VvSUC27基因在促进植物摄取外界蔗糖中的应用的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及VvSUC27基因在促进植物摄取外界蔗糖中的应用。

背景技术：

在高等植物中，首先由成熟的叶片通过光合作用合成有机物质，并以碳水化合物的形式运送至各个组织或器官中，从而为植物的生长发育提供能量。其中，碳水化合物主要是以蔗糖的形式完成长距离的转运。蔗糖进入和载出韧皮部筛管分子有两种主要的途径：一、共质体途径：蔗糖由叶肉细胞合成后直接通过胞间连丝装载入韧皮部进行运输，然后在库端卸载进入库端组织或器官细胞中贮存或代谢，在此过程当中蔗糖无需作跨膜运动；二、质外体途径：蔗糖是由主动跨膜装载从源端进入韧皮部进行运输，然后在库端跨膜卸载从而进入库端组织或器官。在此途径中，蔗糖需要进行跨膜转运，这就需要膜上特异的载体(蔗糖转运蛋白)介导和能量驱动。因此蔗糖转运蛋白在植物体内蔗糖转运过程中起着极为重要的作用。

而在葡萄中发现了3种蔗糖转运蛋白基因：VvSUC11、VvSUC12和VvSUC27，这三个基因均通过转化酵母后表达的蛋白质对蔗糖转运功能验证。Northern试验发现，这三个基因在不同组织中的表达情况是不一样的，VvSUC11，VvSUC12在根和卷须中的表达十分微弱，而VvSUC27根和卷须中表达明显。由此可推断VvSUC27主要在库组织中表达，参与韧皮部的卸载，与长距离运输过程中的蔗糖回收。然而，对于VvSUC27的功能并没有系统性的报导过，并且其基于过表达对于植物中的影响也不明确。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供VvSUC27基因在促进植物摄取外界蔗糖中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明通过研究首次发现，在植物中转入VvSUC27基因并对其进行过表达，可使植物由根部吸收大量外源蔗糖，提高了根中乃至整个植株糖类物质的，促进了植物各器官的生长分化过程。含量。

因此，本发明提供了VvSUC27基因(GenBank登录号：AF021810)在促进植物摄取外界蔗糖中的应用。具体为，将VvSUC27基因利用转基因技术克隆到植物中，利用VvSUC27基因在植物中的过表达，促进植物从外界摄取蔗糖。

本发明还提供了VvSUC27基因在促进植物生长中的应用。具体为，将VvSUC27基因利用转基因技术克隆到植物中，利用VvSUC27基因在植物中的过表达，促进植物的生长。

所述应用在促进植物根部糖分积累及其在弱光环境或无光环境中生长方面，优势格外明显。

进一步地，所述植物可为花卉，使得花卉即使在无光下也能快速生长，从而使花卉易于培养，还有利于节约光能减少能源的浪费；所述植物还可为含有肉质根或块根的植物，如萝卜、红薯、马铃薯、甜菜等，使得其根部即可食用部分，可以快速粗壮生长，含糖量增加；所述植物还可为一般农作物，使其在单位时间里，植株快速生长，提高农作物产量，同时减少对光能的依赖型，易于存活。

在本发明的具体实施方式中，以烟草为例进行转基因植物的构建。烟草属管状花目，茄科一年生或有限多年生草本植物，同时烟草作为一种模式植物，具有结构简单，生长周期短等优点，是良好的转基因材料。

该转基因烟草中导入了葡萄蔗糖转运蛋白VvSUC27基因，使其在烟草体内过表达，该转基因烟草的生长速率要显著性高于野生型烟草。

为方便理解，下面将对转基因烟草的获得方式进行详细描述。

本发明通过将葡萄蔗糖转运蛋白VvSUC27基因导入三生烟中(Nicotiana tobacum cv.Samsun NN)，经筛选得到阳性转基因烟草，观察其在含蔗糖培养基中的表型，最终获得了可以快速生长且能在黑暗中存活的转基因烟草。

具体构建步骤如下：

A.VvSUC27基因全长cDNA的克隆

A-1、葡萄cDNA的获取：提取赤霞株葡萄果实的总RNA，以2μg总RNA为模板，采用M-MuLV逆转录酶以Oligo dT引物进行逆转录获得cDNA；

A-2、根据NCBI上搜索到黑比诺葡萄VvSUC27基因CDs序列设计引物，正向引物：GGA GTT AGC CAA GCC TTC TTC A；反向引物：TTA AGA CGA CGG CTG AGT CCT C，以反转录合成的cDNA为模板，采用DNA聚合酶LA Taq进行PCR扩增，得到VvSUC27基因的编码区；取10μL RCR产物，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测；将切胶回收的1.5kb DNA片段连接到pGEM-T Easy Vector上，转化大肠杆菌Top10菌株，大提质粒后测序，测序比对结果如图1所示，可见扩增得到的赤霞株VvSUC27与黑比诺VvSUC27在基因末端出现了4个碱基差异，一个氨基酸残基差异(图2)。为了验证这几个突变不是PCR或者测序或者其他试验误差导致，已先后在葡萄不同组织中，以及相同组织，不同样品中重新提取RNA并反转录并且克隆测序了相应的突变部分，发现所采集的葡萄样品的VvSUC27基因的确存在着这4个碱基的差别。所以可推断这是不同葡萄种属上的差别，应该一样具有完整蛋白的结构和功能。

B.过表达载体的构建

B-1、通过在引物上加入酶切位点BamH I和Sac I，扩增得到含有酶切位点，约1.5kb的VvSUC27片断；

B-2、用限制性内切酶BamH I和Sac I分别双酶切高效表达载体PBI121；

B-3、将酶切后的VvSUC27基因片段连接到pBI121载体上，并将其及pBI121空载体分别转化进入农杆菌EHA105中，在2-3天后，在培养皿上挑取克隆划线培养后，进行菌体PCR后，挑选出阳性克隆。

C.转基因烟草的获得

分别用含有基因的表达载体(pBI121-VvSUC27)及pBI121空载体的农杆菌EHA105通过叶盘法转化烟草。转化后在含有Kan 100mg/L的生芽培养基上筛选，2周后即可见经过农杆菌浸染的烟草叶片切口面膨大，且陆续有小芽分化生长出来，没有经过浸染的对照组叶片切口虽然也有点变大，但无抗性芽，一个月后，经过农杆菌浸染的烟草分化生长出来的小芽已经有3cm长，而没有经过浸染的对照组叶片全部变黄。约一个半月后，陆续将小抗性芽用锋利刀片切下，插入生根筛选培养基中。2周后可见生根，继续培养2-4周后待烟草苗长到7cm高左右，打开组培瓶口，向瓶内加入少量的水，锻炼2，3天后，琼脂经浸泡后较容易与植物根系分离，将其移栽至蛭石与营养土(1：3)的花盆中，用透明塑料袋罩住以防止水分蒸发。待植物移栽成活后，从花盆中连土一并取出，移入温室。

D.转基因烟草的阳性检测

D-1、提取转基因烟草的DNA及RNA，

D-2、转基因烟草的PCR检测：以DNA为模板，用一对位于VvSUC27基因内部的引物，扩增片断位置在VvSUC27基因460-990bp处，大小为530bp，选出能扩出对应大小基因的植株做以下Southern检测。

D-3、转基因烟草的Southern检测：转基因烟草的基因组DNA都可以被BamH I+Sac I双酶切而切下1.5kb的VvSUC27基因下来，因此在做Southern杂交的时候，会在1.5kb处得到杂交带。通过验证酶切是否含有1.5kb的酶切条带，来判断是否为转基因阳性苗。

第二方面，本发明提供一种促进植物摄取外界蔗糖的方法，将携带VvSUC27基因CDS序列的过表达载体，通过农杆菌介导转化到目的植物中，利用VvSUC27基因在植物中的过表达，促进植物摄取外界蔗糖。

作为优选，所述过表达载体为含有VvSUC27基因CDS序列的表达载体PBI121。该载体具有CaMV35S组成型强启动子，无组织特异性，能更好的实现VvSUC27基因的过表达。

进一步地，由于上述方法促进了植物从外界摄取蔗糖，而蔗糖可以做为信号分子影响内源基因的表达，进而更快的利用根部摄取的蔗糖来完成植物其他器官的分化生长。因此，上述方法进一步也促进了植物的生长。

第三方面，本发明提供了一种含有VvSUC27基因CDS序列的过表达载体，所述过表达载体的构建方法为：

1)提取葡萄果实的总RNA，逆转录获得cDNA；

2)以所述cDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增，获得扩增片段；所述特异性引物如SEQ ID NO.1～2所示；

3)将所述扩增片段连接到表达载体PBI121中，即得。

本发明的有益效果在于：

本发明通过过表达VvSUC27基因，促进了植物摄取外界蔗糖，尤其促进了根部含糖量的增加，同时可使转基因植物出现快速生长的表型，并且可以在微光甚至使无光下快速生长，证实了该基因的一个新的功能应用。

本基因的克隆和转基因的应用，有望应用于肉质根或块根植物的培育中，促进其可食用根部糖分的积累，并可以使其快速粗壮生长；还有望应用于花卉等植物的培育中，使得花卉等植物即使在无光下也能快速生长，从而使花卉易于培养，还有利于节约光能减少能源的浪费。

附图说明

图1为本发明实施例1步骤1中核酸序列比对结果。

图2为本发明实施例1步骤1中氨基酸序列比对结果。

图3为本发明实施例1步骤4中转基因烟草(T₀)的PCR检测。

图4为本发明实施例1步骤4中转基因烟草(T₀)的Southern检测。

图5为本发明实施例1步骤4中转基因烟草(T₂)的实时荧光定量PCR验证结果。

图6为本发明实施例1步骤5中转基因烟草(T₂)生长高度变化。

图7为本发明实施例1步骤5中转基因烟草(T₂)第7周表型比较。

图8为本发明实施例2步骤1中转基因烟草(T₂)在微光下培养30天的各表型对比图。

图9为本发明实施例2步骤1中转基因烟草(T₂)在微光下培养30天的表型对比图。

图10为本发明实施例2步骤1中转基因烟草(T₂)在黑暗下培养30天的各表型对比图。

图11为本发明实施例2步骤1中转基因烟草(T₂)在黑暗下培养30天的表型对比图。

图12为本发明实施例3步骤1中烟草叶片的C¹⁴吸收试验结果

图13为本发明实施例3步骤2中转基因烟草(T₂)叶片、茎和根中可溶性糖含量的测定。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明中培养基及所用到的试剂为常规市售产品，具体配方如下：

菌体培养基：

LB培养液：1000mL：10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，双蒸水溶解后，用NaOH溶液调节pH至7.0，加水定容到1L，121℃高压蒸汽灭菌20min

LB固体培养基：在LB培养液中加入15g/L琼脂，121℃高压蒸汽灭菌20min，若配含有氨苄青霉素(Amp)的LB培养基，则每100mL中加入10mg氨苄青霉素，加入时培养基温度应低于60℃。

RNA提取试剂：

氯仿：异戊醇(49：1)：98mL氯仿中加入2mL异戊醇

10M LiCl溶液：称取60.41g LiCl，用双蒸水定容至100mL，再加入0.1mL DEPC，37℃温箱中过夜保存，高压灭菌。

DEPC水：双蒸水100mL中加入0.1mL DEPC，37℃温箱中过夜保存，高压灭菌。

70％乙醇(提RNA用)：70mL无水乙醇和30mL DEPC水混合

50×TAE溶液(1000mL)：Tris 242g、冰醋酸57.1mL、EDTA(0.5M，pH 8.0)100mL

5M EDTA：18.61g EDTA·12H₂O溶于80mL双蒸水，用1M的NAOH调pH值至8.0，待完全溶解后，定容至100mL，121℃下高压灭菌30min。

CTAB提取缓冲液(+CTAB)：50mM Tris-Cl(pH 8.0)；0.7mM NaCl；10mM EDTA(pH 8.0)；2％CTAB；40mM巯基乙醇(临用前加)

Southern杂交用试剂：

20×SSC：用800mL水溶解175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠，用几滴14M HCl调节pH至7.0，用水定容至1L，分装后高压灭菌。该试剂的终浓度为3M NaCl和0.3M柠檬酸钠。

变性液：0.5M NaOH，1.5M NaCl

中和液：0.5M Tris-HCl，pH 7.5，1.5M NaCl

Maleic Acid Buffer：0.1M马来酸，0.15M NaCl；利用NaOH调节pH质pH 7.5

Washing buffer：0.1M Maleic acid，0.15M NaCl；pH 7.5，0.3％(v/v)Tween 20

Detection Buffer：0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 9.5

激素的配制：

NAA(1mg/mL)：用少量95％的乙醇溶解，无菌水定容或0.1M NaOH溶液配制。

6-BA(1mg/mL)：用0.1M HCl配制。

IAA(0.5mg/mL)：用少量95％乙醇溶解，无菌水定容。

GA3(0.5mg/mL)：用95％乙醇溶解，-20℃保存。

烟草转化基本培养基：

T1：MS基本成分+蔗糖20g/L，pH 5.8

T2：T1+6-BA(2mg/L)+NAA(0.1mg/L)+Carb(500mg/L)

T3：T2+Hyg(20mg/L)

T4：T1+NAA(0.1mg/L)+Carb(500mg/L)+Hyg(20mg/L)

Preincubation media：

甘露醇175mM，CaCl₂ 0.5mM，K₂SO₄ 0.5mM，MES 20mM，pH 5.8，198mOsmol

消化液：

高氯酸：65％[w/w]，100μL；过氧化氢：33％[w/w]，200μL

统计学分析：

应用OriginPro 9.0软件分析所有数据，计算标准偏差并制图。应用SPSS 10.0软件(SPSS INC.，Chicago，MSA)对所有数据进行方差分析(ANOVA)，利用邓肯多重比较法对数据进行差异显著分析。0.01≤P<0.05差异显著(*)，P<0.01表示差异极显著(**)。

实施例1

1.VvSUC27基因全长cDNA的克隆

葡萄cDNA的获取：提取赤霞株葡萄果实的总RNA，以2μg总RNA为模板，采用M-MuLV逆转录酶以OligodT引物进行逆转录获得cDNA；根据NCBI上搜索到黑比诺葡萄VvSUC27基因CDs序列设计引物，正向引物：GGA GTT AGC CAA GCC TTC TTC A；反向引物：TTA AGA CGA CGG CTG AGT CCT C，以反转录合成的cDNA为模板，采用DNA聚合酶LA Taq进行PCR扩增，得到VvSUC27基因的编码区；取10μL RCR产物，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测；将切胶回收的1.5kb DNA片段连接到pGEM-T Easy Vector上，转化大肠杆菌Top10菌株，大提质粒后测序，测序比对结果如图1所示，可见扩增得到的赤霞株VvSUC27与黑比诺VvSUC27在基因末端出现了4个碱基差异，一个氨基酸残基差异(图2)。为了验证这几个突变不是PCR或者测序或者其他试验误差导致，已先后在葡萄不同组织中，以及相同组织，不同样品中重新提取RNA并反转录并且克隆测序了相应的突变部分，发现所采集的葡萄样品的VvSUC27基因的确存在着这4个碱基的差别。所以可推断这是不同葡萄种属上的差别，应该一样具有完整蛋白的结构和功能。

2.过表达载体的构建

通过在引物上加入酶切位点BamH I和Sac I，扩增得到含有酶切位点，约1.5kb的VvSUC27片断；用限制性内切酶BamH I和Sac I分别双酶切高效表达载体PBI121；将酶切后的VvSUC27基因片段连接到pBI121载体上，并将其及pBI121空载体分别转化进入农杆菌EHA105中，在2-3天后，在培养皿上挑取克隆划线培养后，进行菌体PCR后，挑选出阳性克隆。

3.转基因烟草的获得

分别用含有基因的表达载体(pBI121-VvSUC27)及pBI121空载体的农杆菌EHA105通过叶盘法转化烟草。转化后在含有Kan 100mg/L的生芽培养基上筛选，2周后即可见经过农杆菌浸染的烟草叶片切口面膨大，且陆续有小芽分化生长出来，没有经过浸染的对照组叶片切口虽然也有点变大，但无抗性芽，一个月后，经过农杆菌浸染的烟草分化生长出来的小芽已经有3cm长，而没有经过浸染的对照组叶片全部变黄。约一个半月后，陆续将小抗性芽用锋利刀片切下，插入生根筛选培养基中。2周后可见生根，继续培养2-4周后待烟草苗长到7cm高左右，打开组培瓶口，向瓶内加入少量的水，锻炼2，3天后，琼脂经浸泡后较容易与植物根系分离，将其移栽至蛭石与营养土(1：3)的花盆中，用透明塑料袋罩住以防止水分蒸发。待植物移栽成活后，从花盆中连土一并取出，移入温室。

4.转基因烟草的阳性检测

提取转基因烟草的DNA及RNA，转基因烟草(T₀)的PCR检测(图3)：以DNA为模板，用一对位于VvSUC27基因内部的引物，扩增片断位置在VvSUC27基因460-990bp处，大小为530bp，选出能扩出对应大小基因的植株做以下Southern检测。转基因烟草(T₀)的Southern检测(图4)：转基因烟草的基因组DNA都可以被BamH I+Sac I双酶切而切下1.5kb的VvSUC27基因下来，因此在做Southern杂交的时候，会在1.5kb处得到杂交带。通过验证酶切是否含有1.5kb的酶切条带，来判断是否为转基因阳性苗。在得到转基因阳性苗后，进行自交繁种，每代都进行实时荧光定量PCR追踪检测，确保目的基因的稳定遗传，得到T₂代纯合子转基因株系。T₂代纯合子转基因株系实时荧光定量PCR验证结果如图5所示。

5.转基因烟草(T₂)的正常条件下的表型观察

转VvSUC27基因的T₂代纯合子烟草在含有蔗糖的培养基MS上播种从第2周开始，出现了明显的快速生长的表型(图6)。由于T₂代转基因烟草是播种在含有蔗糖的培养基上的，烟草发根生长后，由于有蔗糖的饲喂，会生长的比较快。烟草种子在发芽，生根，长出两片子叶的过程中(约一个星期)，转VvSUC27基因的烟草与阴性烟草相比没有什么明显区别，可在接下来的生长中，转VvSUC27基因的烟草在表型上发生了极大的变化。在生长2-3周后，转VvSUC27基因的烟草生长迅速，7周后，高度要比阴性高2-3倍左右(图7)。

实施例2

1.转基因烟草(T₂)在微光下的表型观察

转VvSUC27基因的T₂代纯合子烟草在含有蔗糖的培养基MS上播种后，在正常光照下培养30天后，关闭组培架上的灯，使其置于微光下生长，并以野生型烟草为对照，微光培养30天后记录表型变化(图8-9)。由图可以看出，转基因烟草在微光下培养30天后，除了叶片数目外，根数、茎长、茎粗叶面积均显著性高于野生型的植株，而叶片数目上转基因烟草的叶片数目也稍大于野生型植株的叶片数目(图8)。同时可以观察到野生型烟草的叶片颜色较转基因型烟草叶片颜色较黄(图9)。

2.转基因烟草(T₂)在黑暗下的表型观察

转VvSUC27基因的T₂代纯合子烟草在含有蔗糖的培养基MS上播种后，在正常光照下培养30天后，置于黑暗中培养30天后记录表型变化(图8-9)。由图可以看出，转基因烟草在黑暗中培养30天后，除了叶片数目外，根数、茎长、茎粗叶面积均显著性高于野生型的植株，而叶片数目上转基因烟草的叶片数目也稍大于野生型植株的叶片数目(图10)。叶片颜色上，转基因型烟草叶片颜色较绿，叶片呈绿色的数目较多(图11)。

综上可以看出转VvSUC27基因的烟草，不仅在正常光照下可以快速生长，在微光甚至是黑暗下较野生型烟草也可以较快较好的生长，VvSUC27基因促进了烟草的生长。

实施例3

1.C¹⁴蔗糖吸收试验

转VvSUC27基因的T₂代纯合子烟草在无糖培养基上培养到6-8周左右，摘取新鲜烟草叶片，用打孔器将烟草叶片打为0.26cm²大小的圆形；将叶片浸泡入Preincubation media中孵育30min；取出叶片，转移到含有1mM sucrose和0.1MBq mL–1sucrose-[¹⁴C](Amersham Pharmacia Biotech,Buckinghamshire,UK)、其他成分同Preincubation media溶液，室温温和振荡；分别于一定时间取叶片，放入Preincubation media中洗3min，重复此步骤3次；将叶片放入消化液(高氯酸：65％[w/w]，100μL和过氧化氢：33％[w/w]，200μL)于55℃消化16h；通过液闪计数仪器(Packard Tricarb 1900TR,Packard instruments,Rungis,France)计数同位素放射强度。结果表明(图12)转正义VvSUC27基因的烟草叶片吸收体外蔗糖的能力很明显要高于阴性烟草。在1h时，转正义VvSUC27基因的烟草叶片吸收体外蔗糖的量大约为阴性烟草的2倍左右。这说明VvSUC27基因所表达的蛋白的确具有转运蔗糖的能力，VvSUC27基因的确为编码蔗糖转运蛋白的基因。

2.转基因烟草中可溶性糖的测定

剪取刚刚成熟的新鲜的植物叶片(或-80℃冰箱中冻存的样品)放在105℃烘箱15min杀死；在75℃的烘箱中烘干过夜至衡重；在研钵中磨碎，准确称取25mg于7mL离心管中；加入1.5mL 80％乙醇，在80℃水浴中提取半个小时，离心取上清；共提取3次，合并上清；加入少许(约0.1g)活性炭脱色，离心，并定容至5mL,称之为提取液。吸取500μL提取液于1.5mL离心管中，在沸水浴中加热浓缩至100μL以下(注意不要蒸干，也不要大于100μL)。称之为浓缩液。

在7mL离心管中加入3mL蒽酮试剂，再将1.5mL离心管中的浓缩液加入，室温下放置2h(25℃)；在620nm下测定吸光度值，来计算果糖的含量。结果表明，在转基因烟草的根部，果糖的含量要远远高于野生型烟草，茎中的果糖含量也显著性高于野生型烟草，叶片中的果糖含量与野生型烟草持平(图13a)。

加入100μL 30％的KOH，在沸水浴中放10min，冷却至室温；在7mL离心管中加入3mL蒽酮试剂，再将1.5mL离心管中的浓缩液加入，40℃水浴10～15min；在620nm下测定吸光度值，来计算蔗糖含量。结果表明，在转基因烟草的根部和茎中，蔗糖的含量要显著性高于野生型烟草，叶片中的蔗糖含量略低于野生型烟草(图13b)。

在7mL离心管中加入3mL蒽酮试剂，再将1.5mL离心管中的浓缩液加入，90℃加热15min，流水冷却至室温；在620nm下测定吸光度值，从而计算出总糖的含量。结果表明，可溶性总糖达到野生型烟草的2倍左右，茎中总糖含量也偏高，可是不如根中明显，而叶片中，可溶性总糖含量总体趋势略低于野生型烟草的可溶性总糖含量(图13c)。

综述所述，VvSUC27基因的导入，促进了植株根中糖分的积累，使得植物根部糖含量增加。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。