本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于反应吸附法制备固定化酶的方法.
背景技术：
酶是生物体内存在的一类重要的有机大分子，作为生物催化剂参与了体内众多的生化代谢活动，与无机催化剂相比，酶具有专一性强、催化效率高和反应条件温和的特点。人们从植物、动物或微生物中分离获得的催化特定反应的酶分子，同样可以用于体外的特定反应催化，酶的这些明显优势大大促进了人们对酶的生产和应用研究，
但酶的来源决定了酶的价格相对昂贵，反应结束后，很难方便地从水溶性体系中分离回收和重复利用，导致生产成本提高,同时又增加了产品提纯的难度。因此，这些问题成为了酶产业化的技术瓶颈。1953年德国的GRUBHOFERN等首次提出了固定化酶的概念。
固定化酶指用化学或物理手段将游离酶定位于限定的空间区域，但仍保留其催化特性，并可在反应后回收和重复使用的一类酶制品。与游离酶相比,固定化酶可以在较长时间内反复利用,反应过程可以严格控制,有助于提高酶的稳定性,酶易于与底物和产物分开,增加产物的收率,提高产物的质量,使酶的使用效率提高,成本降低。这个理念更能适用于现代工业应用方向，1969年，日本的TOSAT等首次报道了在工业生产上应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L- 氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
但酶固定化技术的并不是一件很通用的技术，受到很多条件的限制，因为，绝大多数的酶分子都是蛋白质成分，酶的催化活性主要由蛋白质分子空间立体结构维持，其催化稳定性不仅与酶分子本身的结构有直接关系，同时还与环境条件有密切关系，任何影响蛋白质分子的空间立体结构的理化因素，例如温度、溶剂、pH、离子强度、时间、空间位阻等，都会影响到酶的催化活性和催化效率。因此，为了保证酶的空间构象的稳定性，酶的固定化方法和固定化载体尤为关键。目前传统的酶固定化的方法主要有吸附法、共价结合法、包埋法及交联法四大类。固定化载体应具备良好的机械强度、化学稳定性及对酶的高度亲和性，并能保持较高的酶活性等。因此，良好的固定化酶技术是在维持酶催化效率基本不变的前提下，兼顾考虑固定化载体、固定化方法以及固定化成本，目前这些固定化方法都各有利有弊，例如：共价结合法和交联法，虽然可以通过交联剂将酶共价结合或交联到优良载体上，但固定化过程对酶活损失较大，造成固定化酶的制备过程成本较高；包埋法虽然固定化条件温和，但包埋剂强度低，载体容易破裂，造成固定化酶重复使用次数低；吸附法制备固定化酶时对酶活性损失最小，但由于载体与酶分子之间主要依赖于非共价结合力，例如范德华力、氢键、疏水力，离子键等，相互作用力弱，固定化酶在使用过程中容易脱离载体，造成酶的再次游离。当然，酶的固定化技术的研究探索一直没有停止，一些新的载体被不断报道，例如，利用金属螯合配体(IDA-Cu2+)与蛋白质表面带电荷氨基酸相互作用的原 理,定向固定木瓜蛋白酶；以邻苯二甲酸二丁酯为致孔剂,制备多孔壳聚糖膜,用作固定化脲酶的载体；生物素识别亲和素实现β-半乳糖酶的定点固定化。此外，还有酶与抗体连接的定向固定技术，交联酶聚集体(CLEAs)技术等。
这些固定化技术中，吸附技术最为常用，因为该技术对酶的适应性最宽，固定化过程中酶活损失最小，载体选择范围较广，价格低廉，固定化操作过程简单、操作条件温和。目前，吸附法主要可细分为物理吸附法和离子吸附法2种。物理吸附法的载体主要是利用高吸附能力的非水溶性材料，如硅藻土、高岭土、蒙脱石、分子筛、硅胶、多孔玻璃、氧化铝、大孔吸附树脂，改性二氧化硅、复合陶瓷等，这些材料与酶溶液混合，实现表面吸附固定化；离子吸附法的载体主要是含有离子交换基团的水不溶性材料，利用酶与载体之间形成静电作用力来实现固定化。但这些吸附方法的主要缺点就是吸附作用力较弱，造成酶容易游离脱落，如果能够很好地克服吸附法的缺点，综合成本考虑，还是一个很实用的固定化技术。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于改进反应吸附法制备固定化酶的方法的吸附法，其目的就是加强载体与酶的结合力，克服固定化酶容易脱落的缺点。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：基于反应吸附法制备固定化酶的方法，其特征在于：其通过在含有酶的水溶液中经过两种或两种以上的化合物反应，在形成磷酸钙、磷酸氢钙、碳酸 钙、碳酸氢钙、氢氧化铝、植酸钙、亚铁氰化锌、甲壳素有机物中的一种或多种沉淀物的过程中，完成沉淀物吸附包裹酶分子制得固定化酶。
进一步的技术方案在于，分别将磷酸氢二钾或磷酸氢二钠与氯化钙两种化学试剂配成水溶液，将固体酶或液体酶加入氯化钙水溶液中，在0-50℃之间，pH5-9之间，搅拌均匀后，快速加入磷酸氢二钾或磷酸氢二钠水溶液，搅拌均匀，在形成磷酸氢钙或磷酸钙沉淀过程中包裹吸附酶制得固定化酶。
进一步的技术方案在于，分别将碳酸氢钠或碳酸氢铵与氯化钙两种化学试剂配成水溶液，将固体酶或液体酶加入氯化钙水溶液中，在0-50℃之间，pH5-9之间，搅拌均匀后，快速加入碳酸氢钠或碳酸氢铵水溶液，搅拌均匀，在形成碳酸氢钙或碳酸钙沉淀过程中包裹吸附酶制得固定化酶。
进一步的技术方案在于，将KAl(SO4)2·12H2O溶于水后待全部电离出离子后，将固体酶或液体酶加入，搅拌均匀，在形成氢氧化铝沉淀过程中包裹吸附酶制得固定化酶。
进一步的技术方案在于，分别将硫酸锌和亚铁氰化钾两种化学试剂配成水溶液，将固体酶或液体酶加入硫酸锌水溶液中，在0-50℃之间，pH5-9之间，搅拌均匀后，快速加入亚铁氰化钾水溶液，搅拌均匀，在形成亚铁氰化锌沉淀过程中包裹吸附酶制得固定化酶。
进一步的技术方案在于，分别将植酸和氯化钙两种化学试剂配成水溶液，将固体酶或液体酶加入氯化钙溶液中，在0-50℃之间，pH4-8 之间，搅拌均匀后，快速加入植酸溶液，搅拌均匀，在形成植酸钙沉淀过程中包裹吸附酶制得固定化酶。
进一步的技术方案在于，将甲壳素溶解在1％醋酸中配成水溶液，阴离子型聚丙烯酰胺或阴离子型多糖配成水溶液，将固体酶或液体酶加入阴离子型聚丙烯酰胺或阴离子型多糖水溶液中，灾0-50℃之间，pH4-8之间，搅拌均匀后，快速加入甲壳素溶液，搅拌均匀，在形成甲壳素有机物沉淀过程中包裹吸附酶制得固定化酶。
进一步的技术方案还在于，所述酶为酯酶或蛋白酶。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明就是一种改进的吸附法，其目的就是加强载体与酶的结合力，克服固定化酶容易脱落的缺点，核心技术是利用两种或两种以上对酶分子活性没有影响，无毒无害的化学物质，在低温或室温条件下发生化学沉淀反应，利用反应过程中形成沉淀的同时，产生的大量瞬间吸附表面，将游离酶包裹吸附固定化。这种吸附不仅有表面静态吸附作用，还有内部动态的静电集聚交联，酶分子上的一些电荷既是被吸附的对象，又是吸附沉淀的主体骨架，是大分子与小分子之间的瞬间絮凝，而不仅仅是表面吸附，具有了物理吸附和离子吸附的双重复杂作用，由于沉淀和酶分子牢固扭结在一起，使得被固定结合的酶不容易与沉淀载体脱离，增加固定化酶重复使用次数。该技术由于条件温和，固定化操作过程简单、完成迅速，不破坏酶分子的高级结构以及活性中心构象。因此，反应吸附法用于固定化酶的制备技术，具备了操作简单、价格低廉、酶活稳定的特点，值得推广应用。
具体实施方式
对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
本发明阐述了一种基于反应吸附法制备固定化酶的方法，其特征在于：其通过在含有酶的水溶液中经过两种或两种以上的化合物反应，在形成磷酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙、碳酸氢钙、氢氧化铝、植酸钙、亚铁氰化锌、甲壳素有机物中的一种或多种沉淀物的过程中，完成沉淀物吸附包裹酶分子制得固定化酶。
优选地，分别将磷酸氢二钾或磷酸氢二钠与氯化钙两种化学试剂配成水溶液，将固体酶或液体酶加入氯化钙水溶液中，在0-50℃之间，pH5-9之间，搅拌均匀后，快速加入磷酸氢二钾或磷酸氢二钠水溶液，搅拌均匀，在形成磷酸氢钙或磷酸钙沉淀过程中包裹吸附酶制得固定化酶。
优选地，分别将碳酸氢钠或碳酸氢铵与氯化钙两种化学试剂配成水溶液，将固体酶或液体酶加入氯化钙水溶液中，在0-50℃之间， pH5-9之间，搅拌均匀后，快速加入碳酸氢钠或碳酸氢铵水溶液，搅拌均匀，在形成碳酸氢钙或碳酸钙沉淀过程中包裹吸附酶制得固定化酶。
优选地，将KAl(SO4)2·12H2O溶于水后待全部电离出离子后，将固体酶或液体酶加入，搅拌均匀，在形成氢氧化铝沉淀过程中包裹吸附酶制得固定化酶。
优选地，分别将硫酸锌和亚铁氰化钾两种化学试剂配成水溶液，将固体酶或液体酶加入硫酸锌水溶液中，在0-50℃之间，pH5-9之间，搅拌均匀后，快速加入亚铁氰化钾水溶液，搅拌均匀，在形成亚铁氰化锌沉淀过程中包裹吸附酶制得固定化酶。
Al3+水解生成氢氧化铝胶体，胶体有吸附性，Al3++3H2O＝Al(OH)3(胶体)+3H+，吸附包裹酶分子。
优选地，分别将植酸和氯化钙两种化学试剂配成水溶液，将固体酶或液体酶加入氯化钙溶液中，在0-50℃之间，pH4-8之间，搅拌均匀后，快速加入植酸溶液，搅拌均匀，在形成植酸钙沉淀过程中包裹吸附酶制得固定化酶。
优选地，将甲壳素溶解在1％醋酸中配成水溶液，阴离子型聚丙烯酰胺或阴离子型多糖配成水溶液，将固体酶或液体酶加入阴离子型聚丙烯酰胺或阴离子型多糖水溶液中，灾0-50℃之间，pH4-8之间，搅拌均匀后，快速加入甲壳素溶液，搅拌均匀，在形成甲壳素有机物沉淀过程中包裹吸附酶制得固定化酶。
优选地，所述酶为酯酶或蛋白酶。
实施例1：
固定化酯酶：
培养产生酯酶的细菌菌株S.mal SF-H1，发酵72h，发酵液酯酶活性为21u/ml，过滤除菌得到发酵酯酶粗酶液，取200ml发酵酯酶粗酶液加入10ml1M氯化钙，室温下，pH6.0，搅拌均匀后，加入10ml1M磷酸氢二钾(钠)溶液,快速搅拌，形成含有固定化酯酶的白色沉淀，离心，沉淀物水洗三遍，取样测定固定化酶活性，一次性固定化总酶活的61％，该固定化酶连续使用，每次催化底物水解完成后，离心沉淀出固定化酶，水洗三次，进行下一次使用，20次后，酶活依然残存85％，说明酶的固定化牢固，不易脱落。
实施例2：
固定化蛋白酶：
取固体粉末蛋白酶，配制为200mg/200ml酶液，过滤除杂质后，加入10ml1M氯化钙，室温下，pH6.0，搅拌均匀后，加入10ml1M磷酸氢二钾(钠)溶液,快速搅拌，形成含有固定化酶的沉淀，离心，沉淀物水洗三遍，取样测定固定化蛋白酶，一次性固定化总酶活的67％，该固定化酶连续使用10次，酶活残存82％，说明酶的固定化牢固，不易脱落。