技术领域本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及多囊卵巢综合征诊断用miRNA生物标志物及其应用。
背景技术：
世界范围内的不孕不育已经成为继癌症、心血管疾病之后严重影响人类健康的第三大疾病。其中女性不孕占40％。女性不孕中，排卵障碍率占25％-30％，常见为多囊卵巢综合征、卵巢早衰、黄素华卵泡不破裂综合征等，育龄妇女中大约有10％发生多囊卵巢综合征。多囊卵巢综合征(PCOS)是以稀发排卵或无排卵、高雄激素或胰岛素抵抗、多囊卵巢为特征的内分泌紊乱的症候群。雌\\雄激素比例失调引起的体内雄激素水平过高是导致PCOS的主要原因。miRNA是内源性长度约为21-25nt的非编码小RNA，对靶基因mRNA的降解和抑制起重要调控作用。miRNA作为潜在的组织特异性疾病的生物标志物，可为许多病理诊断提供有效措施。miRNA在PCOS中的研究目前主要集中在胰岛素抵抗，肥胖等方面，而关于激素比例失调这一关键因素的致病机制仍不清楚。
技术实现要素：
本发明的目的是提供多囊卵巢综合征诊断用miRNA生物标志物及其应用。为了实现本发明目的，本发明提供的多囊卵巢综合征诊断用miRNA生物标志物，所述miRNA生物标志物为miR27a。其成熟序列为：UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC。本发明还提供miR27a在制备或筛选人多囊卵巢综合征的诊断及治疗药物中的应用。本发明还提供miR27a在制备人多囊卵巢综合征检测试剂中的应用。所述检测试剂选自用于southern印迹法、northern印迹法、PCR法、逆转录酶PCR法、实时定量PCR法、纳米阵列法、宏阵列法、放射自显影法或原位杂交法等方法检测生物标志物miR27a的相关试剂。本发明进一步提供一种多囊卵巢综合征诊断用试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种特异性检测miR27a表达水平的引物和/或探针。所述引物是基于实时定量PCR法检测miR27a而设计的，所述引物序列如下：miR27a-3p-RT:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT-3′miR27a-3p-F:5′-CATCTGAGGATTCACAGTGGCTA-3′miR27a-3p-R:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′miRNA在女性生殖道卵巢、子宫、子宫内膜、输卵管以及胚胎发育过程中广泛表达，通过与其靶基因特异性结合，引起靶mRNA的降解或抑制其翻译。有关miRNA的研究完善和丰富了疾病发生、发展的分子生物学与遗传学机制。研究表明，miR27a促进颗粒细胞的凋亡，抑制芳香化酶的产生，使颗粒细胞内的雌性激素比例失调，导致排卵障碍引起多囊乱巢综合征。本发明采用DHT(双氢睾酮)诱导小鼠多囊卵巢综合征模型，发现miR27a在多囊卵巢综合征小鼠模型中高表达，并验证了miR27a及其靶基因在多囊卵巢综合征致病机理中的作用。可将miR27a作为多囊卵巢综合征的生物标志物，为临床制药提供理论基础。附图说明图1为本发明实施例1中miR27a超表达抑制雌激素的分泌。图2为本发明实施例1中miR27a超表达抑制颗粒细胞增殖，miR27a被抑制(通过添加miR27ainhibitor)促进颗粒细胞增殖。图3为本发明实施例1中miR27a超表达促进小鼠颗粒细胞的凋亡。图4为本发明实施例1中miR27a超表达抑制芳香化酶CYP19A1的产生。图5为本发明实施例1中PCOS模型小组，即DHT处理组后代成年雌鼠卵巢呈现多囊状。图6为本发明实施例1中多囊卵巢综合征小鼠模型中miR27a的表达量显著升高。图7为本发明实施例1中芳香化酶CYP19A1的表达量显著降低。图1-图4中，NC-mi为miR-NCmimic(模拟物)，miR-27a-mi为miR27a，NC-in为miR-NCinhibitor(抑制剂)，miR-27a-in为miR27ainhibitor。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1miR27a在促进颗粒细胞凋亡、抑制芳香化酶产生以及使颗粒细胞内雌性激素比例失调方面的研究(一)体外实验：体外培养KK-1细胞系，分为实验组和对照组，分别转染miR27a(即miR27amimic，UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC)和miR-NC(不相关的miR模拟物)，检测细胞增殖及凋亡变化，细胞中芳香化酶的变化及细胞上清中雌激素含量的变化。miR-NCmimic(模拟物):sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUTTantisense:ACGUGACACGUUCGGAGAATTmiR-NCinhibitor(抑制剂):CAGUACUUUUGUGUAGUACAA具体实验操作如下：1、miR27a对小鼠激素分泌的影响(1)细胞转染使用Invitrogen公司生产的lipofectamineTM2000，按说明书操作(以6孔板，共A、B、C、D四组，每组一个孔为例，实际转染时每个处理组设置3个复孔)：转染前24h接种细胞(4×105个/孔)，培养于含血清培养基，24h后细胞贴壁率约为70％-80％；转染前2h换无血清培养基；转染分以下A、B、C、D四组进行，E组为稀释的转染试剂。A：100pmolmiR-NCmimic(模拟物)+250μL无血清DMEM/F12培养基B：100pmolmiR27amimic(模拟物)+250μL无血清DMEM/F12培养基C：100pmolmiR-NCinhibitor(抑制剂)+250μL无血清DMEM/F12培养基D：100pmolmiR27ainhibitor(抑制剂)+250μL无血清DMEM/F12培养基E：5μLLipofectamineTM2000+250μL无血DMEM/F12清培养基上述miR27ainhibitor即miR27a的反义序列。以上五组预混液配好后吹打混匀，室温静置5min。分别将A、B、C、D四组预混液与E组预混液等体积混合，得到约500μl转染试剂(小RNA混合液)，吹打混匀，室温孵育20min，每孔加入500μL上述配制的转染试剂，37℃培养箱中孵育6h后，换成正常10％FBSDMEM/F12培养基继续培养18-48h，然后观察结果。(2)细胞激素测定转染细胞培养48h，收集培养液，送至北京北方生物技术研究所，以测定E2和孕激素(孕酮，P4)含量。通过测定发现，miR27a超表达抑制雌激素的分泌(图1)。2、miR27a对小鼠颗粒细胞增殖的影响细胞转染步骤同上，用CCK-8试剂盒检测miR27a对颗粒细胞数目的影响，具体操作步骤为：使用中国碧云天生物公司生产的CCK-8试剂盒，按说明书操作：待处理细胞接种于96孔板(100μL/孔)，经过处理后，加入10μLCCK-8液；37℃培养箱中孵育2h；酶标仪测定450nm吸光度值。通过测定发现，miR27a超表达抑制颗粒细胞增殖，miR27a抑制剂促进颗粒细胞增殖(图2)。3、miR27a对小鼠颗粒细胞凋亡的影响细胞转染步骤同上，用流式细胞技术(AnnexinV-FITC染色)检测miR27a对小鼠颗粒细胞凋亡的影响，具体方法如下：使用Sigma公司生产的AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒，按说明书操作。通过分析显示，miR27a超表达促进小鼠颗粒细胞的凋亡(图3)。4、小鼠颗粒细胞中芳香化酶的变化细胞转染步骤同上，48小时后，收集细胞沉淀，用RIPA蛋白裂解液裂解细胞，WesternBlot检测芳香化酶的变化，具体方法如下：(1)100uLRIPA蛋白裂解液，反复震荡，抽打均匀；13000rpm离心30min，吸取上清；(2)利用Bio-Rad蛋白定量试剂盒(Catalog#500-0002)进行定量；(3)加入等体积的2×Loadingbuffer，沸水浴变性5min，冰浴5min；(4)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；(5)蛋白转移处理PVDF膜，甲醇活化10s，浸泡在电转缓冲液超过5min；(6)PVDF膜使用无水甲醇活化1min，自然晾干10min，再次活化30s；(7)TBS-T(pH7.6，含0.1％Tween-20)漂洗10min；(8)特异抗体进行杂交，杂交溶液中加入2％脱脂奶粉以封闭非特异性杂交信号；(9)TBS-T漂洗1次15min，然后3次，每次5min；(10)二抗杂交20-45min，杂交液中含2％脱脂奶粉；(11)TBS-T漂洗15min，5×5min；(12)利用ECLTMWesternblotAnalysis试剂盒(GEhealthCare)进行显色；(13)X-ray胶片(Kodak)记录显影结果。通过分析显示，miR27a超表达抑制芳香化酶的的产生(图4)。(二)体内实验：将10只孕期为16天的雌鼠随机分成两组。对照组每天皮下注射200ul芝麻油，实验组每天皮下注射200ul含DHT(双氢睾酮)的芝麻油(其中DHT用量为250ug)，连续注射3天。收集后代成年雌鼠的卵巢，做石蜡切片，HE染色，观察卵巢结构。同时提取卵巢的RNA和蛋白，检测miR27a及芳香化酶的表达情况。成年C57雌鼠与雄鼠在前1天下午4点合笼，合笼比例为2:1，次日早上捡栓，有栓雌鼠为做好标记并分为两组，此时记为第1天。在见栓后16、17、18天对照组小鼠每天背部皮下注射200ul芝麻油，实验组小鼠每天背部皮下注射200ul含DHT(双氢睾酮)的芝麻油(其中DHT用量为250ug)，连续注射3天。2个月后，收集后代的雌鼠的卵巢，4％多聚甲醛固定48小时，流水冲洗6小时，包埋，做HE染色，显微镜下观察卵巢结构。结果显示，与对照组相比，DHT处理组后代成年雌鼠卵巢呈现多囊状(图5)。包埋步骤如下：70％乙醇15min---80％乙醇15min---90％乙醇15min---95％乙醇15min---无水乙醇115min---无水乙醇215min---酒精/二甲苯(1:1)7min---二甲苯16min---二甲苯26min---石蜡118min---石蜡218min---石蜡318min。上述无水乙醇1是指在第一个无水乙醇平皿中浸泡15分钟，然后取出放在第二个无水乙醇平皿中再浸泡15分钟。二甲苯、石蜡同理。HE染色步骤如下：二甲苯115min---二甲苯215min---酒精/二甲苯(1:1)5min---无水乙醇15min---无水乙醇25min---95％乙醇5min---80％乙醇5min---70％乙醇5min—苏木精12min---蒸馏水洗2min---盐酸酒精10s---蒸馏水洗2min---70％乙醇3min---80％乙醇3min---伊红60s---90％乙醇3min---95％乙醇3min---无水乙醇13min---无水乙醇23min---酒精/二甲苯(1:1)3min---二甲苯13min---二甲苯23min---封片。提取卵巢总RNA和蛋白，检测miR27a及芳香化酶的表达情况。结果显示，在多囊卵巢综合征小鼠模型中miR27a的表达量显著升高(图6)。芳香化酶的表达量显著降低(图7)。实施例2miR27a作为多囊卵巢综合征诊断用miRNA生物标志物中的应用基于实时定量PCR法检测多囊卵巢综合征患者卵巢中的miR27a含量，设计的引物序列如下：miR27a-3p-RT:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT-3′miR27a-3p-F:5′-CATCTGAGGATTCACAGTGGCTA-3′miR27a-3p-R:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′检测方法如下：1、miRNA反转录miRNA的反转录是利用miRNA特异性的茎环结构(Stem-loopRT-Primer)作为引物来进行反转录。其内参为核内小RNAU6。U6的反转录引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反转录体系如下：加入以上试剂，总体系15μL，震荡混匀后按下表反应条件进行反转录步骤：反转录完成后，可将产物短时间保存在-20℃冰箱中或直接进行Real-TimePCR反应。2、Real-TimePCR将反转录产物按照480SYBRGreenIMaster试剂说明，用RochelightCycler480仪进行Real-TimePCR反应。每个样品设3个重复，每个实验重复3次。首先配制如下PCR反应液：Real-Time扩增程序如下：Real-TimePCR引物序列见表1。表1Real-TimePCR引物所得数据用480software,Version1.5进行分析。分析结果显示，miR27a超表达促进小鼠颗粒细胞的凋亡(图5和图6)。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。