嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用的制作方法

本发明涉及微生物应用技术领域，更具体地，涉及嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用。

背景技术：

真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人类和动物都有害，真菌毒素污染是我国农产品质量和食品安全中的重大问题，食品安全关系到每个人的利益，因此有效的防止真菌毒素污染食品或农产品是一个亟需解决的问题。

现有技术中对于真菌毒素的防治可以分为物理法、化学药剂法和生物防治法，物理法治标不治本，化学药剂法效率高，对真菌毒素的杀伤力大，但却存在严重的化学药剂残留的问题，化学药剂的残留会使吃了饲料的动物体内残留，从而影响人类的身体健康；生物防治法主要是利用能够降解或者抑制体内残留的微生物防治真菌毒素，然而现有分离出来的微生物对毒素的降解作用太弱，出现的微生物种类少，难以满足真菌毒素的防治的需求。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述问题，发现了一株新嗜根考克氏菌，提供所述嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用，嗜根考克氏菌被称为CAMT21651（KR-51），于2016年6月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所；保藏编号为：GDMCC No：60048，分类学命称：Kocuria rhizophila。

优选地，所述嗜根考克氏菌的16S rRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述嗜根考克氏菌为球状、革兰氏阳性，菌落为亮黄色，呈圆形凸起，整齐湿润不透明，菌落直径为0.423～1.283 mm。

优选地，所述嗜根考克氏菌的硝酸盐还原试验为阳性，接触酶阳性。

优选地，所述嗜根考克氏菌的氧化酶、V-P试验、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验、明胶液化试验、酪氨酸水解、脲酶、糖发酵试验均为阴性。

研究发现该菌对真菌毒素具有抑制作用，特别是对DON毒素具有降解作用。

因此优选地，所述真菌毒素为呕吐毒素（DON）。

优选地，所述应用是将所述嗜根考克氏菌接种于培养基中，于30 ℃培养24h得到培养液，将培养液应用于降解真菌毒素。

优选地，所述培养基为TGY培养基，其培养基的组成为10g 胰蛋白胨，5g 酵母浸粉，1g 葡萄糖，30 g NaCl，1000 mL 蒸馏水，pH为7.0～7.5。

具体地，所述应用是将所述嗜根考克氏菌的培养液添加入饲料中喂养动物，发现动物体内毒素残留明显下降。

优选地，所述培养液的添加浓度为1×10⁹～2.8×10⁹ CFU/g·feed。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过从摄取真菌毒素的动物体内成功分离获得耐真菌毒素的微生物，该微生物被鉴定为嗜根考克氏菌CAMT21651（KR-51），于2016年6月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所；保藏编号为：GDMCC No：60048；该菌能够显著降低动物体内真菌毒素的残留量，从而为真菌毒素的生物防治奠定了基础。

附图说明

图1为嗜根考克氏菌CAMT21651（KR-51）的电镜扫描图。

图2为嗜根考克氏菌CAMT21651（KR-51）的的系统发育树。

图3为对虾肌肉中DON毒素的消除率随时间的变化。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。本发明对化合物的来源不做任何形式的限定。

实施例1 耐DON的微生物的分离

（1）制备DON蓄积的虾仁

随机挑选体质健康、个体大小均一的南美白对虾（5±0.5g），按照每组40尾（设3个平行）随机分配到长方形硬塑养殖箱（容积40×30×12cm³）中，利用充气式养殖系统保持海水溶氧量DO>6mg/L，pH6.5～7.5；水温24～28 ℃；盐度9.18～11.99 %。每天换1/3体积的水，采用自然光照，每日按照南美白对虾体重的5%，每日分为三次，早上9点一次，下午3点一次，晚上9点一次，每日饲料饲喂比为2：3：5。

以四天为一个周期， DON每种真菌毒素按照四天换一种剂量添加到饲料中喂养，真菌毒素的起始添加剂量是6 mg/kg·feed，每天染毒，每个周期真菌毒素的添加剂量递增1.5倍。四天为一个周期解剖一次，在无菌超净台去除虾头、虾尾、虾壳、虾肠、以及提取出肝胰腺等，得到虾肌肉于-20 ℃保存。

（2）染毒虾仁中分离DON的耐受菌

在无菌超净台中用灭菌剪刀将一尾虾虾仁剪细碎，从中取出虾肉25.0 g于灭菌225mL生理盐水，在漩涡混合器中漩涡120 s，制成1：10的样品匀液。用移液枪吸取1：10的样品匀液1mL，沿试管内壁缓慢注入装有9mL的灭菌生理盐水的试管中，摇晃试管或者用移液枪头反复吹打混合均匀，制成1：100的样品匀液。以此类推制备10倍系列稀释样品的匀液，每递增稀释一次，更换一次1mL移液枪头，最后得到10^-1～10^-3稀释度的样品匀液。在三个稀释度中分别取0.1ml样品稀释液于营养琼脂培养基（NA）上，均匀涂布，置于30 ℃培养48 h后计算菌落总数并选择具有代表性单菌落，用三段划线法划线纯化。从冷冻虾仁中分离到一株耐 DON的微生物KR-51，耐受DON浓度为1 mg/kg。

（3）毒素耐受菌KR-51的生长特性及生理生化鉴定

该菌菌落为亮黄色革兰氏阳性球菌，菌落直径为0.423～1.283 mm，菌落呈圆形凸起，整齐湿润不透明，最适生长培养基为改良TGY培养基（10g 胰蛋白胨，5g 酵母浸粉，1g 葡萄糖，30 g NaCl，1000 mL 蒸馏水，pH为7.0～7.5），最适生长温度为 30℃，硝酸盐还原试验阳性，接触酶阳性，而氧化酶、V-P试验、吲哚、柠檬酸盐利用试验、明胶液化、酪氨酸水解、脲酶、糖类发酵试验（葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、D-木糖）等均呈现阴性，该菌株的电镜扫描图如图1。

（4）耐受菌KR-51分离株的16S rRNA 测 序 及 同 源 性 比 较

将目标菌的菌株划线接种于改良TGY培养基中，于30℃恒温培养箱中培养24h，得到单菌落。

以引物1：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和引物2：5’-CGGCTACCTTGTTACGAC-3’ 作为上下游引物。建立30µL的PCR反应体系： 15 µL 2×MightyAmp polymerase Ver.2，12.9µL双蒸水，0.75µL上游引物1，0.75µL下游引物2 和0.6µL DNA聚合酶。最后挑取微量的单菌落作为DNA模板，加入30 µL PCR反应体系中进行扩增。 PCR反应程序第一阶段: 98 ℃预变性2min；第二阶段：98 ℃变性10 s、58 ℃退火15 s、68 ℃延伸90 s，40个循环；第三个阶段10 ℃保存20 min。

PCR扩增结束后，取2µL扩增产物与1µL核酸染料混合，点样于凝胶孔上，进行1.5%琼脂糖电泳（121V，30min），用凝胶成像仪观察扩增产物的电泳结果，16S rRNA的PCR扩增产物由上海生工生物工程计算服务有限公司完成。根据测序结果，将16S rRNA序列登陆数据库EzBioCloud中进行相似性比对搜索，从中获得相似性较高且是有效描述的典型菌株的16S rRNA序列作为参比对象，利用MEGA6.0的Neighbor Joining法建立系统发育树，并进行1000次Bootstraps检验。结果检测发现毒素耐受菌KR-51被鉴定为嗜根考克氏菌（Kocuria rhizophila），该菌株的遗传系统发育树如图2。

该毒素耐受菌KR-51被称为CAMT21651（KR-51），于2016年6月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所；保藏编号为：GDMCC No：60048。

实施例2 KR-51对水产饲料中DON 毒素在对虾体内残留量的消减

选取对虾600 尾，随机分成4个处理组，分别为基础饲料组、基础饲料+ DON组、基础饲料+嗜根考克氏菌制剂组、基础饲料+DON +嗜根考克氏菌制剂组（嗜根考克氏菌制剂的添加量为1000 mL/kg·feed（0.02%质量分数，1×10⁸～3.6×10⁸CFU/g·feed））。

（1）饲料+DON组：制备DON微胶囊毒饲料，DON毒素设 6、9、13.15、20.25和30.375 mg/kg·feed剂量组。

（2）基础饲料+嗜根考克氏菌制剂组：挑取实施例1所述嗜根考克氏菌株接种在改良TGY培养基中，32 ℃培养24 h。将培养24h的嗜根考克氏菌发酵液按1：1的比例均匀喷洒到基础饲料中（嗜根考克氏菌在饲料中的含量为1×10⁸～3.6×10⁸CFU/g·feed）。

（3）基础饲料+DON+嗜根考克氏菌制剂组：配制不同剂量的DON饲料组，加入嗜根考克氏菌（嗜根考克氏菌在饲料中的含量为1×10⁸～3.6×10⁸CFU/g·feed）。

试验采用剂量递增法染毒，以饲料中DON含量为6 mg/kg·feed作为起始染毒剂量，每天染毒，4天为一周期，每期递增1.5倍，连续染毒20天，并设置空白对照。

采用LC-MS/MS方法检测对虾肌肉中DON毒素的残留量，结果发现：和基础饲料+DON组相比，基础饲料+DON +嗜根考克氏菌制剂组中消除DON残留率最高为37.01%±0.75，最终消除残留量为8.55±0.93 ng/g（图3）。

实施例3

在8.8mL TGY和8.8mL传统发酵鱼露中分别加入1mL嗜根考克氏菌KR-51发酵液（1×10⁹ CFU/mL）和DON标准工作液（2.5µg/mL）0.20mL，使TGY和传统发酵鱼露培养液中DON的初始浓度均为500.0 ng/mL，30℃振荡培养24h（160r/min）后，用LC-MS/MS方法检测培养液中DON含量。比较嗜根考克氏菌KR-51发酵前后鱼露中毒素残留量变化，结果表明，嗜根考克氏菌KR-51对TGY培养液中DON的降解率为52.24±1.63%，降解量为261.2±17.86 ng。对传统发酵鱼露中DON的降解率为32.02±1.18.%，降解量为160.1±11.24ng。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东海洋大学

<120> 嗜根考克氏菌在降解真菌毒素中的应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1132

<212> DNA

<213> 16srDNA序列

<400> 1

gtgcaatgcg cagctaccat gcagtcgacg ctgagcttgg tgcttgcact gggtggatga 60

gtggcgaacg ggtgagtaat acgtgagtaa cctgcccttg actctgggat aagcctggga 120

aactgggtct aatactggat acgacatgtc accgcatggt ggtgtgtgga aagggtttta 180

ctggttttgg atgggctcac ggcctatcag cttgttggtg gggtaatggc tcaccaaggc 240

gacgacgggt agccggcctg agagggtgac cggccacact gggactgaga cacggcccag 300

actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcggaagcct gatgcagcga 360

cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct ttcagcacgg aagaagcgaa 420

agtgacggta cgtgcagaag aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 480

tagggcgcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gtttgtcgcg 540

tctgctgtga aagcccgggg cttaaccccg ggtgtgcagt gggtacgggc agacttgagt 600

gcagtagggg agactggaat tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac 660

accgatggcg aaggcaggtc tctgggctgt tactgacgct gaggagcgaa agcatgggga 720

gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac gttgggcact aggtgtgggg 780

aacattccac gttttccgcg ccgtagctaa cgcattaagt gccccgcctg gggagtacgg 840

ccgcaaggct aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggcgg agcatgcgga 900

ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc aagggcttga catacaccgg accgggccag 960

agatgtcttt ccccttgtgg ggctggtgta caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg 1020

tcgtgagatg tggttaagtc ccgcacgagc gcaaccctcg ttctatgttg gcagcacgtg 1080

atggtgggga ctcaatagga gaactgcccg gggtcaactt cggaaggaat gt 1132

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物1

<400> 2

gagagtttga tcctggctca g 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物2

<400> 3

cggctacctt gttacgac 18