本发明涉及华法林-4-o-乙酰-gprp,涉及它的制备方法，涉及它的抗静脉血栓活性，涉及它的抗动脉血栓活性，涉及它降低体内凝血因子ⅸ的含量的作用。因而本发明涉及它在制备抗静脉血栓药物中的应用、在制备抗动脉血栓药物中的应用和在制备凝血因子ⅸ拮抗剂中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术：
动脉血栓和静脉血栓两种病症已成为当下发病率高和死亡率高的疾病。其中静脉血栓症主要包括深静脉血栓和肺栓塞。深静脉血栓和肺栓塞发病的患者数超过了心肌梗塞和中风发病的总人数，而且比乳腺癌和艾滋病所引起死亡的总人数高。由于动脉血栓症和静脉血栓症的发病率随年龄增长呈指数态增加，所以两种病症对我国这样的老龄化国家的人民健康的威胁尤其严重。如果把人口基数考虑进去，对我国国计民生的绝对负面影响尤其严重。于是，动脉血栓症与静脉血栓症的预防及治疗一直是医药领域所关注的重点。虽然华法林作为代表药物于1941年被用于临床实践，由于华法林的窗口窄，其剂量不足会有导致肺栓塞的可能，而剂量过量有导致致命性出血的风险。过去的50多年对华法林进行了大量结构改造，却都没有能够得到抗静脉血栓活性强的类似物。与传统的思维不同，发明人修饰华法林结构的目标是，将华法林转化为具有抗动脉血栓和抗静脉血栓双重活性的类似物。不过，也一直未能如愿。之后，又经过5年探索，发明人发现华法林的4位用乙酰gprp四肽修饰，生成的华法林-4-o-乙酰-gprp在体内抗动静脉血栓模型上显示优秀的活性。显然，该化合物不是华法林的前药。华法林-4-o-乙酰-gprp的抗静脉血栓活性比华法林强4.87倍，抗动脉血栓活性比阿司匹林强240倍，除此之外，华法林-4-o-乙酰-gprp不存在类似华法林的出血风险。可见，本发明具有显著的技术进步。于是，发明人提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一个内容是提供华法林-4-o-乙酰-gprp。
本发明的第二个内容是提供华法林-4-o-乙酰-gprp的制备方法，该方法包括：
1)合成华法林-4-o-乙酸苄酯；
2)合成华法林-4-o-乙酸；
3)采用二环己基碳二亚胺(dcc)为缩合剂，1-羟基苯并三唑(hobt)为催化剂的液相缩合的方法，合成hcl·gly-pro-arg(no2)-pro-obzl；
4)采用dcc为缩合剂，hobt为催化剂的液相缩合的方法，华法林-4-o-乙酸与hcl·gly-pro-arg(no2)-pro-obzl缩合；
5)合成华法林-4-o-乙酰-gprp。
本发明的第三个内容是评价华法林-4-o-乙酰-gprp抗静脉血栓的作用。
本发明的第四个内容是评价华法林-4-o-乙酰-gprp抗动脉血栓的作用。
本发明的第五个内容是评价华法林-4-o-乙酰-gprp降低体内凝血因子ⅸ含量的作用。
附图说明
图1.华法林-4-o-乙酰-gprp四肽的合成路线.(i)溴-2-乙酸苄酯,丙酮,k2co3,45℃；(ii)ch3oh,pd/c,h2；(iii)dcc,hobt,nmm,thf；(iv)4n氯化氢的乙酸乙酯溶液；(v)三氟乙酸，三氟甲磺酸。
图2华法林-4-o-乙酰-gprp抗静脉血栓活性，n＝6；
图3华法林-4-o-乙酰-gprp抗动脉血栓活性评价结果，n＝8；
图4华法林-4-o-乙酰-gprp对体内fⅸ含量的影响，n＝3；
图5华法林-4-o-乙酰-gprp对大鼠鼠尾出血时间的影响，n＝10。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备华法林-4-o-乙酸苄酯
将6.62g(20.00mmol)华法林置于250ml茄瓶中，加入约70ml丙酮，未能将其完全溶解，45℃油浴加热搅拌至华法林溶解，加入3.50ml(22.00mmol)溴乙酸苄酯，继续于45℃油浴下进行反应。反应72h后，薄层层析(tlc，石油醚/乙酸乙酯＝2:1)监测反应进程，华法林已基本消失，将反应产生的无色固体过滤除去，滤液减压蒸除去丙酮，得到淡黄色油状物，使用硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝8:1)，得到5.4g(59％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):457[m+h]+；1h-nmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝7.89(dd,j1＝3.0hz,j2＝9.0hz,1h),7.63(dt,j1＝3.0hz,j2＝9.0hz,1h),7.43～7.31(m,9h),7.24(t,j＝9.0hz,2h),7.15(tt,j＝9.0hz,1h),5.26(s,2h),5.61(s,1h),5.02(d,j＝15.0hz,1h),4.85(d,j＝15.0hz,1h),4.97(t,j＝9.0hz,1h),3.45(dq,j1＝9.0hz,j2＝18.0hz,2h),2.11(s,3h)。
实施例2制备华法林-4-o-乙酸
将4.01g(8.79mmol)华法林-4-o-乙酸苄酯溶于50ml甲醇中，加入405mgpd/c，搅拌下于水泵中抽去空气，通入氢气，如此操作重复进行4次，通入氢气室温下搅拌30h。tlc监测反应完全，过滤除去钯碳(pd/c)，滤液减压蒸去溶剂，得到2.74g(85.2％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):367[m+h]+；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝12.86(s,1h),7.90(d,j＝6.0hz,1h),7.63(t,j＝6.0hz,1h),7.43～7.34(m,4h),7.27(t,j＝9.0hz,2h),7.17(t,j＝9.0hz,1h),4.99(t,j＝9.0hz,1h),4.75(q,j1＝15.0hz,j2＝30.0hz,2h),3.54～3.47(m,2h),2.14(s,3h)。
实施例3制备boc-r(no2)-p-obzl
将3.509g(11.00mmol)boc-r(no2)-oh加入到250ml茄瓶中，用80ml干燥四氢呋喃将其溶解，于冰浴(0℃)下加入1.485g(11.00mmol)hobt,搅拌10分钟后，加入2.632g(12.19mmol)dcc，活化30min。反应液中有无色固体析出。将2.516g(10.41mmol)hcl·pro-obzl于冰浴下加入反应液中，用n-甲基吗啉调节ph值到9，在室温下搅拌反应12h后tlc(二氯甲烷/甲醇＝20:1)监测反应进程，原料点消失，滤除反应液中的无色固体，将滤液减压蒸去溶剂，残留物用100ml乙酸乙酯溶解，滤去不溶物，滤液分别用饱和nahco3溶液(30ml×3)，饱和nacl溶液(30ml×3)，5％khso4溶液(30ml×3)，饱和nacl溶液(30ml×3)，饱和nahco3溶液(30ml×3)，饱和nacl溶液(30ml×3)洗涤，得到的乙酸乙酯相用无水硫酸钠进行干燥12h以上。滤去硫酸钠，滤液减压除去溶剂，得到黄色油状物，将此油状物进行硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝80:1)，得到无色固体产品4.05g(80.2％)。esi-ms(m/e):507[m+h]+；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝7.33(m,5h),6.98(d,j＝7.8hz,1h),5.10(s,2h),4.40(m,1h),4.37(s,1h),3.92(m,1h),3.62(m,1h),3.10(s,2h),2.21(m,1h),1.94(t,j＝6.3hz,2h),1.88(m,1h),1.56～1.45(m,4h),1.37(s,9h)。
实施例4制备hcl·arg(no2)-pro-obzl
称取1.80g(3.56mmol)boc-arg(no2)-pro-obzl加入到100ml茄瓶中，加入15ml干燥乙酸乙酯，使其完全溶解，于冰盐浴下加入30ml4n氯化氢的乙酸乙酯溶液，继续在冰浴下搅拌反应。tlc(二氯甲烷/甲醇＝20:1)显示原料点消失后，用水泵将反应液减压浓缩，将残留物用干燥乙酸乙酯复溶后再减压浓缩，反复3次，得到无色固体，用无水乙醚浸润后再减压浓缩，反复3次，得到无色固体产物1.53g(97％)。
实施例5制备boc-gly-pro-obzl
将3.862g(22.05mmol)boc-gly加入到250ml茄瓶中，加入90ml干燥四氢呋喃，在搅拌下将其完全溶解，于冰浴(0℃)下加入2.971g(22.00mmol)hobt及5.384g(24.92mmol)dcc，冰浴下搅拌活化30min。可观察到有无色固体析出。将4.833g(20.00mmol)hcl·pro-obzl于冰浴下加入反应液中，用n-甲基吗啉调节反应液ph值到9，在室温下搅拌反应17h后tlc(二氯甲烷/甲醇＝20:1)监测反应进程，原料点消失，滤除反应液中的不溶物，将滤液减压蒸去溶剂，残留物用100ml乙酸乙酯溶解，滤去不溶的无色固体，滤液分别用饱和nahco3溶液(40ml×3)，饱和nacl溶液(40ml×3)，5％khso4溶液(40ml×3)，饱和nacl溶液(40ml×3)，饱和nahco3溶液(40ml×3)，饱和nacl溶液(40ml×3)洗涤，得到的乙酸乙酯相用无水硫酸钠进行干燥2h以上。滤去硫酸钠，滤液减压蒸去溶剂，得到淡黄色固体，将此固体进行硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝3:1)，得到无色固体产物7.02g(96.7％)。esi-ms(m/e):363[m+h]+。
实施例6制备boc-gly-pro
称取4.774g(13.18mmol)boc-gly-pro-obzl于250ml茄瓶中，加入50ml甲醇将其溶解，加入1.0gpd/c，搅拌下于水泵中抽去空气，通入氢气，如此操作重复进行3次，通入氢气室温下搅拌反应约48h。tlc(二氯甲烷/甲醇＝20:1)监测反应进程，原料点消失，将pd/c过滤除去，滤液减压蒸去溶剂，得到无色固体3.411g(95.1％)。esi-ms(m/e):273[m+h]+；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝6.83(t,j＝6.0hz,1h),4.22(dd,j1＝3.0hz,j2＝9.0hz,1h),3.80(dd,j1＝5.7hz,j2＝17.1hz,1h),3.67(dd,j1＝5.7hz,j2＝16.8hz,1h),3.48(m,1h),3.38(m,1h),2.10(m,1h),1.91(m,1h),1.83(m,1h),1.38(s,9h)。
实施例7制备boc-gly-pro-arg(no2)-pro-obzl
将1.755g(6.45mmol)boc-gly-pro加入到250ml茄瓶中，用80ml干燥四氢呋喃将其溶解，于冰浴(0℃)下加入0.8619g(6.38mmol)hobt，搅拌5min后，加入1.5045g(6.96mmol)dcc，活化30min。待有无色固体析出后，将2.566g(5.80mmol)hcl·arg(no2)-pro-obzl于冰浴下加入反应液中，用nmm调节ph值到9，在室温下搅拌反应10h后tlc(二氯甲烷/甲醇＝20:1)监测反应进程，原料点消失，滤除无色固体，将滤液减压蒸去溶剂，残留物用乙酸乙酯溶解，滤去不溶物，滤液分别用饱和nahco3溶液(30ml×3)，饱和nacl溶液(30ml×3)洗涤，5％khso4溶液(30ml×3)，饱和nacl溶液(30ml×3)，饱和nahco3溶液(30ml×3)，饱和nacl溶液(30ml×3)，乙酸乙酯相用无水硫酸钠进行干燥10h以上。滤除硫酸钠，滤液减压蒸去溶剂，得到淡黄色油状物，将此油状物进行硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝50:1)，得到无色固体产品2.31g(60.3％)。esi-ms(m/e):662[m+h]+；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝8.49(s,1h),8.19(d,j＝7.5hz,1h),7.35(m,5h),6.79(s,1h),5.10(t,j＝12.9hz,1h),4.45～4.42(m,2h),4.37(dd,j1＝4.5hz,j2＝8.1hz,1h),3.83～3.66(m,2h),3.6～3.37(m,4h),3.11(s,2h),2.21(m,1h),1.94(t,j＝6.3hz,2h),1.88(m,1h),1.56～1.45(m,4h),1.37(s,9h)。
实施例8制备hcl·gly-pro-arg(no2)-pro-obzl
称取0.908g(1.38mmol)boc-gly-pro-arg(no2)-pro-obzl于100ml茄瓶中，加入5ml干燥乙酸乙酯，使其完全溶解，于冰盐浴下加入15ml4n氯化氢的乙酸乙酯溶液，继续在冰浴下搅拌反应。tlc(二氯甲烷/甲醇＝15:1)检测反应进程，原料点消失，用水泵将反应液减压浓缩，将残留物用干燥乙酸乙酯复溶后再减压浓缩，反复3次，得无色固体，继续用无水乙醚浸润后再减压浓缩，反复3次，得无色固体产物0.81g(99％)。
实施例9制备华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-obzl
将0.5875g(1.61mmol)华法林-4-o-乙酸加入到100ml茄瓶中，用40ml干燥四氢呋喃将其溶解，于冰浴(0℃)下加入0.2170g(1.61mmol)hobt及0.3790g(1.75mmol)dcc，活化30min。有无色固体析出。将0.870g(1.46mmol)hcl·gly-pro-arg(no2)-pro-obzl于冰浴下加入反应液中，用n-甲基吗啉调节ph值为9，在室温下搅拌反应12h后tlc(二氯甲烷/甲醇＝20:1)监测反应进程，原料点消失，滤除无色固体，将滤液减压蒸去溶剂，残留物用40ml乙酸乙酯溶解，滤去不溶的无色固体，滤液分别用饱和nahco3溶液(30ml×3)，饱和nacl溶液(30ml×3)，5％khso4溶液(30ml×3)，饱和nacl溶液(30ml×3)，饱和nahco3溶液(30ml×3)，饱和nacl溶液(30ml×3)洗涤，乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥5h以上。滤去硫酸钠，滤液减压蒸去溶剂，得到黄色油状物，将黄色油状物进行硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝40:1)，得到无色固体0.909g(68.6％)。esi-ms(m/e):909[m+h]+；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝8.51～8.43(m,2h),8.22(d,j＝7.5hz,1h),7.90(d,j＝7.8hz,1h),7.63(t,j＝7.5hz,1h),7.35(m,12h),5.10(s,2h),4.90(t,j＝7.2hz,1h),4.58(s,2h),4.52～4.34(m,3h),4.06(m,2h),3.67～3.42(m,4h),3.47(d,j＝7.5hz,2h),3.15(s,2h),2.20(m,1h),2.14(s,3h),1.97(m,1h),1.90(t,j＝6.3hz,2h),1.86～1.70(m,4h),1.70～1.53(m,4h)。
实施例10制备华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg-pro
将0.385g(0.42mmol)华法林-4-o-乙酰-gly-pro-arg(no2)-pro-obzl加入到100ml茄瓶中，在冰盐浴下用4.5ml三氟乙酸将其溶解，而后加入1.5ml三氟甲磺酸，保持干燥条件，冰盐浴下搅拌反应1h，tlc(乙酸乙酯/水/冰醋酸＝2:1:1)监测反应进程，原料点消失，冰浴下用水泵抽除茄瓶中的酸气，而后于冰浴下加入预先冷藏保存的无水乙醚50ml，有橙色固体析出，冰浴下搅拌10min后将溶液静置，倾倒上清液，如此重复4次，而后将残留物用水泵抽除剩余的乙醚，得到橙黄色固体，将该橙黄色固体使用2ml蒸馏水溶解，冰浴下使用10％氨水调节ph为7，将溶液减压滤除固体不溶物，得到橙黄色滤液，将该橙黄色滤液使用rp-c18柱层析纯化(70％甲醇水溶液)，得到无色固体产物0.111g(34％).esi-ms(m/e):774[m+h]+；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝8.46(m,1h),8.16～8.06(m,2h),7.90(d,j＝7.2hz,1h),7.64(t,j＝7.2hz,1h),7.45～7.35(m,5h),7.26(t,j＝7.2hz,2h),7.16(d,j＝7.2hz,1h),4.90(t,j＝7.2hz,1h),4.58(s,2h),4.45(m,2h),4.14～4.02(m,3h),3.55(m,4h),3.47(d,j＝6.9hz,2h),3.06(s,2h),2.14(s,3h),2.01～1.57(m,12h)。
实施例11评价华法林-4-o-乙酰-gprp四肽的抗静脉血栓作用
实验材料
乌拉坦(氨基甲酸乙酯，cas：51-79-6，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)华法林钠(cas：129-06-6，百灵威科技有限公司)。
实验动物
sd品系大鼠，雄性，250±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实验方法实验采用大鼠下腔静脉结扎模型。
分组及给药剂量：
本发明的化合物华法林-4-o-乙酰-gprp四肽剂量为1.0μmol/kg，阳性对照华法林的剂量为4.87μmol/kg，阴性对照为生理盐水。
试剂配制
麻醉剂为生理盐水配制的20％的乌拉坦溶液。
实验操作：
大鼠在手术前适应环境并禁食一天，以0.3ml/100g体重的剂量对大鼠进行灌胃给药。给药30min后于手术前2min用20％乌拉坦溶液腹腔给药麻醉。将大鼠固定于大鼠固定板上，从颈动脉取血5ml，用于血液相关指标的测定。将大鼠腹部备皮且消毒，然后沿腹白线打开腹腔，下至凝固腺，上至露出肝脏一角即可。移开腹腔内小肠等器官并用浸润过生理盐水的纱布包裹。钝性分离血管周围结缔组织，暴露下腔静脉及其分支，在肾静脉下方将腹主动脉和下腔静脉剥离开，然后用生理盐水浸湿的缝合线在下腔静脉与左肾静脉交汇处将下腔静脉结扎，按解剖位置将肠等器官移回腹腔，用缝合线逐层缝合腹腔。
术后将大鼠置于25～28℃的环境中循环4小时，打开腹腔后，逐个将其分支结扎，从下腔静脉与左肾静脉的交汇处的结扎处开始取出2cm下腔静脉，从中取出血栓。血栓称重并利用t检验的方式统计结果。手术以每组两只交替进行。实验数据见图2。
实验结果：
结果表明，1.0μmol/kg剂量华法林-4-o-乙酰-gprp治疗的大鼠的栓重(7.4±1.5mg)显著小于4.87μmol/kg剂量华法林治疗的大鼠的栓重(15.4±3.2mg，p＜0.01)。可见，华法林-4-o-乙酰-gprp四肽的抗静脉血栓活性比华法林至少强4.87倍。
实施例12评价华法林-4-o-乙酰-gprp的抗动脉血栓形成的作用
实验材料：
水合氯醛(氨基甲酸乙酯，cas：302-17-0，国药集团化学试剂有限公司)、三氯化铁(cas：7705-08-0，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)。
实验动物：
icr品系小鼠，雄性，20±2g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实验方法：实验采用三氯化铁诱导的动脉血栓形成模型。
分组及给药剂量：
本发明化合物华法林-4-o-乙酰-gprp四肽剂量为1.0μmol/kg；阳性对照阿司匹林剂量为240μmol/kg，阴性对照为生理盐水。
所用试剂配制：
麻醉剂为用生理盐水配制的5％的水合氯醛水溶液，三氯化铁溶液为用生理盐水配制的20％的三氯化铁水溶液。
实验操作：
将小鼠使用5％水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后，将小鼠固定在小鼠固定板上，沿腹部正中线剪开皮肤，沿腹白线剪开腹部肌肉层，移开腹腔内小肠等器官并用浸润过生理盐水的纱布包裹。钝性分离血管周围结缔组织，暴露腹主动脉，将其与小鼠下腔静脉剥离开，在腹主动脉下方放入0.6cm宽的封口膜，再用浸有20％fecl3溶液的滤纸条(1.0cm×0.4cm)环裹分离备用的腹主动脉段，并用封口膜包裹该段动脉，防止fecl3溶液触及其他脏器及血管。15min后，取下滤纸条，结扎滤纸条两端血管，精确剪下滤纸条包裹的血管段，用洁净滤纸吸干血管内余血，用眼科镊小心沿血管外部滑动，以此将血栓块完整地取出，用滤纸吸去栓块表面的浮血，精确称量血栓块的湿重，代表抗动脉血栓活性。数据采用t检验进行统计。
实验结果：
数据列入图3。结果表明华法林-4-o-乙酰-gprp治疗的小鼠的血栓重(0.52±0.19mg)显著小于生理盐水治疗的大鼠血栓重(1.02±0.28mg，p＜0.01)，说明化合物华法林-4-o-乙酰-gprp四肽表现出抗动脉血栓活性。并且1.0μmol/kg剂量下华法林-4-o-乙酰-gprp治疗小鼠的血栓重(0.52±0.19mg)与240μmol/kg剂量下阿司匹林治疗小鼠的血栓重(0.39±0.16mg)没有显著差异，说明化合物华法林-4-o-乙酰-gprp的抗动脉血栓活性比阿司匹林至少强240倍。这是意想不到的技术效果。
实施例13评价华法林-4-o-乙酰-gprp降低大鼠体内凝血因子ⅸ含量的作用
实验材料
柠檬酸钠(cas：68-04-2，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)。
实验样本
连续给药4天后大鼠颈动脉血
实验方法
实验采用大鼠fⅸ酶联免疫分析试剂盒来进行检测。
样品的采集
用3.8％的枸橼酸钠溶液为抗凝剂，待测组采集1.0μmol/kg华法林-4-o-乙酰-gprp四肽连续给药治疗4天的大鼠的颈动脉血，对照组采集连续使用生理盐水治疗4天的大鼠颈动脉血，在30min内于4℃1000rpm离心15min，取上清液(血浆)作为样品进行检测。
标准品的配制
从试剂盒中取出标准品，用150μl标准品稀释液稀释150μl原倍标准品，充分混合得到标准品s5，取4个1.5ml的离心管依次排列，各加入150μl样本稀释液，吸取150μl标准品s5于s4离心管中，吹打混匀，依次配得s5-s1标准品。标准品浓度分别为s5(200iu/l)、s4(100iu/l)、s3(50iu/l)、s2(25iu/l)、s1(12.5iu/l)和s0(0iu/l)。
分别设空白孔、标准孔、待测血清孔。在酶标包被板加50μl标准品，待测血清孔中先加40μl样品稀释液，再加10μl待测血清，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30min。小心揭掉封板膜，弃去液体，洗板5次。空白孔除外每孔加入50μl酶标试剂，37℃温育30min，洗涤，每孔先加50μl显色剂a，再加50μl显色剂b，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。每孔加50μl终止液终止反应，在15min内空白孔调零，450nm波长测量各孔的吸光度(od值)。根据标准品的od值绘制标准曲线，计算血清样本浓度，数据列入图4。
实验结果
从图4的数据可以看出，1.0μmol/kg华法林-4-o-乙酰-gprp治疗的大鼠的fⅸ含量显著低于生理盐水治疗大鼠的fⅸ含量(p＜0.05)，即在1.0μmol/kg的剂量下华法林-4-o-乙酰-gprp可降低大鼠体内fⅸ含量。
实施例14评价华法林-4-o-乙酰-gprp对大鼠出血时间的影响
实验材料
生理盐水(石家庄四药有限公司)、华法林钠(cas：129-06-6，百灵威科技有限公司)。
实验动物
sd品系大鼠，雄性，250±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实验方法
大鼠采用鼠尾出血模型评价。4.87μmol/kg华法林或1.0μmol/kg华法林-4-o-乙酰-gprp给药30min后，在大鼠的距鼠尾4cm处用手术刀开一个2mm深的创口，然后开始计时，每5s用滤纸将血拭去，在滤纸上不能看到任何血迹的时候停止计时，所记的时间为其出血时间。实验结果见图5。
实验结果
图5的结果表明，1.0μmol/kg华法林-4-o-乙酰-gprp给药后，大鼠鼠尾的出血时间与生理盐水治疗大鼠鼠尾的出血时间无显著差异(p＞0.05)。4.87μmol/kg华法林治疗的大鼠鼠尾出血时间明显长于生理盐水治疗大鼠鼠尾的出血时间，明显表现出血风险。