非酒精性脂肪性肝炎的多基因组合检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种非酒精性脂肪性肝炎的多基因组合检测试剂盒，属于生物检测领域。
背景技术：
：非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease，nafld)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。近年来，由于生活方式和饮食结构的改变，非酒精性脂肪肝病的发病率逐年增加，已成为危害人类健康的三大肝病之一。非酒精性脂肪性肝病包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、脂肪性肝纤维化这一系列肝脏病变。疾病的进展过程中，10％-30％的非酒精性脂肪性肝炎患者在10年内可发展为肝硬化，并进一步发展为肝细胞癌。部分非酒精性脂肪性肝炎患者甚至可以不经肝硬化，直接进展为肝细胞癌。因此尽早发现非酒精性脂肪性肝炎是避免病情恶化的关键。而目前临床上发现非酒精性脂肪性肝炎十分困难。一方面，绝大多数患者无症状或仅有非特异性症状如乏力等。另一方面，传统的血清学、影像学检查的敏感性和特异性让人难以满意；而肝脏活检作为诊断非酒精性脂肪性肝炎的金标准，因有创、费用高及耐受差等原因，不被大多数患者接受。因此建立代替肝活检诊断非酒精性脂肪性肝炎的简便、准确的诊断方法在临床诊断上是一个亟待解决的问题。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种多基因组合检测试剂盒及其应用，以实现对非酒精性脂肪性肝炎的辅助诊断。本发明采用了如下技术方案：本发明提供一种非酒精性脂肪性肝炎的多基因组合检测试剂盒，其特征在于，包括：基因pramef10信使rna的扩增引物，基因rps6ka1信使rna的扩增引物，基因ube2t信使rna的扩增引物，基因mcm10信使rna的扩增引物，基因slc12a4信使rna的扩增引物，基因wipi1信使rna的扩增引物，以及基因rhbdf2信使rna的扩增引物。进一步，本发明的非酒精性脂肪性肝炎的多基因组合检测试剂盒，还包括：trizol试剂，氯仿，异丙醇，75％乙醇，depc水，oligo(dt)18引物，逆转录酶，sybrgreen聚合酶链式反应体系。进一步，本发明的非酒精性脂肪性肝炎的多基因组合检测试剂盒，其特征在于：优选的，基因pramef10信使rna的扩增引物是：正向引物：5’-tgcctgagctacctttttggg-3’；反向引物：5’-tcccgttttattgagagagcac-3’；优选的，基因rps6ka1信使rna的扩增引物是：正向引物：5’-cagtgggcacctgtatgctat-3’；反向引物：5’-acgaatgggtgatttacatcagc-3’；优选的，基因ube2t信使rna的扩增引物是：正向引物：5’-atccctcaacatcgcaactgt-3’；反向引物：5’-cagcctctggtagattatcaagc-3’；优选的，基因mcm10信使rna的扩增引物是：正向引物：5’-tgtccctgcgctaccaaga-3’；反向引物：5’-gatgagcttttgggatctggag-3’；优选的，基因slc12a4信使rna的扩增引物是：正向引物：5’-cctcatcgtgcttatctgctg-3’；反向引物：5’-ggctgctgcgaatgttgttc-3’；优选的，多基因组合的热点基因wipi1信使rna的扩增引物是：正向引物：5’-actaaagccgggtataagctgt-3’；反向引物：5’-cgggatttcattgcttccgtg-3’；优选的，基因rhbdf2信使rna的扩增引物是：正向引物：5’-gatggggcagacacgtttga-3’；反向引物：5’-cctcggaagtagctggcag-3’。本发明还提供基因pramef10信使rna的扩增引物，基因rps6ka1信使rna的扩增引物，基因ube2t信使rna的扩增引物，基因mcm10信使rna的扩增引物，基因slc12a4信使rna的扩增引物，基因wipi1信使rna的扩增引物，以及基因rhbdf2信使rna的扩增引物，在非酒精性脂肪性肝炎的多基因组合检测试剂盒中的应用。进一步，上述的应用，还可以具有这样的特征：其中，优选的，基因pramef10信使rna的扩增引物是：正向引物：5’-tgcctgagctacctttttggg-3’；反向引物：5’-tcccgttttattgagagagcac-3’；优选的，基因rps6ka1信使rna的扩增引物是：正向引物：5’-cagtgggcacctgtatgctat-3’；反向引物：5’-acgaatgggtgatttacatcagc-3’；优选的，基因ube2t信使rna的扩增引物是：正向引物：5’-atccctcaacatcgcaactgt-3’；反向引物：5’-cagcctctggtagattatcaagc-3’；优选的，基因mcm10信使rna的扩增引物是：正向引物：5’-tgtccctgcgctaccaaga-3’；反向引物：5’-gatgagcttttgggatctggag-3’；优选的，基因slc12a4信使rna的扩增引物是：正向引物：5’-cctcatcgtgcttatctgctg-3’；反向引物：5’-ggctgctgcgaatgttgttc-3’；优选的，多基因组合的热点基因wipi1信使rna的扩增引物是：正向引物：5’-actaaagccgggtataagctgt-3’；反向引物：5’-cgggatttcattgcttccgtg-3’；优选的，基因rhbdf2信使rna的扩增引物是：正向引物：5’-gatggggcagacacgtttga-3’；反向引物：5’-cctcggaagtagctggcag-3’。进一步，上述的应用，还可以具有这样的特征，还包括：对被测样本的检测结果进行评分的步骤。进一步，上述的应用，还可以具有这样的特征：其中，评分所用的公式为：式中，sn为利用多基因组合检测试剂盒检测出的单个基因信使rna的相对量；为针对于每个热点基因的校正值。进一步，上述的应用，还可以具有这样的特征：各基因评分所用的校正值如下：σmcm103.337σpramef104.449σrhbdf24.884σrps6ka16.292σslc12a46.787σube2t4.076σwipi17.770本发明的发明人在研究中发现一组热点基因在非酒精性脂肪性肝炎患者的腹部皮下脂肪组织中显著上调；相反，用rt-pcr技术在脂肪肝患者和体型肥胖但没有肝脏病变的志愿者的腹部皮下脂肪组织样本中验证得知，该组热点基因并没有明显上调。通过运用加权算法，进一步将多基因组合检测的结果进行评估打分，结果发现，评分结果可以准确地诊断非酒精性脂肪性肝炎，并且反映脂肪肝到非酒精性脂肪性肝炎的病程进展。由于非酒精性脂肪性肝炎的发生发展与脂质代谢紊乱密切相关，因而脂肪细胞中基因的变化可能对非酒精性脂肪性肝炎起到提示作用。通过分析非酒精性脂肪性肝炎患者皮下脂肪组织样品的多基因组合的信使rna的丰度，发现由7个热点基因组成的多基因组合的丰度与非酒精性脂肪性肝炎的发病高度关联，并研制出可便于临床应用的非酒精性脂肪性肝炎辅助诊断试剂盒，为非酒精性脂肪性肝炎的诊断提供非侵入性的分子指标的支持，并为临床用药提供指导信息。本发明的效果如下：(1)利用qpcr进行多基因组合检测具有非常高的敏感性和特异性，而且定量精确，运用配套评分系统，有助于非酒精性脂肪性肝炎辅助诊断；同时该检测结果可以及早显示出脂肪肝患者向非酒精性脂肪性肝炎的恶化，为临床上判断脂肪肝患者的疾病发展提供信息支持。(2)在对普通肥胖人群和脂肪肝患者的实际取样实验中，验证了本发明试剂盒的有效性，并且和常规的肝脏穿刺活检的结果相互比较，证明了本发明试剂盒能够有效地检测出非酒精性脂肪性肝炎，并且为普通肥胖人群和脂肪肝患者制定健康管理提供了帮助。本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。附图说明图1显示利用本发明的试剂盒对皮下脂肪样品中pramef10信使rna的扩增情况。图2显示利用本发明的试剂盒对皮下脂肪样品中rps6ka1信使rna的扩增情况。图3显示利用本发明的试剂盒对皮下脂肪样品中ube2t信使rna的扩增情况。图4显示利用本发明的试剂盒对皮下脂肪样品中mcm10信使rna的扩增情况。图5显示利用本发明的试剂盒对皮下脂肪样品中slc12a4信使rna的扩增情况。图6显示利用本发明的试剂盒对皮下脂肪样品中wipi1信使rna的扩增情况。图7显示利用本发明的试剂盒对皮下脂肪样品中rhbdf2信使rna的扩增情况。图8是多基因组合检测的结果。图9是多基因组合检测打分后的结果。具体实施方式以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。本发明的非酒精性脂肪性肝炎辅助诊断试剂盒的研制过程包括：(1)系统收集非酒精性脂肪性肝炎患者和脂肪肝患者的腹部皮下脂肪组织样品，招募健康人和体型偏胖的健康人的腹部皮下脂肪组织样品；(2)研究腹部皮下脂肪组织样品中该组热点基因的表达量；(3)建立数学模型，以该组热点基因的表达量为参考，建立配套评分系统，计算最终分数；(4)研制基于多基因组合检测的非酒精性脂肪性肝炎辅助诊断试剂盒。在上述步骤(3)中，热点基因pramef10、rps6ka1、ube2t、mcm10、slc12a4、wipi1、rhbdf2信使rna的丰度采用qpcr进行检测，具体的操作步骤为：(1)分离纯化腹部皮下脂肪组织样品中的总rna；(2)将步骤(1)的总rna逆转录成cdna；(3)在荧光实时定量pcr仪上将pramef10、rps6ka1、ube2t、mcm10、slc12a4、wipi1、rhbdf2进行扩增检测；多基因组合的热点基因pramef10信使rna的扩增引物：正向引物：5’-tgcctgagctacctttttggg-3’(seqidno：1)；反向引物：5’-tcccgttttattgagagagcac-3’(seqidno：2)。多基因组合的热点基因rps6ka1信使rna的扩增情况：正向引物：5’-cagtgggcacctgtatgctat-3’(seqidno：3)；反向引物：5’-acgaatgggtgatttacatcagc-3’(seqidno：4)。多基因组合的热点基因ube2t信使rna的扩增情况：正向引物：5’-atccctcaacatcgcaactgt-3’(seqidno：5)；反向引物：5’-cagcctctggtagattatcaagc-3’(seqidno：6)。多基因组合的热点基因mcm10信使rna的扩增情况：正向引物：5’-tgtccctgcgctaccaaga-3’(seqidno：7)；反向引物：5’-gatgagcttttgggatctggag-3’(seqidno：8)。多基因组合的热点基因slc12a4信使rna的扩增情况：正向引物：5’-cctcatcgtgcttatctgctg-3’(seqidno：9)；反向引物：5’-ggctgctgcgaatgttgttc-3’(seqidno：10)。多基因组合的热点基因wipi1信使rna的扩增情况：正向引物：5’-actaaagccgggtataagctgt-3’(seqidno：11)；反向引物：5’-cgggatttcattgcttccgtg-3’(seqidno：12)。多基因组合的热点基因rhbdf2信使rna的扩增情况：正向引物：5’-gatggggcagacacgtttga-3’(seqidno：13)；反向引物：5’-cctcggaagtagctggcag-3’(seqidno：14)。上述步骤均可以为本领域常规实验步骤。例如，步骤(1)的具体操作步骤包括：a.组织匀浆：在液氮浴中把组织标本研磨为粉状，加入适量trizol试剂，转移至1.5mleppendorf管中，放置室温下5分钟。b.每ml组织研磨液中加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15秒，室温下静置3分钟，之后放入离心机，12000g离心15分钟。c.小心移取上清至新管，加入相同体积的异丙醇，颠倒混匀。4℃下静置15分钟，之后7500g离心15分钟。d.移弃上清，加入1ml75％乙醇，7500g离心5分钟。e.空气干燥rna沉淀10分钟，用20μldepc水溶解沉淀。f.用紫外分光光度计检测od260和od280的值。步骤(2)的具体操作包括：将步骤(1)提取的1μg总rna溶解于14μldepc水中，加入2μl10×pcr缓冲液、2μl10mmdntp混合液、1μloligo(dt)18引物(0.5μg/ul)和1μl逆转录酶，轻微震荡。42℃孵育60分钟，置于95℃3分钟。冰上冷却之后短暂离心，加入380μl去离子水，备用。步骤(3)的具体操作包括：采用12μl反应体系，每个样本设置3个重复管，以保证结果的可靠性。sybrgreen聚合酶链式反应体系6μl，正反向引物各1μl，步骤(2)的反应产物4μl。扩增程序为：94℃，5分钟，(94℃，15秒；60℃，60秒)×40个循环。在荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应。图1显示利用本发明的试剂盒对皮下脂肪样品中pramef10信使rna的扩增情况。图2显示利用本发明的试剂盒对皮下脂肪样品中rps6ka1信使rna的扩增情况。图3显示利用本发明的试剂盒对皮下脂肪样品中ube2t信使rna的扩增情况。图4显示利用本发明的试剂盒对皮下脂肪样品中mcm10信使rna的扩增情况。图5显示利用本发明的试剂盒对皮下脂肪样品中slc12a4信使rna的扩增情况。图6显示利用本发明的试剂盒对皮下脂肪样品中wipi1信使rna的扩增情况。图7显示利用本发明的试剂盒对皮下脂肪样品中rhbdf2信使rna的扩增情况。验证了本发明的试剂盒对皮下脂肪样品检测的有效性。从结果可以看出，本发明的试剂盒可以有效检测皮下脂肪样品组织样品中该组基因信使rna的丰度，依据扩增曲线可以得出单个基因信使rna的测量值。然后按照下面的公式依据测量值进行系统性的评分：公式的具体说明如下：sn为上述利用试剂盒检测出的单个基因信使rna的相对量；为针对于每个热点基因的校正值；表1：公式(1)中的各基因的值σmcm103.337σpramef104.449σrhbdf24.884σrps6ka16.292σslc12a46.787σube2t4.076σwipi17.770表1中的各个校正值是通过大量的预实验得到的。为了继续评估本发明在非酒精性脂肪性肝炎临床辅助诊断中的价值，发明人运用本试剂盒对临床收集的22例非酒精性脂肪性肝炎患者的腹部皮下脂肪样品、8例脂肪肝患者的腹部皮下脂肪样品、31例轻度肥胖志愿者的腹部皮下脂肪样品和10例健康人的腹部皮下脂肪样品进行了检测。其中，10例健康人的腹部皮下脂肪样品作为对照组。发明人比对了本试剂盒的检测结果和常规肝脏活检的结果。如表2所示，运用本试剂盒首先检测出单个基因信使rna的测量值，然后综合7个热点基因的相对量按照本试剂盒提供的公式进行总分计算，最终结果如附表3所示，临界值为8分，超过这一临界值的病人被诊断为非酒精性脂肪性肝炎。对比如图9所示的常规肝脏活检的结果，本发明的准确率达到83％，漏检率为9％。该结果显示，用本发明的试剂盒对非酒精性脂肪性肝炎病人的疾病状况评估具有十分重要的参考价值，可以提示病人的疾病进展；对于监测脂肪肝患者的健康状况也具有一定的提示作用，评分比较高的脂肪肝患者极有可能发展为非酒精性脂肪性肝炎，应当给予更密切的检测和治疗。表2：本试剂盒检测的单个基因信使rna的量表3：运用本试剂盒提供的配套算法的最终系统评分结果。表2中的数据与图8中相对应。表3中的数据与图8中上部的柱图相对应。以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。当前第1页12