剂参见实施例)，其中不使用lc但是溶液被直接导入质谱仪中。为了更好地离子化，样品与含水/乙腈/甲酸50/50/0，1％v/v/v的溶液混合。混合比率是1∶9的样品：添加的溶液。使用的hrms(高分辨质谱)是装配以正离子模式运行的电喷雾电离源的fusionorbitrap(热电公司(thermoelectron))，使用15000的分辨率从m/z50-800扫描。使用以下方法进行hplc分析：柱：glscienceods-3150*4.6mm5μm柱温：30℃注射体积：5或10μl流速：10ml/分钟波长：210和275nm流动相a：0.5％nah2po4.h2o流动相b：100％乙腈梯度：时间(分钟)a％b％0973397310257520257521.010903010903297337973-4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯甲酸的oxyma酯：rt24.7分钟。-2-氰基-2-(4-硝基苯磺酰氧基亚氨基)乙酸乙酯：rt12.7分钟。-对硝基苯磺酰氯：rt12.4分钟。-2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧基亚氨基)乙酸乙酯：rt12.2分钟。-邻硝基苯磺酰氯：rt12.0分钟。-米卡芬净：rt10.9分钟。-(羟基亚氨基)氰乙酸酯：rt9.4分钟。-fr-179642：rt5.2分钟。2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧基亚氨基)乙酸乙酯(c11h9n3o7s，mw327.27)在氮气下，在0-10℃下，向5ml二氯甲烷中(羟基亚氨基)氰乙酸乙酯(oxyma；1775mg；12.5mmol)的搅拌溶液中添加二异丙胺(dipea；2.175ml，12.5mmol)。反应混合物冷却至0℃，之后添加2-硝基苯磺酰氯(2770mg；12.5mmol)并在约20℃下持续搅拌90分钟。用25ml二氯甲烷稀释反应混合物并且用5％盐酸(3x12.5ml)洗涤。有机相用无水cacl2干燥、过量并在30℃下真空浓缩至11g。在搅拌下，在25-30℃之间在90分钟内逐滴加入10ml正庚烷。混合物冷却至0-5℃并过滤。晶体用0-5℃的二氯甲烷/正庚烷＝1/1(v/v)的混合物洗涤，并在20℃下真空干燥。产生3.54g的灰白色晶体(86％)。使用1hnmr和13cnmr来进行结构确认。使用采用吡啶-d5中的二甲亚砜作为内标的定量1hnmr来确定样品纯度为98.8％，记录在bruker600mhzavance光谱仪上，其装备冷冻探针，具有标准定量参数，d1＝30s和300k样品温度。1hnmr(600mhz，吡啶-d5)δppm：8.4(d，j＝7.8hz，1h)，8.1(d，j＝7.8hz，1h)，7.9(t，j＝7.8hz，1h)，7.7(t，j＝7.8hz，1h)，4.3(q，j＝7.3hz，2h)，1.05(t，j＝7.1hz，3h).13cnmr(150mhz，dmso-d6)δppm：13.8，63.7，106.9，125.0，125.8，132.5，133.7，135.0，137.8，147.8，155.4.m/z(乙腈中)：328.02366(理论值＝328.02340).2-氰基-2-(4-硝基苯磺酰氧基亚氨基)乙酸乙酯(c11h9n3o7s，mw327.27)在氮气下，在0-10℃下，向5ml二氯甲烷中(羟基亚氨基)氰乙酸乙酯(oxyma；1775mg；12.5mmol)的搅拌溶液中添加二异丙胺(dipea；2.175ml，12.5mmol)。反应混合物冷却至0℃，之后添加4-硝基苯磺酰氯(2770mg；12.5mmol)并在约20℃下持续搅拌120分钟。用25ml二氯甲烷稀释反应混合物并且用5％盐酸(3x12.5ml)洗涤。有机相用无水cacl2干燥、过量并在30℃下真空浓缩至13g。在搅拌下，在25-30℃之间在90分钟内逐滴加入13ml正庚烷。混合物冷却至0-5℃并过滤。晶体用0-5℃的二氯甲烷/正庚烷＝1/1(v/v)的混合物洗涤，并在20℃下真空干燥。产生3.39g的灰白色晶体(83％)。hplc：标题化合物的93％面积％。实施例1fr179642使用2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧基亚氨基)乙酸乙酯一锅法转化成米卡芬净的二异丙胺盐在氮气下，向n，n-二甲基-甲酰胺(5ml)中的2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧基亚氨基)乙酸乙酯(328mg；1mmol)和4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯甲酸(352mg；1mmol)中加入二异丙胺(0.56ml；3.2mmol)。反应混合物搅拌5分钟。接着，添加fr179642((d)；cas168110-44-9；936mg；1mmol)并且混合物在约20℃下搅拌5.5小时。反应混合物用乙酸乙酯(30ml)稀释并在约20℃下搅拌1小时。沉淀物经连续过滤，用丙酮(25ml)洗涤，用乙酸乙酯(25ml)洗涤并在约20℃下真空干燥，产生1176mg的灰白色粉末的米卡芬净的二异丙胺盐(84％产率)。hplc(面积％)：88％米卡芬净的二异丙胺盐(rt10.9分钟)。1hnmr(600mhz，甲醇-d4)δppm：1.0(t，j＝7.3hz，3h)，1.1(d，j＝6.8hz，3h)，1.2(m，3h)，1.4(m，15h)，1.4(m，2h)，1.5(m，2h)，1.8(m，2h)，2.0(m，2h)，2.2(m，2h)，2.4(dd，j＝13.7&7.9hz，1h)，2.5-2.6(m，2h)，2.9(m，1h)，3.2(q，j＝7.4hz，2h)，3.4(t，j＝9.7hz，1h)，3.8(d，j＝11.1hz，1h)，3.9(dd，j＝11.3&2.8hz，1h)，4.1(t，j＝6.5hz，2h)，4.1(m，3h)，4.2(s，1h)，4.3(m，1h)，4.4-4.5(m，4h)，4.5-4.6(m，3h)，4.7(dd，j＝11.3&5.6hz，1h)，5.0(d，j＝2.8hz，1h)，5.1(m，1h)，5.3(d，j＝2.03hz，1h)，6.9(d，j＝8.3hz，1h)，7.05(m，3h)，7.1(s，1h)，7.3(d，j＝1.7hz，1h)，7.8(d，j＝8.5hz，2h)，8.0(s，4h).实施例2使用2-氰基-2-(4-硝基苯磺酰氧基亚氨基)乙酸乙酯将fr179642一锅法转化成米卡芬净的二异丙胺盐在氮气下，向n，n-二甲基-甲酰胺(5ml)中的2-氰基-2-(4-硝基苯磺酰氧基亚氨基)乙酸乙酯(328mg；1mmol)和4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯甲酸(352mg；1mmol)中加入二异丙胺(0.56ml；3.2mmol)。反应混合物搅拌5分钟。接着，添加fr179642((d)；cas168110-44-9；936mg；1mmol)并且混合物在约20℃下搅拌2小时。反应混合物用n，n-二甲基甲酰胺(1ml)稀释并且在搅拌下添加乙酸乙酯(30ml)。持续在约20℃下搅拌1小时。沉淀物经连续过滤，用丙酮(30ml)洗涤，用乙酸乙酯(25ml)洗涤并在约20℃下真空干燥，产生1146mg的灰白色粉末的米卡芬净的二异丙胺盐(82％产率)。hplc(面积％)：90％米卡芬净的二异丙胺盐(rt10.9分钟)。比较例使用edc的4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯甲酸的oxyma酯在氮气下，4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯甲酸(fr-195752；6.0g，17.1mmol)和(羟基亚氨基)氰乙酸乙酯(oxyma；97％；2.75g；18.8mmol)在约20℃下在dmf(150ml)中重悬。添加n-(3-二甲基氨基丙基)-n′-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl，3.60g，18.8mmol)并且混合物在约20℃下搅拌4.5小时。通过hplc测量得到超过97％的转化。混合物用水(750ml)和乙酸乙酯(900ml)稀释。分离相，并且水相用乙酸乙酯(450ml)反萃取一次。合并有机相并用水连续洗涤并在硫酸镁上干燥，过滤并在30℃下真空浓缩至浓缩物(200ml)。在重新开始真空浓缩至100ml体积之后允许形成晶体。浓缩物冷却至0-5℃，在滤去晶体后搅拌1小时，用冷乙酸乙酯洗涤并在20℃下真空干燥4小时，产生黄色晶体的7.35g的标题化合物。产率90.5％。hplc(面积％)：99％(rt24.7)和0.3％侧链作为游离酸。1hnmr(400mhz，丙酮-d6)δppm：8.3(d，j＝8.6hz，2h)，8.2(d，j＝8.6hz，2h)，7.9(d，j＝9hz，2h)，7.4(s，j＝hz，1h)，7.1(d，j＝9hz，2h)，4.5(q，j＝7.2hz，2h)，4.1(t，j＝6.5hz，2h)，1.8(m，2h)，1.5(m，2h)，1.4(m，2h)，1.4(t，j＝7hz，3h)，0.9(t，j＝7.3hz，3h).13cnmr(100mhz，丙酮-d6)δppm：14.3，14.4，23.2，28.7，29.4，64.7，68.8，97.6，108.1，108.5，116.0，120.5，128.3，128.3，131.8，133.9，136.4，158.0，161.1，162.0，162.6，172.0.m/z(丙酮中)：476.1813(理论值＝476.1816).实施例3使用2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧基亚氨基)乙酸乙酯的4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯甲酸的oxyma酯在氮气下，向n，n-二甲基-甲酰胺(3.5ml)中的2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧基亚氨基)乙酸乙酯(213mg；0.65mmol)和4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯甲酸(fr-195752；176mg；0.50mmol)的搅拌混合物中加入二异丙胺(0.19ml；1.1mmol)并且搅拌在20℃下持续10分钟。用乙酸乙酯(40ml)稀释反应混合物并且该溶液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，用1mnacl洗涤，并在30℃下真空蒸发至约5ml的体积。开始自发形成晶体。悬浮液冷却至0-5℃。晶体被滤去，用冷乙酸乙酯洗涤，并在20℃下真空干燥，产生黄色晶体的米卡芬净的二异丙胺盐。产率63％。hplc(面积％)：98％(rt24.7)。实施例4使用2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧基亚氨基)乙酸乙酯将fr179642转化成米卡芬净的二异丙胺盐(1g规模)fr179642((d)；cas168110-44-9；nmr试验75％；1.0g；0.80mmol)溶解于13mldmf中并冷却至-3℃。在-3℃下添加二异丙基乙基胺(0.22g，0.30ml，1.7mmol)，之后在-3至0℃下添加4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯甲酸的oxyma酯(545mg，1.15mmol)。在0-5℃下搅拌该反应混合物4.5小时。根据hplc转化完全。在搅拌下在约5分钟内向溶液中添加乙酸乙酯(65ml)并持续搅拌约1小时。沉淀物被连续滤去，用丙酮洗涤，用乙酸乙酯洗涤并在约20℃下真空干燥2小时，产生白色粉末的1.21g的标题化合物(nmr试验92％；99％产率)。实施例5使用2-氰基-2-(2-硝基苯磺酰氧基亚氨基)乙酸乙酯将fr179642转化成米卡芬净的二异丙胺盐(10g规模)fr-179642((d)；cas168110-44-9；nmr试验75％；10.0g；10.7mmol)溶解于130mldmf中并冷却至-5℃。在-5℃下添加二异丙基乙基胺(2.2g，3.0ml，17mmol)，之后在-3至-5℃下添加4-(5-(4-(戊氧基)苯基)异噁唑-3-基)苯甲酸的oxyma酯(5.45g，11.5mmol)。在-5至0℃下搅拌澄清反应混合物1小时。根据hplc转化完全。在搅拌下在约10分钟内向溶液中添加乙酸乙酯(650ml)并持续搅拌约1小时。沉淀物被连续滤去，用丙酮洗涤，用乙酸乙酯洗涤并在约20℃下真空干燥2小时，产生白色粉末的12.95g的米卡芬净的二异丙胺盐(nmr试验92.1％)。根据hplc0.1％fr-179642，0.1％fr-195752，3.3％dmf；没有活化的侧链并且没有oxyma。当前第1页12