技术领域本发明属于生物医药领域，涉及慢性粒细胞白血病的治疗，具体涉及一种硫酸阿米卡星的药物组合物及其对慢性粒细胞白血病的治疗作用。
背景技术：
硫酸阿米卡星为半合成氨基糖甙类抗生素，抗菌谱与庆大霉素相似，对金葡菌、绿脓杆菌、大肠杆菌及变形杆菌等均有效。对其它氨基糖甙类抗生素耐药菌株，本品亦有显效，临床上主要用于敏感菌引起的肾盂肾炎、尿路感染、呼吸道及肺部感染、败血症等。慢性粒细胞白血病是一种影响血液及骨髓的恶性肿瘤，它的特点是产生大量不成熟的白细胞，这些白细胞在骨髓内聚集，抑制骨髓的正常造血；并且能够通过血液在全身扩散，导致病人出现贫血、容易出血、感染及器官浸润等。慢性粒细胞白血病进展缓慢，根据骨髓中白血病细胞的数量和症状的严重程度，分为三个期：慢性期、加速期和急变期。其中，大约有90％病人诊断时为慢性期，每年约3％至4％慢性期进展为急变期。迄今为止，尚未见硫酸阿米卡星的药物组合物与慢性粒细胞白血病的相关性报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种硫酸阿米卡星的药物组合物，该药物组合物中含有硫酸阿米卡星和一种从板蓝根的干燥根及根茎中分离得到的结构新颖的天然产物，硫酸阿米卡星和该天然产物可以协同治疗慢性粒细胞白血病。本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：一种具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，一种硫酸阿米卡星的药物组合物，包括硫酸阿米卡星、如上所述的化合物(Ⅰ)和药学上可以接受的载体。如上所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将板蓝根的干燥根及根茎粉碎，用70～80％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用6％乙醇洗脱8个柱体积，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～14个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)。进一步地，步骤(a)中，用75％乙醇热回流提取，合并提取液。进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。如上所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。如上所述的硫酸阿米卡星的药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。本发明的优点：本发明提供的硫酸阿米卡星的药物组合物中含有硫酸阿米卡星和一种从板蓝根的干燥根及根茎中分离得到的结构新颖的天然产物，硫酸阿米卡星和该天然产物单独作用时，对慢性粒细胞白血病的治疗效果较弱；二者联合作用时，对慢性粒细胞白血病的治疗效果显著提高，可以开发成治疗慢性粒细胞白血病的药物。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。分离方法：(a)将板蓝根的干燥根及根茎(5kg)粉碎，用75％乙醇热回流提取(20L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(4L)，依次用石油醚(4L×3次)、乙酸乙酯(4L×3次)和水饱和的正丁醇(4L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用6％乙醇洗脱8个柱体积，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为50:1(8个柱体积)、25:1(8个柱体积)、15:1(8个柱体积)和5:1(10个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1(8个柱体积)、5:1(10个柱体积)和2:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～14个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)(308mg，HPLC归一化纯度大于98％)。结构确证：黄色无定形固体；HRESIMS给出的准分子离子峰m/z397.1781[M+H]+，表明化合物分子式为C22H24N2O5，不饱和度为12。1H-NMR谱(pyridine-d5，500MHz)中，H-1(11.82，s)，H-3(3.64，d，J＝10.3Hz)，H-6(6.33，s)，H-9(7.51，d，J＝2.6Hz)，H-11(7.20，dd，J＝8.6，2.6Hz)，H-12(7.42，d，J＝8.6Hz)，H-14(2.05，ddd，J＝12.6，12.5，10.3Hz)，H-14(2.75，d，J＝12.6Hz)，H-15(2.13，m)，H-17(5.99，d，J＝12.3Hz)，H-17(6.50，d，J＝12.3Hz)，H-18(0.91，t，J＝7.6Hz)，H-19(1.23，m)，H-19(1.58，m)，H-20(2.09，m)，H-21(2.25，d，J＝10.9Hz)，H-21(3.85，dd，J＝10.9，2.6Hz)，22-OMe(3.63，s)；13C-NMR谱(pyridine-d5，125MHz)中，C-2(136.3，C)，C-3(57.8，CH)，C-5(148.3，C)，C-6(110.8，CH)，C-7(105.7，C)，C-8(129.1，C)，C-9(104.2，CH)，C-10(152.8，C)，C-11(112.8，CH)，C-12(112.4，CH)，C-13(128.4，C)，C-14(34.4，CH2)，C-15(41.8，CH)，C-16(143.2，C)，C-17(127.9，CH2)，C-18(10.8，CH3)，C-19(20.7，CH2)，C-20(39.3，CH)，C-21(51.3，CH2)，C-22(172.6，C)，C-23(164.7，C)，22-OMe(52.4，CH3)。红外波谱表明该化合物含有羰基(1735cm-1与1614cm-1)基团；紫外波谱表明该化合物含有吲哚(最大吸收204nm，277nm与312nm)基团。1H-NMR谱显示存在1,2,4-三取代苯基质子信号δH7.51(1H，d，J＝2.6Hz，H-9)，7.20(1H，dd，J＝8.6，2.6Hz，H-11)与7.42(1H，d，J＝8.6Hz，H-12)；三个烯烃质子信号δH6.33(1H，s，H-6)，5.99(1H，d，J＝12.3Hz，H-17)与6.50(1H，d，J＝12.3Hz，H-17)；三组亚甲基质子信号δH2.05(1H，ddd，J＝12.6，12.5，10.3Hz，H-14)与2.75(1H，d，J＝12.6Hz，H-14)、1.23(1H，m，H-19)与1.58(1H，m，H-19)、2.25(1H，d，J＝10.9Hz，H-21)与3.85(1H，dd，J＝10.9，2.6Hz，H-21)；三组次甲基质子信号δH3.64(1H，d，J＝10.3Hz，H-3)、2.13(1H，m，H-15)与2.09(1H，m，H-20)；一个连氧甲基质子信号δH3.63(3H，s，22-OMe)；一个甲基质子信号δH0.91(3H，t，J＝7.6Hz，H-18)；一个连氮质子信号δH11.82(1H，s，H-1)。13C-NMR谱与DEPT谱显示有三组双键，两个羰基，两个甲基，三个亚甲基，三个次甲基。此外，在1H-1HCOSY谱中，证明存在明显的H-3/H2-14/H-15，H3-18/H2-19/H-20/H2-21，H-15/H-20与H-11/H-12信号相关。据HMBC谱分析可知，甲氧基H与C-22存在信号相关说明OMe与C-22位相连；进一步通过2D-INADEQUAR分析δC120-180范围内的碳碳直接相关信号可知，C-5与C-23存在相关信号，证明羧基与C-5位相连。在这类生物碱骨架中，H-15总是处在构型的α位；另外，H-3、H-14(δH2.05)与H-15三者之间的偶合常数J3，14与J14，15为10.3与12.5，表明H-3、H-14(δH2.05)与H-15为同轴顺式构型。在ROESY谱中，H-3与H-15，H-3与H-20以及H-15与H-20的相关性表明H-3与H-20为α构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和ROESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。实施例2：对慢性粒细胞白血病的治疗作用一、材料和仪器K562细胞由中科院上海生物细胞所提供。化合物(Ⅰ)为自制，HPLC归一化纯度大于98％。RPMI-1640干粉培养基购于Gibco公司。小牛血清购于杭州四季青生物工程材料研究所。青霉素、链霉素购于华北制药厂。Glutamine、MTT、DMSO购于AMRESCO。Annexinv-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。MOPS，Rnasin、琼脂糖、嗅乙锭、溴酚兰华美生物工程公司华美生物工程公司。CO2孵箱(美国Thermo公司)，超净工作台(苏州净化设备厂)，磁力搅拌器(上海南汇电讯器材厂)，倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)，水平式离心机(上海安亭科学仪器厂)，电子分析天平(德国Sartorius公司)，自动酶标仪(德国Humareader公司)，U-3010型紫外分光光度计(日本HITACHI公司)，流式细胞仪(美国BECKMAN公司)，EppendorfCentrifuge5417R离心机(德国Eppendorf公司)。二、试验方法1、K562细胞的培养将新购买的细胞株的培养瓶表面用75％酒精擦拭3遍。将细胞悬液吸入离心管，1000rpm离心10min。弃去上清，滴加含10％NBS的RPMI-1640完全培养基，轻轻吹打制备成细胞悬液。接种于培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天换液传代。2、实验分组正常对照组：10％NBS的RPMI-1640；硫酸阿米卡星组：10％NBS的RPMI-1640+终浓度200mg/L的硫酸阿米卡星；化合物(Ⅰ)组：10％NBS的即RPMI-1640+终浓度200mg/L化合物(Ⅰ)；硫酸阿米卡星与化合物(Ⅰ)组合物组：10％NBS的RPMI-1640+终浓度100mg/L的硫酸阿米卡星+终浓度100mg/L化合物(Ⅰ)。硫酸阿米卡星和化合物(Ⅰ)可以先用少量DMSO超声溶解。3、MTT法检测对K562细胞增殖的影响取生长状态良好的细胞，用含10％NBS的RPMI-1640培养液将细胞配制成细胞悬液，以5×103细胞/孔接种于无菌96孔培养板中。(2)依实验分组，每组加入不同浓度的药物50μL，设无细胞孔为空白对照组，每组设8个复孔，将96孔培养板放入CO2培养箱中培养；(3)24、48和72h后取出96孔培养板，每孔加入20μLMTT(5mg/mL)，放入CO2培养箱中孵育4h，即有紫蓝色结晶物生成，在一定细胞数范围内，结晶物的生成量与细胞数成正比。(4)每孔加入酸化的SDS100μL放入CO2培养箱中过夜。(5)用酶标仪测定OD，比色时以空白孔调零。4、统计学处理实验组和对照组均重复三次操作，结果用(x±s表示，P<0.05示有显著性差异。组间比较采用单因素方差分析。所有数据用SPSS18.0统计软件进行统计学分析。三、结果及结论MTT法检测对K562细胞的增殖抑制作用化合物(Ⅰ)作用K562细胞24h、48h、72h后，用酶标仪检测OD490显示：与正常对照组比，作用24h后硫酸阿米卡星组和化合物(Ⅰ)组对细胞K562细胞抑制作用不明显(P>0.05，P>0.05)，硫酸阿米卡星与化合物(Ⅰ)组合物组对K562细胞有抑制作用(P<0.05)；与正常对照组比，作用48h和72h后，硫酸阿米卡星组和化合物(Ⅰ)组对细胞K562细胞有抑制作用(P<0.05，P<0.05)，硫酸阿米卡星与化合物(Ⅰ)组合物组可显著抑制K562细胞(P<0.01)。表1各组作用K562细胞后的MTT值(x±s，n＝8)结论：硫酸阿米卡星与化合物(Ⅰ)组合物可显著抑制K562细胞的增殖，抑制作用强于硫酸阿米卡星或化合物(Ⅰ)单独作用于K562细胞。硫酸阿米卡星与化合物(Ⅰ)之间存在协同作用。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。