聚合酶链式反应装置以及聚合酶链式反应方法与流程

本发明涉及聚合酶链式反应装置以及聚合酶链式反应方法。

背景技术：

作为从微量的染色体组(染色体或基因)、RNA(核糖核酸)选择性地使作为目标的DNA(脱氧核糖核酸)扩增的方法，已知有1983年美国(USA)的凯利·穆利斯(Kary Banks Mullis)氏开发的聚合酶链式反应(PCR；Polymerase Chain Reaction)法。

PCR法是如下方法，例如具有：热变性工序，将包括成为扩增对象的双链DNA、作为DNA的断片的引物、DNA合成材料、以及DNA合成酶的水溶液加热至规定的反应温度，并使双链DNA解离成单链DNA；退火工序，使得将水溶液从上述规定的反应温度冷却并解离而成的单链DNA结合引物；以及延伸工序，使与单链DNA结合的引物进一步结合DNA合成酶，使引物延伸，通过依次反复进行该3个工序，使双链DNA以指数函数扩增。已开发了能够进行这样的聚合酶链式反应(PCR)的PCR装置、PCR方法。

例如，在专利文献1中公开了如下的PCR装置，即，该PCR装置具备：进行PCR的容器；隔着沿反应液的流动的间隙与该容器的内表面对置配置的电极对；以及控制单元，其通过对电极对施加交流电压使交流电流流动于反应液，产生焦耳热，控制反应液的温度。根据该PCR装置，与使直流电流流动于反应液，产生焦耳热而加热反应液的方法相比，由于交流电流流动于反应液，因此，反应液不产生电分解，并且能够产生足够的焦耳热以用于PCR周期。

另外，例如，在专利文献2中公开了如下的DNA扩增装置，该DNA扩增装置具备能够装配进行PCR的容器(对象物)的金属槽(metalwell)、通过珀尔帖效应加热或冷却对象物的温度元件、以及控制针对温度元件的通电的控制部。另外，作为该温度元件，示出了组合p型半导体和n型半导体的例子。根据这样的DNA扩增装置，能够使反应液的温度追随PCR中的规定的温度模式的变化，缩短PCR的所需时间。

专利文献1：日本特开2011-115159号公报

专利文献2：日本特开2011-188749号公报

在上述专利文献1的PCR装置中，示出了作为反应液流动的流路的间隙(通道)的宽度为980μm、深度为600μm、长度为2～8mm的例子。这样的话，填充至间隙的反应液的体积大约是1～5μL(微升)。由于对间隙(通道)连接有用于供给反应液的注入槽和用于排出反应液的排出槽连接，因此，实际需要准备比间隙(通道)的容量多的反应液。换言之，用于进行PCR的反应液容易产生浪费。

另一方面，上述专利文献2的DNA扩增装置将反应液计量并收纳至mm(毫米)单位的管(容器)，并将该管收纳至金属槽进行PCR，因此，避免不必要地消耗反应液。并且，将现有的PCR中的3个级别的温度模式的1个周期所需要的时间大约耗费的250秒缩短至150秒。然而，若使用上述专利文献2的DNA扩增装置，例如反复进行50个周期的温度模式，则PCR的所需时间达到7500秒，即耗费大约2小时，因此，存在欲进一步缩短所需时间的课题。

技术实现要素：

本发明是为了解决上述的课题的至少一部分而成的，能够利用以下的方式或者应用例实现。

应用例

本应用例所涉及的聚合酶链式反应装置是使收纳于容器的反应液所包含的核酸扩增的聚合酶链式反应装置，具备：下侧电极以及上侧电极，沿铅垂方向拉开间隔配置；电场产生部；第一加热部，在上述容器被配置于上述下侧电极与上述上侧电极之间时，对上述容器的接近上述上侧电极的一侧进行加热；第二加热部，在上述容器被配置于上述下侧电极与上述上侧电极之间时，对上述容器的接近上述下侧电极的一侧进行加热；以及控制部，向上述容器填充上述反应液、以及比重比上述反应液小且不与上述反应液混和的液体，上述控制部以上述容器的上方部分的上述液体成为第一温度，上述容器的下方部分的上述液体成为比上述第一温度低的第二温度的方式驱动控制上述第一加热部和上述第二加热部，并且，以在上述液体中成为球状的上述反应液通过基于电场的库伦力在上述液体的上述上方部分与上述下方部分之间反复进行上下移动的方式驱动控制上述电场产生部，在上述下侧电极与上述上侧电极之间产生电场。

根据本应用例所涉及的聚合酶链式反应(PCR)装置，在下侧电极与上侧电极之间产生电场，使库伦力作用于在液体中成为球状的反应液，使反应液在液体中上升至被靠近上侧电极的第一加热部加热的上方部分，成为第一温度，通过停止该电场的产生而使上升的反应液在液体中下降至被靠近下侧电极的第二加热部加热的下方部分，能够从第一温度快速地变化至第二温度。通过使第一温度为使聚合酶链式反应(PCR)的核酸热变性而成为单链核酸的温度，使第二温度为比第一温度低的PCR的退火、延伸的温度，能够与PCR的温度模式对应地使反应液的温度反复变化。换句话说，能够提供一种与直接或间接地加热反应液而反复进行PCR的温度模式的上述的专利文献1、专利文献2的现有的PCR装置相比，能够缩短PCR的温度模式的切换时间，缩短PCR的核酸扩增的所需时间的PCR装置。另外，由于在不与反应液混和的液体中进行反应液的PCR，所以与上述的专利文献1的PCR装置相比，能够减少反应液的浪费。

在上述应用例所述的PCR装置中，优选上述控制部以向上述下侧电极赋予第一电位，在使上述反应液位于上述上方部分时，向上述上侧电极赋予电位在上述第一电位与比上述第一电位高的第二电位之间变化的交流电位的方式驱动控制上述电场产生部。

根据该构成，由于基于交流电位的库伦力作用于反应液，所以反应液进行微振动。换句话说，能够对反应液进行微小搅拌，促进热变性、退火、延伸的工序。因此，能够缩短这些工序所需要的时间。

应用例

本应用例所涉及的其它的聚合酶链式反应装置是使收纳于容器的反应液所包含的核酸扩增的聚合酶链式反应装置，具备：下侧电极以及上侧电极，沿铅垂方向拉开间隔配置；电场产生部；第一加热部，在上述容器被配置于上述下侧电极与上述上侧电极之间时，对上述容器的接近上述上侧电极的一侧进行加热；第二加热部，在上述容器被配置于上述下侧电极与上述上侧电极之间时，对上述容器的接近上述下侧电极的一侧进行加热；以及控制部，向上述容器填充上述反应液、比重比上述反应液小且不与上述反应液混和的液体，上述控制部以上述容器的上方部分的上述液体成为第一温度，上述容器的下方部分的上述液体成为比上述第一温度低的第二温度的方式驱动控制上述第一加热部和上述第二加热部，以在上述液体中成为球状的上述反应液通过基于电场的库伦力按照上述液体的上述上方部分、上述下方部分、以及上述上方部分与上述下方部分之间的成为第三温度的中间部分的顺序反复进行上下移动的方式驱动控制上述电场产生部，在上述下侧电极与上述上侧电极之间产生电场。

根据本应用例所涉及的其它的PCR装置，在下侧电极与上侧电极之间产生电场，使库伦力作用于在液体中成为球状的反应液，使反应液在液体中上升至被靠近上侧电极的第一加热部加热的上方部分，成为第一温度，通过停止该电场的产生而使上升的反应液在液体中下降至被靠近下侧电极的第二加热部加热的下方部分，能够从第一温度迅速地变化至第二温度。另外，通过改变电场强度来调整库伦力的大小，能够使反应液从下方部分上升至中间部分，从第二温度迅速地变化至第三温度。通过使第一温度为使聚合酶链式反应(PCR)的核酸热变性而成为单链核酸的温度，使第二温度为比第一温度低的PCR的退火的温度，使第三温度为PCR的延伸的温度，能够与PCR的温度模式对应地使反应液的温度反复变化。换句话说，能够提供一种与直接或间接地加热反应液，反复进行PCR的温度模式的上述的专利文献1、专利文献2的现有的PCR装置相比，能够缩短PCR的温度模式的切换时间，缩短PCR的核酸扩增的所需时间的PCR装置。另外，由于在不与反应液混和的液体中进行反应液的PCR，所以与上述的专利文献1的PCR装置相比，能够减少反应液的浪费。

在上述应用例所述的PCR装置中，上述控制部以向上述下侧电极赋予第一电位，在使上述反应液位于上述上方部分时，向上述上侧电极赋予电位在上述第一电位与比上述第一电位高的第二电位之间变化的交流电位，在使上述反应液位于上述中间部分时，向上述上侧电极赋予电位在上述第一电位与比上述第二电位低的第三电位之间变化的交流电位的方式驱动控制上述电场产生部。

根据该构成，由于基于交流电位的库伦力作用于反应液，所以反应液进行微振动。换句话说，对反应液进行微小搅拌，能够分别促进热变性、退火、延伸的工序。因此，能够缩短这些工序所需要的时间。

在上述应用例所述的PCR装置中，优选具备能够载置多个上述容器的工作台，对于上述多个容器，上述下侧电极以及上述上侧电极被共用地设置。

根据该构成，能够提供一种能够同时对很多相同种类或不同种类的反应液进行PCR处理的PCR装置。

在上述应用例所述的PCR装置中，优选上述上侧电极对上述多个容器的每个进行设置，具有能够插入至上述容器的柱状电极部。

根据该构成，能够对多个容器的每个适当地配置上侧电极的柱状电极部和下侧电极，使库伦力有效地作用于收纳于多个容器的每个的反应液。

在上述应用例所述的PCR装置中，优选上述工作台与上述下侧电极成为一体。

在上述应用例所述的PCR装置中，优选上述下侧电极与上述第二加热部成为一体。

根据这些构成，能够削减部件件数，提供具有简单构成的PCR装置。

在上述应用例所述的PCR装置中，优选具备使上述下侧电极以及上述上侧电极中的至少一方移动，能够调整上述下侧电极与上述上侧电极之间的电极间距离的升降机构。

根据该构成，由于能够通过升降机构调整下侧电极与上侧电极的电极间距离，所以能够使库伦力有效地作用于反应液。换言之，由于使反应液移动的库伦力主要由施加至下侧电极和上侧电极的电位和电极间距离决定，所以能够通过调整为与施加的电位相应的适当的电极间距离，减少不必要的电力消耗。

应用例

本应用例所涉及的聚合酶链式反应(PCR)方法是使反应液所包含的核酸扩增的聚合酶链式反应方法，具备：向容器填充上述反应液、以及比重比上述反应液小且不与上述反应液混和的液体的第一工序；将填充至上述容器的上述液体的上方部分加热至上述核酸热变性的第一温度，并且，将填充至上述容器的上述液体的下方部分加热至比上述第一温度低且使经热变性的上述核酸扩增的第二温度的第二工序；以及针对上述容器沿铅垂方向拉开间隔配置的下侧电极与上侧电极之间产生电场，使库伦力作用于在上述液体中成为球状的上述反应液，使上述反应液在上述液体的上述上方部分与上述下方部分之间反复进行上下移动的第三工序。

根据本应用例所涉及的PCR方法，在下侧电极与上侧电极之间产生电场，使库伦力作用于在液体中成为球状的反应液，通过使反应液在液体中上升而位于上方部分，成为第一温度，通过停止该电场的产生而使位于上方部分的第一温度的反应液在液体中下降而位于下方部分，能够迅速地变化至第二温度。换句话说，能够与PCR的温度模式对应地使反应液的温度在第一温度与第二温度之间反复变化。因此，能够提供一种与使用了直接或间接地加热反应液而反复进行PCR的温度模式的上述的专利文献1、专利文献2的PCR装置的现有的PCR方法相比，能够缩短PCR的温度模式的切换时间，并缩短PCR的核酸扩增的所需时间的PCR方法。另外，由于在不与反应液混和的液体中进行反应液的PCR，所以与使用了上述专利文献1的PCR装置的现有的PCR方法相比，能够减少反应液的浪费。

在上述应用例所述的PCR方法中，优选向上述下侧电极赋予第一电位，在使上述反应液位于上述上方部分时，向上述上侧电极赋予电位在上述第一电位与比上述第一电位高的第二电位之间变化的交流电位。

根据该方法，由于基于交流电位的库伦力作用于反应液，所以反应液进行微振动。换句话说，能够对反应液进行微小搅拌，促进第二工序、第三工序中的反应。因此，能够缩短这些工序所需要的时间。

在上述应用例所述的PCR方法中，上述反应液包括靶核酸、核酸合成底物、耐热酶、以及引物，上述第三工序包括：在上述第一温度下，使上述靶核酸热变性并分离为单链核酸的第四工序；在上述第二温度下，使上述单链核酸结合上述引物的第五工序；以及在上述第二温度下，将上述耐热酶作为催化剂，将与上述单链核酸结合的上述引物作为起始点，使用上述核酸合成底物合成与单链部分互补的核酸的第六工序。

根据该方法，能够高效地反复进行从第四工序至第六工序，使靶核酸扩增。

在上述应用例所述的PCR方法中，上述容器中的上述液体在被加热至上述第一温度的上述上方部分与被加热至上述第二温度的上述下方部分之间具有成为比上述第一温度低且比上述第二温度高的第三温度的中间部分，上述反应液包括靶核酸、核酸合成底物、耐热酶、以及引物，上述第三工序包括：在上述第一温度下，使上述靶核酸热变性并分离为单链核酸的第四工序；在上述第二温度下，使上述单链核酸结合上述引物的第五工序；以及在上述第三温度下，将上述耐热酶作为催化剂，将与上述单链核酸结合的上述引物作为起始点，使用上述核酸合成底物，合成与单链部分互补的核酸的第六工序，在上述下侧电极与上述上侧电极之间产生电场，使库伦力作用于在上述液体中成为球状的上述反应液，使上述反应液按照上述液体的上述上方部分、上述下方部分、上述中间部分的顺序反复进行上下移动。

根据该方法，由于能够使第五工序和第六工序的温度分别以适当的温度进行反应，所以能够更加高效地反复进行从第四工序至第六工序，使靶核酸扩增。

在上述应用例所述的PCR方法中，向上述下侧电极赋予第一电位，在使上述反应液位于上述上方部分时，向上述上侧电极赋予电位在上述第一电位与比上述第一电位高的第二电位之间变化的交流电位，在使上述反应液位于上述中间部分时，向上述上侧电极供给电位在上述第一电位与比上述第二电位低的第三电位之间变化的交流电位。

根据该方法，由于基于交流电位的库伦力作用于反应液，所以反应液进行微振动。换句话说，能够对反应液进行微小搅拌，促进第二工序、第三工序中的反应。因此，能够缩短这些工序所需要的时间。

在上述应用例所述的PCR方法中，上述靶核酸是DNA。

根据该方法，能够提供一种能够高效地扩增DNA的PCR方法。

在上述应用例所述的PCR方法中，上述靶核酸是结合2个单链RNA而成的核酸。

根据该方法，能够提供一种能够高效地扩增单链RNA的PCR方法。

附图说明

图1是表示第一实施方式的PCR装置的电以及机械的构成例的概要图。

图2是表示容器的概要立体图。

图3是表示加热部的概要俯视图。

图4A是表示第一实施方式的PCR装置的动作的概要图。

图4B是表示第一实施方式的PCR装置的动作的概要图。

图5A是表示施加至上侧电极的交流电位的波形的图。

图5B是表示反应液的温度变化的一个例子的曲线图。

图6是表示PCR方法的各工序的概要图。

图7是表示DNA的热变性反应的示意图。

图8是表示退火反应的示意图。

图9是表示延伸反应的示意图。

图10是表示第二实施方式的PCR装置的概要图。

图11是表示用于第二实施方式的PCR装置的容器的概要立体图。

图12是表示用于第二实施方式的PCR装置的加热部的概要俯视图。

图13是表示其它的PCR方法的工序的概要图。

图14A是表示其它的PCR方法中的施加至上侧电极的交流电位的波形的图。

图14B是表示其它的PCR方法中的反应液的温度变化的一个例子的曲线图。

具体实施方式

以下，根据附图对将本发明具体化的实施方式进行说明。应予说明，使用的附图以说明的部分达到能够识别的状态的方式被适当地放大或缩小而显示。

(第一实施方式)

聚合酶链式反应(PCR)装置

参照图1对本实施方式的聚合酶链式反应(PCR)所使用的PCR装置的整体构成例进行说明。图1是表示PCR装置的电以及机械的构成例的概要图。本实施方式的PCR装置是针对收纳于容器的反应液反复实施PCR中的温度模式(加热及冷却)，使反应液所包括的核酸扩增的装置。

如图1所示，本实施方式的PCR装置100包括下侧电极10、上侧电极20、升降机构120、移动机构130、电场产生部140、加热部150、操作部160、以及控制部170而构成。可以将下侧电极10和上侧电极20沿铅垂方向对置配置，在下侧电极10的表面载置收纳反应液的容器30。下侧电极10和上侧电极20对置配置的空间是处理室110。处理室110由隔开处理室110与周围的空间之间的壁(省略图示)、能够开闭的盖(省略图示)等构成，能够使处理室110为大致闭塞状态和开放状态。PCR装置100具有设置处理室110、升降机构120、移动机构130、电场产生部140、加热部150、操作部160、以及控制部170的筐体(省略图示)。

若将处理室110作为基准，则在处理室110的下方设置有升降机构120和电场产生部140。在处理室110的前方设置有操作部160。在处理室110的后方设置有移动机构130和控制部170。以下，在附图上，将下侧电极10和上侧电极20对置配置的铅垂方向作为上下方向，将与上下方向正交的前后的方向作为前后方向。另外，在图1中虽未进行图示，但将与上下方向正交的左右的方向作为左右方向进行说明。

下侧电极10例如是对铝制的板实施了铝阳极化处理而成的，在上下方向的上侧的表面具有能够在规定的位置载置容器30的载置部。因此，下侧电极10作为载置容器30的工作台发挥功能。换言之，工作台和下侧电极10成为一体。

上侧电极20具有柱状电极部21和电极支承部22。电极支承部22例如是对铝制的板实施了铝阳极化处理而成的。柱状电极部21例如是对铝制的棒实施了铝阳极化处理而成的，立设于电极支承部22的上下方向的下侧的表面。

升降机构120能够使下侧电极10上下移动。由此，在下侧电极10和上侧电极20为沿上下方向对置配置的状态时，能够调整下侧电极10与上侧电极20(实质为柱状电极部21的前端)之间的电极间距离。

移动机构130能够使在前后方向延伸的支承部131在前后方向移动。在支承部131的前方侧的下侧的表面安装有上侧电极20(电极支承部22)。

电场产生部140分别向下侧电极10和上侧电极20赋予电位，使下侧电极10与上侧电极20(实际为柱状电极部21)之间产生电场。具体而言，向下侧电极10作为第一电位例如赋予0V，向上侧电极20作为第二电位例如赋予在0V与6kV之间电位变化的交流电位。对于交流电位的详细的施加方法在下文中描述，但交流电位被周期性地施加。应予说明，在本实施方式中，采用了使下侧电极10、上侧电极20、电场产生部140分别独立的构成，但下侧电极10以及上侧电极20也可以被电场产生部140包括。

加热部150具有能够加热载置于下侧电极10的容器30的上方部分的第一加热部151、以及能够加热容器30的下方部分的第二加热部152。

操作部160具备例如液晶显示面板等显示部、以及重叠于显示部的触摸面板式的输入部，能够通过输入部选择显示于显示部的各种操作按钮。

升降机构120、移动机构130、电场产生部140、加热部150、以及操作部160分别与控制部170电连接。由此，控制部170驱动控制PCR装置100的各部，进行与上述各种操作按钮对应的操作。例如，控制部170能够基于来自操作部160的操作驱动控制升降机构120，使下侧电极10沿上下方向升降，调整对置配置的下侧电极10与上侧电极20之间的电极间距离。另外例如，控制部170能够驱动控制移动机构130，使支承部131沿前后方向移动，使安装于支承部131的前方侧的上侧电极20在与下侧电极10对置的第一位置和从第一位置后退的第二位置之间移动。另外例如，控制部170能够驱动控制电场产生部140，分别向下侧电极10和上侧电极20赋予电位，使下侧电极10与上侧电极20之间周期性地产生电场。另外例如，控制部170能够驱动控制加热部150，通过第一加热部151和第二加热部152加热容器30，使容器30的上方部分为第一温度，使容器30的下方部分为比第一温度低的第二温度。

控制部170包括运算部171、存储部172、以及电源部173，控制部170能够基于预先存储于存储部172的PCR程序从电源部173向上述的各部供给电源，并自动地执行各部的驱动控制。PCR程序包括用于进行PCR中的各种反应的反应条件所涉及的信息。存储部172中不仅包括上述PCR程序，还包括PCR装置100的各种的控制程序，能够经由设置于控制部170的接口从外部访问存储部172，并进行PCR程序的阅览、修正、追加。应予说明，对于从外部的访问，从确保安全的观点考虑，也能够设定访问代码等。另外，电源部173并不局限于被控制部170包括而构成，也可以为被独立设置并被控制部170电控制的构成。

接下来，参照图2对容器30进行说明。图2是表示容器的概要立体图。如图2所示，容器30是使用透光性的材料形成的平底的圆筒容器。作为透光性的材料，能够使用玻璃、塑料等。容器30的容量例如是400μL左右，若使容器30的内侧部分的高度h例如为12mm，则容器30的内径d为大约6.5mm。如图1所示，上侧电极20的柱状电极部21能够插入至容器30。因此，柱状电极部21的厚度比容器30的内径d小，例如是1mm～3mm左右。柱状电极部21的长度例如是10mm～20mm左右。

接下来，参照图3对加热部150进行说明。图3是表示加热部的概要俯视图。具体而言，图3表示加热部150中的第一加热部151。

如图3所示，加热部150的第一加热部151是在中央处设置有孔151a的平板状的例如陶瓷加热器。成为在孔151a的内壁与容器30的外壁之间可稍微产生间隙的程度的孔151a的大小，能够在孔151a顺畅地插入容器30。加热部150的第二加热部152也为与第一加热部151相同的构成，具有同样的能够插入容器30的孔152a。

应予说明，以能够加热容器30的下方部分的方式配置的第二加热部152也可以与下侧电极10一体构成。由此，能够实现能够通过将容器30插入至第二加热部152的孔152a，使容器30相对于下侧电极10定位而载置，能够发挥工作台的功能的构成。在将容器30插入至第二加热部152的孔152a后，从容器30的上方设置第一加热部151。相对于第二加热部152拉开规定的间隔而设置第一加热部151。对于第一加热部151与第二加热部152的上下方向的详细的位置关系，在下文中描述。

PCR装置的动作

接下来，参照图4A、图4B、图5A、图5B对本实施方式的PCR装置100的动作进行说明。图4A以及图4B是表示PCR装置的动作的概要图，图5A是表示施加至上侧电极的交流电位的波形的图，图5B是表示反应液的温度变化的一个例子的曲线图。

如图4A所示，在容器30收纳液体50和反应液60。反应液60基本上是水溶液且比重比“1”大。与此相对，对于液体50，选择比重比反应液60小且不与反应液60混和的物质。收纳于容器30的反应液60的量(体积)比液体50的量(体积)少，例如是10μL以下。因此，在液体50中，反应液60通过与液体50之间的界面张力成为球状。另外，由于反应液60的比重比液体50大，所以沉入容器30的底部。

如上所述，容器30由具有透光性的材料构成，另外，收纳于容器30的液体50也是具有透光性的物质。作为构成这样的液体50的物质，能够列举硅系的油。应予说明，在本实施方式中，透光性是指在可见光波长区域中具有80％以上的透过率的状态。

将收纳有液体50和反应液60的容器30载置在下侧电极10上。在下侧电极10的表面10a设置有用于在规定的位置载置容器30的载置部11。在本实施方式中，在下侧电极10的表面10a设置与容器30的底面的大小对应的凹部，将其作为载置部11。凹部的深度相当于容器30的底部的厚度。应予说明，载置部11的构成并不局限于此，也可以在下侧电极10的表面10a设置对容器30进行定位的凸部。

针对载置在下侧电极10上的容器30，在接近下侧电极10的一侧配置第二加热部152。另外，以相对于所配置的第二加热部152，向上方拉开规定的间隔Dh的方式配置第一加热部151。规定的间隔Dh例如是5mm～10mm。在本实施方式中，对于容器30，将被第一加热部151加热的区域称作第一区域H1，同样，对于容器30，将被第二加热部152加热的区域称作第二区域H2。第一区域H1相当于本发明中的成为第一温度的上方部分，第二区域H2相当于本发明中的成为第二温度的下方部分。在液体50中，在成为球状的反应液60沉下时，相对于容器30，反应液60位于第二区域H2。

控制部170驱动控制移动机构130，以柱状电极部21位于容器30的上方的方式使上侧电极20移动。接着，控制部170驱动控制升降机构120，使下侧电极10上升，使得对收纳有液体50和反应液60的容器30插入柱状电极部21。并且，如图4B所示，调整为下侧电极10与上侧电极20(实质为柱状电极部21的前端)之间的电极间距离成为所希望的距离De。以下，将所希望的距离De称作电极间距离De。应予说明，由于如上所述，在下侧电极10设置有载置部11，所以考虑载置部11的深度来调整实质的电极间距离De。

另外，控制部170驱动控制电场产生部140，向以电极间距离De配置的下侧电极10和上侧电极20赋予电位，产生电场。具体而言，例如，如图5A所示，将下侧电极10的电位设为0V，向上侧电极20以基于PCR程序的周期施加例如电位在0V～6kV之间变化的频率为30Hz的交流电位。应予说明，在图5A中，以能够识别交流电位的施加的状态的程度显示交流电位的波形，因此，与实际施加的交流电位的波形不同。另外，交流电位的波形可以如图5A所示，是矩形状的脉冲波形(数字波形)，也可以是电位连续变化的正弦波形(模拟波形)。

在向上侧电极20施加交流电位的例如时间t₀～时间t₁的期间，在下侧电极10与上侧电极20的柱状电极部21之间产生电场，基于电场的库伦力作用于球状的反应液60。因此，如图4B所示，球状的反应液60在液体50中被吸引上升至柱状电极部21侧。反应液60的上升在作用于反应液60的库伦力与重力平衡的位置停止。实际上向上侧电极20施加交流电位，因此，库伦力作用的反应液60与交流电位的频率对应地进行微振动。

在未向上侧电极20施加交流电位的例如时间t₁～时间t₂的期间，下侧电极10与上侧电极20的柱状电极部21之间的电场消失，库伦力不作用于球状的反应液60，反应液60由于重力在液体50中下降。由此，反应液60如图4A所示，位于第二区域H2。

向上侧电极20施加的交流电位并不局限于0V～6kV、30Hz。考虑反应液60的比重、质量、液体50的比重、粘度等，以向上侧电极20施加交流电位而使反应液60在液体50中上升并位于第一区域H1的方式设定上述交流电位的电压及频率、以及电极间距离De。例如，在将反应液60的比重设为几乎为1.0，体积设为10μl(微升)以下，作为液体50使用比重大约为0.89的硅系的油的情况下，可以想到交流电位为0V～10kV的范围，频率为0.2Hz～50Hz的范围。

将被第一加热部151加热的第一区域H1中的液体50的第一温度例如设为94℃，将被第二加热部152加热的第二区域H2中的液体50的第二温度例如设为60℃。由此，如图5B所示，向上侧电极20施加交流电位，在液体50中上升并位于第一区域H1的反应液60的温度达到94℃，并维持至时间t₁。向上侧电极20的交流电位的施加停止，在液体50中下降并位于第二区域H2的反应液60的温度从94℃下降(冷却)至60℃，并维持至时间t₂。

若将下侧电极10的电位设为0V，周期性地向上侧电极20施加交流电位，则在液体50中，球状的反应液60在第二区域H2与第一区域H1之间周期性地上下移动。换句话说，反应液60的温度如图5B所示，在94℃与60℃之间周期性地变化。这样的PCR装置100的动作与直接或间接地加热及冷却静置的反应液，使其变化为第一温度和第二温度的现有的PCR装置相比，能够使反应液60的温度迅速变化。

若考虑在下侧电极10与上侧电极20之间产生的电场的强度的调整，则优选能够视觉确认成为球状的反应液60在液体50中上下移动的状态。因此，优选容器30以及液体50具有透光性。

聚合酶链式反应(PCR)方法

接下来，参照图6～图9对本实施方式的PCR方法进行说明。图6是表示PCR方法的各工序的概要图，图7是表示DNA的热变性反应的示意图，图8是表示退火反应的示意图，图9是表示延伸反应的示意图。

本实施方式的PCR方法是使反应液60所包括的作为靶核酸的DNA扩增的方法，具备向容器30填充液体50和反应液60的填充工序(第一工序)、加热工序(第二工序)、以及将热变性工序(第四工序)、退火工序(第五工序)、以及延伸工序(第六工序)按该顺序反复进行的工序(第三工序)。

反应液60含有作为靶核酸的DNA、DNA合成底物(dNTP；脱氧核糖核苷三磷酸)、耐热酶(耐热DNA聚合酶)、引物(寡核苷酸)、以及水。应予说明，反应液60含有被称作正向引物以及反向引物的至少2种引物。

具体而言，如图6所示，在填充工序中，在向容器30填充液体50后，例如从能够定量排出微量的液体的微量吸液管40向容器30排出包括作为靶核酸的DNA的规定量(例如5μL)的反应液60。排出的反应液60的液滴的比重比液体50大，且不与液体50混和，因此，在液体50中成为球状，沉入容器30的底部。将收纳有液体50和反应液60的容器30设置在PCR装置100的下侧电极10上。然后，进入加热工序。

在加热工序中，使PCR装置100运转，控制部170驱动控制第一加热部151和第二加热部152，由此使容器30的第一区域H1中的液体50的温度为第一温度，并且，使容器30的第二区域H2中的液体50的温度为第二温度。然后，进入第三工序。

在第三工序中，控制部170驱动控制移动机构130，以柱状电极部21位于容器30的上方的方式使上侧电极20移动。然后，控制部170驱动控制升降机构120，以成为所希望的电极间距离De的方式使下侧电极10上升。由此，柱状电极部21被插入至容器30，柱状电极部21的前端浸入液体50中，在第一区域H1的稍微上方的位置停止。在该状态下，控制部170驱动控制电场产生部140，在下侧电极10与上侧电极20之间周期性地产生电场。

在向上侧电极20施加交流电位的期间，基于在下侧电极10与柱状电极部21之间产生的电场的库伦力作用于反应液60，球状的反应液60被吸引上升至柱状电极部21，在第一区域H1停止并成为进行微振动的状态。第一区域H1中的反应液60的温度例如如图5B所示，上升至94℃并被维持。如图7所示，反应液60所包含的双链DNA61通过反应液60被加热至94℃而分离为2个单链DNA61a、61b。至此，是第三工序中的热变性工序(第四工序)。应予说明，热变性工序中的液体50的温度，即反应液60的温度被设定为双链DNA61分离且不产生反应液60的沸腾的95℃以上且小于100℃的温度。在双链DNA61、单链DNA61a、61b的端部标出的符号3’、5’表示作为构成单位的核苷酸中的糖的碳的位置。其中，核酸通过糖的3’位的碳和5’位的碳与磷酸以磷酸酯结合而形成链状构造，5’位的磷酸酯结合切断的末端是5’末端，另一个末端是3’末端。在此所示的3’、5’是指3’末端、5’末端。然后，进入退火工序(第五工序)。

在退火工序(第五工序)中，停止向上侧电极20的交流电位的施加。由此，在下侧电极10与上侧电极20之间产生的电场消失，不再对反应液60作用库伦力。因此，球状的反应液60由于重力从第一区域H1下降至第二区域H2。在不向上侧电极20施加交流电位的期间，第二区域H2中的反应液60的温度例如如图5B所示，从94℃降低(冷却)至60℃并被维持。如图8所示，在反应液60中，引物62与单链DNA61a结合。应予说明，引物62与单链DNA61a的具有互补的碱基排列的部位结合。然后，进入延伸工序(第六工序)。

在延伸工序(第六工序)中，在未向上侧电极20施加交流电位的状态下，换句话说，在球状的反应液60停留在成为第二温度(60℃)的第二区域H2的状态下，进行反应。具体而言，如图9所示，将与单链DNA61a结合的引物62作为起始点，将耐热酶64作为催化剂，使DNA合成底物63连续地结合，对单链DNA61a合成互补的双链DNA61。应予说明，在热变性工序中分离的另一个单链DNA61b中，也以第二温度(60℃)进行退火反应和延伸反应，对单链DNA61b合成互补的双链DNA61。

通过反复进行n次上述的热变性工序～延伸工序，双链DNA61的数量被扩增至2的n次方。在PCR法中，通过反复进行这样的热变性工序～延伸工序，DNA合成底物63被消耗，DNA合成底物63的浓度降低。一般而言，热变性工序～延伸工序反复进行50次左右。

作为确认产生了靶核酸的扩增的方法，列举向反应液60加入荧光探针的方法。通过对从检测器荧光探针所包含的荧光物质产生的荧光进行测量，能够调查产生了靶核酸的扩增的情况。

根据上述第一实施方式的PCR装置100以及使用该装置的PCR方法，能够得到以下的效果。

(1)利用基于在下侧电极10与柱状电极部21之间产生的电场的库伦力，使反应液60在填充至容器30的液体50中，在PCR中的进行热变性反应的成为第一温度的第一区域H1(上方部分)和PCR中的进行退火反应、延伸反应的成为比第一温度低的第二温度的第二区域H2(下方部分)之间上下移动。因此，与直接或间接地加热及冷却静置的反应液60的现有的PCR装置以及使用该装置的PCR方法相比，能够使反应液60的温度在短时间内变化，因此，能够提供一种能够缩短PCR的所需时间的PCR装置100以及使用该装置的PCR方法。

(2)每当产生基于电场的库伦力时，向下侧电极10赋予第一电位(0V)，向上侧电极20赋予电位在第一电位(0V)与比第一电位(0V)高的第二电位(6kV)之间变化的交流电位。由此，在反应液60中产生相当于交流电位的频率的微振动，反应液60被微小搅拌。通过反应液60被微小搅拌，高效地进行热变性反应、退火反应、以及延伸反应，因此，能够更加缩短PCR的所需时间。

(3)对于填充至容器30的液体50，选择比重比作为水溶液的反应液60小且不与反应液60混和的材料，因此反应液60在液体50中成为球状。在PCR装置100以及使用该装置的PCR方法中，由于对成为球状的反应液60进行PCR的各反应，所以与不使用液体50的现有的PCR相比，即使是少量的反应液60也能够进行PCR。换言之，能够减少构成反应液60的试剂的浪费。

(第二实施方式)

接下来，参照图10～图12对第二实施方式的PCR装置进行说明。图10是表示第二实施方式的PCR装置的概要图，图11是表示用于第二实施方式的PCR装置的容器的概要立体图，图12是表示用于第二实施方式的PCR装置的加热部的概要俯视图。以下，当对第二实施方式的PCR装置进行说明时，对与第一实施方式的PCR装置100基本相同的构成标注相同的附图标记，并省略其详细说明。

如图10所示，本实施方式的PCR装置200与第一实施方式的PCR装置100相同，具备下侧电极10、上侧电极20、处理室(省略图示)、升降机构120、移动机构130、电场产生部(省略图示)、加热部250、操作部(省略图示)、以及控制部(省略图示)。

下侧电极10能够载置包括多个容器30的容器板230。换言之，下侧电极10被针对多个容器30以电以及机械的方式共用地设置。另外，上侧电极20也被针对多个容器30以电以及机械的方式共用地设置，柱状电极部21对多个容器30的每个进行设置。

升降机构120能够使载置有容器板230的下侧电极10沿上下方向升降，调整下侧电极10与多个柱状电极部21之间的电极间距离。移动机构130使安装有上侧电极20的支承部131沿前后方向移动。

加热部250具备能够对多个容器30共用地加热的第一加热部251和第二加热部252。第一加热部251被配置于相对于容器板230接近上侧电极20(柱状电极部21)的一侧，第二加热部252被配置于相对于容器板230接近下侧电极10的一侧。

如图11所示，容器板230为例如由左右方向12个，前后方向8个，合计96个的容器30分别以等间隔配置，并通过肋部231成为一体的构造。这样的构造的容器板230例如能够列举使用聚丙烯等塑料成型的容器板。应予说明，容器板230的容器30的个数并不局限于96个。

如图12所示，加热部250的第一加热部251例如是外形为长方形的块状加热器，具有能够插入多个容器30的多个孔251a。孔251a分别沿左右方向和前后方向以等间隔设置。虽未图示，但第二加热部252也相同。例如，若使下侧电极10为平板状，与第二加热部252一体化，则能够通过第二加热部252容易地对多个容器30进行定位并将其载置在下侧电极10上。另外，也能够预先调整并设定容器板230中的肋部231的高度，也能够以通过肋部231支持第一加热部251的方式配置。换句话说，也可以为能够进行第一加热部251在上下方向上的定位的容器板230。

根据本实施方式的PCR装置200以及使用该装置的PCR方法，与现有的相比，能够以较短的所需时间同时对很多的反应液60进行PCR处理。另外，收纳于多个容器30的反应液60可以包括相同种类的靶核酸，也可以包括不同种类的靶核酸。换句话说，能够提供一种能够实现PCR处理的较高的生产性的PCR装置200以及使用该装置的PCR方法。

(第三实施方式)

其它的PCR方法

接下来，参照图13、图14A以及图14B对作为第三实施方式的其他的PCR方法进行说明。图13是表示其它的PCR方法的工序的概要图，图14A是表示其它的PCR方法中的施加至上侧电极的交流电位的波形的图，图14B是表示其它的PCR方法中的反应液的温度变化的一个例子的曲线图。

本实施方式的其它的PCR方法是能够使用上述的PCR装置100(或PCR装置200)进行的方法，特征在于使退火反应的温度和延伸反应的温度不同。

本实施方式的其它的PCR方法与上述第一实施方式相同，具备向容器30填充液体50和反应液60的填充工序(第一工序)、加热工序(第二工序)、以及将热变性工序(第四工序)、退火工序(第五工序)、以及延伸工序(第六工序)按该顺序反复进行的工序(第三工序)。从填充工序(第一工序)至退火工序(第五工序)，与上述第一实施方式相同，因此，以下对延伸工序(第六工序)进行说明。

在延伸工序(第六工序)中，如图13所示，控制部170以经过退火工序的反应液60位于容器30的第一区域H1与第二区域H2之间的第三区域H3的方式驱动控制电场产生部140，在下侧电极10与上侧电极20的柱状电极部21之间产生电场。

容器30的液体50中的第一区域H1(上方部分)的温度成为第一温度。容器30的液体50中的第二区域H2(下方部分)的温度成为比第一温度低的第二温度。容器30的液体50中的第三区域H3的温度成为比第一温度低且比第二温度高的中间的第三温度。换言之，能够在从第二温度至第一温度之间任意地设定第三区域H3的第三温度，也可以不必设置作为第三温度的第三加热部。为了更加正确地实现第三温度，也可以设置第三加热部。

在退火工序(第五工序)中，如上所述，例如对在热变性工序中得到的单链DNA61a在比第一温度低的第二温度下结合引物62。在本实施方式的其它的PCR方法中的延伸工序(第六工序)中，在第三温度下，将耐热酶64作为催化剂，并将引物62作为起始点，使用DNA合成底物63对单链DNA61a合成互补的双链DNA61。根据耐热酶64的种类，存在第三温度下的活性比第二温度下的活性优良的情况。因此，优选在比第二温度高的第三温度下进行延伸反应。

在延伸工序(第六工序)中，如图14A所示，在时间t₂～时间t₃的期间，例如将下侧电极10设为第一电位(0V)，向上侧电极20施加电位在第一电位(0V)与比第一电位(0V)高且比第二电位(6kV)低的第三电位之间变化的交流电位(例如3kV，频率为30Hz)。由此，在下侧电极10与柱状电极部21之间产生的电场与向上侧电极20赋予6kV、频率为30Hz的交流电位的情况相比变弱。即，作用于反应液60的库伦力变小，反应液60位于第二区域H2与第一区域H1之间的第三区域H3。换言之，控制部170以反应液60位于液体50的温度成为第三温度的第三区域H3(中间部分)的方式驱动控制电场产生部140，在下侧电极10与上侧电极20(柱状电极部21)之间产生电场。换句话说，与第三温度的设定(位置)相应地调整施加至上侧电极20的电位、频率即可。

由此，在延伸工序(第六工序)中，例如如图14B所示，在时间t₂～时间t₃中，能够以第一温度(例如94℃)与第二温度(例如60℃)之间的第三温度(例如72℃)维持反应液60的温度。

此外，在延伸工序(第六工序)中，进一步缩短电极间距离也可以作为控制方法之一被列举。但是，由于进行将热变性工序(第四工序)～延伸工序(第六工序)反复进行50次左右的第三工序，因此，会频繁地驱动控制升降机构120，使下侧电极10上下移动，PCR装置100的驱动控制变得繁琐。在该点上，使施加至上侧电极20的交流电位变化更能够简便地进行驱动控制。

根据使用了本实施方式的PCR装置100的其它的PCR方法，在延伸工序(第六工序)中，在耐热酶64作为催化剂适当发挥作用的第三温度下进行延伸反应，因此，能够缩短延伸反应所耗费的时间。即，能够进一步缩短PCR的所需时间地扩增靶核酸。

本发明并不局限于上述的实施方式，在不违背能够从权利要求书以及说明书整体读取的发明的主旨或思想的范围内能够适当地进行变更，伴随这样的变更的PCR装置以及使用该PCR装置的PCR方法也被包括在本发明的技术范围内。除了上述实施方式以外，也考虑各种变形例。以下，列举变形例进行说明。

(变形例一)

在上述实施方式中，对上侧电极20施加交流电位，在下侧电极10与上侧电极20之间产生电场，但并不局限于此。也可以向上侧电极20施加比下侧电极10的电位高的直流电位，在下侧电极10与上侧电极20之间产生电场。

(变形例二)

在上述第二实施方式中，针对包括多个容器30的容器板230，以在电、机械方面共用的方式构成了下侧电极10以及上侧电极20，但并不局限于此。例如，也可以采用将下侧电极10设为共用电极，对多个容器30的每个在电、机械方面独立地设置柱状电极部21的构成。据此，即使在容器30中包括种类不同的反应液60，也能够与反应液60的种类对应地调整施加至柱状电极部21的电位、下侧电极10与柱状电极部21的电极间距离，以更加高效的条件进行PCR。

(变形例三)

在上述实施方式的PCR方法中，靶核酸并不局限于双链DNA。例如，在将使单链RNA转印结合而成的双链RNA作为靶核酸扩增的情况下，也能够应用上述实施方式的PCR方法。

(变形例四)

在上述第一实施方式的PCR方法中，在退火工序以及延伸工序中，在下侧电极10与上侧电极20(柱状电极部21)之间不产生电场，在液体50中使反应液60沉下而在反应液60位于第二区域H2的状态下进行了退火反应以及延伸反应，但并不局限于此。例如，也可以将第二区域H2的位置设为从下侧电极10稍向上方偏离的位置，向上侧电极20(柱状电极部21)施加交流电位而产生电场，以通过库伦力使反应液60稍微浮起的状态进行退火工序以及延伸工序。据此，能够以使反应液60微振动并积极地进行微小搅拌的状态进行退火反应以及延伸工序。换句话说，能够缩短退火反应以及延伸反应的时间。

附图标记说明

10…下侧电极，20…上侧电极，21…柱状电极部，30…容器，50…液体，60…反应液，61…作为靶核酸的双链DNA，62…引物，63…作为核酸合成底物的DNA合成底物，64…耐热酶，100、200…聚合酶链式反应(PCR)装置，120…升降机构，151、251…第一加热部，152、252…第二加热部，230…容器板。