一种提高裂殖壶菌多不饱和脂肪酸含量或产量的方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种通过基因工程的调控手段提高裂殖壶菌中多不饱和脂肪酸产量的方法。

背景技术：

多不饱和脂肪酸特别是二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸，是人体成长和健康不可或缺的营养物质，对维持大脑的正常生理功能、促进胎儿及婴幼儿大脑的生长发育、维持正常视力、预防心血管疾病、抑制肿瘤形成等多方面具有显著功效。由于其具有上述多种重要功能，在食品、医药等领域具有广泛的应用。

裂殖壶菌是一种单细胞海洋微藻，因积累大量的对人体有用的多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFA)而著称。裂殖壶菌积累的总油脂含量达细胞干重的70％以上，其中，二十二碳六烯酸(DHA，C22:6)占总油脂含量的35％以上，与来源于鱼油的传统DHA资源相比，具有生长速度快、培养周期短、生物积累量高、占地面积少、营养价值高、油质品质好等优点，因此，裂殖壶菌是一种工业化生产DHA的最佳微生物之一。

目前，工业上主要通过发酵工程的手段提高裂殖壶菌的DHA产量，专利CN 104031843 B是已有专利报道中生物量和DHA产量最高的，发酵后最终生物量达到200g/L左右，总脂产量高于100g/L，DHA在总脂肪酸中的含量为56％，DHA产量为50-65g/L，已逐步逼近野生菌株合成DHA的上限，很难再通过工艺优化等手段提高藻油的产量及品质。因此，需要遗传工程的手段，从遗传角度对野生藻株进行改造，获得更高产的DHA工程藻株。

Metz等人(2001)证实裂殖壶菌通过脂肪酸合酶途径(FAS途径)和聚酮合酶途径(PKS途径)两种不同的途径合成脂肪酸。而Wallis等人(2002)也证实了在裂殖壶菌中FAS途径负责合成饱和脂肪酸(主要包括C16:0)，PKS途径负责合成多不饱和脂肪酸(主要包括C22:6)。并且无论是饱和脂肪酸还是多不饱和脂肪酸，其合成均需要前体乙酰辅酶A和还原力。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种提高裂殖壶菌多不饱和脂肪酸含量或产量的方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种提高裂殖壶菌多不饱和脂肪酸含量或产量的方法，利用基因工程的手段，调控裂殖壶菌胞内转氢酶循环途径和/或磷酸戊糖途径中为脂肪酸合成所需的还原力NADPH的供给，进而从裂殖壶菌胞内获得多不饱和脂肪酸及其副产品。

进一步，利用基因工程的手段，通过静态和/或动态的方式调控裂殖壶 菌胞内转氢酶循环途径和/或磷酸戊糖途径中为脂肪酸合成所需的还原力NADPH的供给。

所述通过静态的方式是以组成型表达调节。

所述组成型表达调节是通过整合手段同源重组18s RNA基因。

利用基因工程的手段，通过调控转氢酶循环途径中苹果酸酶基因(ME)表达盒和/或磷酸戊糖途径中葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因(G6PDH)表达盒，进而调控脂肪酸合成所需的还原力NADPH的供给。

所述苹果酸酶基因(ME)表达盒为，由肌动蛋白基因启动子，苹果酸酶基因和肌动蛋白基因终止子组成；所述葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因(G6PDH)表达盒为，由肌动蛋白基因启动子，G6PDH基因和机动蛋白基因终止子组成。

所述通过动态的方式是硝酸根诱导系统表达调节。

利用基因工程的手段，通过硝酸根诱导系统(NO3-诱导表达盒)调控转氢酶循环途径中苹果酸酶(ME)基因和/或磷酸戊糖途径中葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因(G6PDH)的表达，从而调控脂肪酸合成所需的还原力NADPH的供给。

具体为：

1)表达盒构建

所述抗性基因表达盒为，利用博来霉素抗性基因(zeocin)SEQ ID NO：1及延长因子启动子(PEF1a)SEQ ID NO：2和细胞色素c终止子(cycTT)SEQ ID NO：3构建。

所述硝酸根诱导表达盒(NO^3-诱导表达盒)为，以葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)SEQ ID NO：4或苹果酸酶(ME)SEQ ID NO：5做为报告基因，选择细柱藻硝酸还原酶基因启动子SEQ ID NO：6和终止子SEQ ID NO：7作为调控序列构建。

所述苹果酸酶基因表达盒为，由肌动蛋白基因启动子SEQ ID NO：8，苹果酸酶基因和肌动蛋白基因终止子SEQ ID NO：9组成。

所述G6PDH表达盒为，由肌动蛋白基因启动子，G6PDH基因和机动蛋白基因终止子组成。

2)组成型调控质粒或诱导型调控质粒构建

利用已构建的各种表达盒元件进一步构建各种组成型调控质粒或诱导型调控质粒。

构建组成型苹果酸酶基因过表达质粒pGZ1521SEQ ID NO：10，该质粒包含18S rRNA上游同源臂SEQ ID NO：11、18S rRNA下游同源臂SEQ ID NO：12，苹果酸酶基因表达盒与博来霉素抗性基因表达盒。

构建组成型葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)基因过表达质粒pGZ1420SEQ ID NO：13。该质粒包含18S rRNA同源臂SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12，G6PDH基因表达盒与博来霉素抗性基因表达盒。

构建诱导型苹果酸酶基因过表达质粒pGZ1622SEQ ID NO：14，该质 粒包含18S rRNA上游同源臂SEQ ID NO：11、18S rRNA下游同源臂SEQ ID NO：12，苹果酸酶基因硝酸根诱导表达盒与博来霉素抗性基因表达盒。

构建诱导型葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)基因过表达质粒pGZ1723SEQ ID NO：15。该质粒包含18S rRNA同源臂SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12，G6PDH基因硝酸根诱导表达盒与博来霉素抗性基因表达盒。

同源重组位点为18S rRNA基因SEQ ID NO：16。

3)感受态细胞制备及转化

(1)挑单菌落接种到5mL复合培养于25℃孵育12h，取2mL培养液转接到50ml复合培养基继续培养至OD600nm＝6-8。

(2)转入50mL离心管，置冰上冷却10min，4℃，2000g离心5min收集菌体。

(3)用20mL 1M冰冷的山梨醇洗涤一次，然后用buffer A(0.6M山梨醇，0.1M醋酸锂，10mM DTT)重悬，置于冰上30min。

(4)4℃，2000g离心5min收集菌体，3mL buffer B(10Mm磷酸氢二钾，5mM氯化镁，1M山梨醇)重悬。

(5)取100uL上述细胞加入2-5ug DNA混匀后，置于0.2cm电转杯(Bio-Rad)，冰上放置10min后置于电脉冲仪转化。电转参数包括：电压(0.8-1.6KV)、占空比(5％-50％)、频率(500-2000HZ)、脉冲数(10-60次)。

(6)转化后，转接至复合或合成培养基中，于25℃复苏6-12h，然后涂布含有30ug/mL博来霉素的琼脂平板，25℃培养3-5天。

所述复合培养基为葡萄糖60g/L，酵母浸出物20g/L，海水晶15g/L，pH＝6.5。

所述合成培养基为葡萄糖60g/L，硫酸铵6g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1g/L，氯化钠10g/L，硫酸钠2g/L，维生素B₁ 30mg/L，维生素B₆ 30mg/L，泛酸钙10mg/L，生物素3mg/L，维生素B₁₂ 30mg/L。

所述多不饱和脂肪酸包含但不限于二十二碳六烯酸，二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、十八碳三烯酸等。

本发明与已有技术相比具有以下显著特点和积极效果：

本发明利用基因工程的手段，改变裂殖壶菌胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或苹果酸酶的表达活性，改变还原力NADPH的供给，可以改变裂殖壶菌的脂肪酸组成，提高多不饱和脂肪酸的含量及产量。此方法也可用于其他微生物脂肪酸产品的遗传工程和性能改良。

本发明的有益之处在于通过调控还原力的供给方式，显著提高了多不饱和脂肪酸的产量，获得高产多不饱和脂肪酸的工程菌株，为多不饱和脂肪酸的工业化生产提供了新的技术与方法。

附图说明

图1为裂殖壶菌合成脂肪酸所需还原力NADPH的可能供应途径。 (G6PDH：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；Gnd：6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；ME：苹果酸酶)。磷酸戊糖途径产生的NADPH可能主要为PKS途径提供还原力；转氢酶循环途径可能主要为FAS途径提供还原力。

图2为本发明实施例提的ME过表达工程菌株SD006::ME构建示意图及PCR验证琼脂糖凝胶电泳图。泳道1-2：质粒pGZ1521对照；泳道3-4：野生菌株对照；泳道5-6：工程菌株SD006::ME。

图3为本发明实施例提的G6PDH过表达工程菌株SD006::G6PDH构建示意图及PCR验证琼脂糖凝胶电泳图。泳道1：野生型对照，泳道2-4：工程菌株SD006::G6PDH。

具体实施方式

实施例1：来源于转氢酶循环途径的还原力对裂殖壶菌脂肪酸合成的影响。

通过在裂殖壶菌细胞内组成型过表达苹果酸酶基因增强转氢酶循环途径。

首先，通过现有技术方式利用同源重组方法在商业化质粒PMD-18T的基础上构建苹果酸酶基因过表达质粒pGZ1521。该质粒包含18S rRNA上游同源臂、18S rRNA下游同源臂，苹果酸酶基因表达盒与博来霉素抗性基因表达盒。

然后，转化裂殖壶菌。(1)挑野生型单菌落接种到5mL复合培养于25℃孵育12h，取2mL培养液转接到50ml复合培养基继续培养至OD600nm＝6。(2)转入50mL离心管，置冰上冷却10min，4℃，2000g离心5min收集菌体。(3)用20mL 1M预冷的山梨醇洗涤一次，然后用buffer A(0.6M山梨醇，0.1M醋酸锂，10mM DTT)重悬，置于冰上30min。(4)4℃，2000g离心5min收集菌体，3mL buffer B(10mM磷酸氢二钾，5mM氯化镁，1M山梨醇)重悬。(5)取100uL上述细胞加入2ug过表达质粒pGZ1521混匀后，置于0.2cm电转杯(Bio-Rad)，冰上放置10min后置于电脉冲仪转化。电转参数包括：电压0.8KV、占空比5％、频率2000Hz、脉冲数60次。

转化后，转接至复合培养基中，于25℃复苏6h，然后涂布含有30ug/mL博来霉素的琼脂平板，25℃培养5天。获得过表达工程藻株SD006::ME。

最后，对工程菌株进行发酵培养，于发酵终点收集细胞，检测苹果酸酶酶活变化，提取总油脂，利用气相色谱分析脂肪酸组成及含量(Song xj等，2013)。具体为称取一定量的菌体，按6mL/g的比例加入4mol/L盐酸，振荡混匀，室温放置30min后，沸水浴煮3min，-20℃速冷后加入2倍体积的氯仿－甲醇混合溶剂，充分振荡后5000r/min离心5min，取氯仿层，加等体积的0.1％氯化钠溶液，混匀5000r/min离心5min，取氯仿层移至干燥的试管中，挥发除去氯仿，得到油脂，然后50℃真空干燥至恒重，称量适量油脂溶解于1mL氯仿中，加入2％H2SO4－甲醇溶液2.5mL和100ul十九酸，85℃水浴加热2.5h。冷却至室温，加入1mL正己烷和1mL饱和氯化钠 溶液，混匀，静置分层后取上层，经0.22um尼龙膜过滤后，进行气相色谱检测色谱条件：Agilent C-6890型气相色谱仪，色谱柱：HP-INNOWax(30m×250um×0.25um，安捷伦公司)。采用程序升温，初始温度100℃，按15℃/min升到240℃，保持10min；进样口温度250℃；FID检测器，检测器温度260℃。

复合培养基为葡萄糖60g/L，酵母浸出物20g/L，海水晶15g/L，pH＝6.5。

结果表明，苹果酸酶基因整合到裂殖壶菌基因组(图2)，成功获得苹果酸酶基因过表达工程藻株SD006::ME。与野生型菌株比较，工程菌株的苹果酸酶比活提高2-6倍，生物量提高13.4％，总脂肪含量提高18.7％，总不饱和脂肪酸产量提高14.8％。

实施例2：来源于磷酸戊糖途径的还原力对裂殖壶菌脂肪酸合成的影响。

通过在裂殖壶菌细胞内组成型过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因增强磷酸戊糖途径。

首先，通过现有技术方式利用同源重组方法在商业化质粒PMD-18T的基础上构建葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因过表达质粒pGZ1420。该质粒包含18SrRNA上下游同源臂，G6PDH基因表达盒与博来霉素抗性基因表达盒。

然后，转化裂殖壶菌。(1)挑野生型单菌落接种到5mL复合培养于25℃孵育12h，取2mL培养液转接到50ml复合培养基继续培养至OD600nm＝8。(2)转入50mL离心管，置冰上冷却10min，4℃，2000g离心5min收集菌体。(3)用20mL 1M预冷的山梨醇洗涤一次，然后用buffer A(0.6M山梨醇，0.1M醋酸锂，10mM DTT)重悬，置于冰上30min。(4)4℃，2000g离心5min收集菌体，3mL buffer B(10mM磷酸氢二钾，5mM氯化镁，1M山梨醇)重悬。(5)取100uL上述细胞加入5ug过表达质粒pGZ1420混匀后，置于0.2cm电转杯(Bio-Rad)，冰上放置10min后置于电脉冲仪转化。电转参数包括：电压1.6KV、占空比50％、频率500Hz、脉冲数10次。

转化后，转接至复合培养基中，于25℃复苏12h，然后涂布含有30ug/mL博来霉素的琼脂平板，25℃培养3天。获得过表达工程藻株SD006::G6PDH。

最后，对工程菌株进行发酵培养，于发酵终点收集细胞，检测酶活变化，提取总油脂，利用气相色谱分析脂肪酸组成及含量。

复合培养基为葡萄糖60g/L，酵母浸出物20g/L，海水晶15g/L，pH＝6.5。

结果表明，G6PDH基因成功整合到裂殖壶菌基因组(图3)，获得G6PDH过表达工程菌株SD006::G6PDH。与野生型菌株比较，工程菌株的G6PDH比活提高3-9倍，生物量提高6.4％，总脂肪含量提高8.7％。表1给出了野生菌株和工程菌株的脂肪酸组成变化。

表1野生菌株和工程菌株的脂肪酸组成变化

实施例3：来源于条件诱导过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶对裂殖壶菌脂肪酸合成的影响。

通过在裂殖壶菌细胞内诱导型过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因增强磷酸戊糖途径。

首先，通过现有技术方式利用同源重组方法在商业化质粒PMD-18T的基础上构建诱导型葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)基因过表达质粒pGZ1723SEQ ID NO：15。该质粒包含18S rRNA上下游同源臂，G6PDH基因硝酸根诱导表达盒与博来霉素抗性基因表达盒。

然后，转化裂殖壶菌。(1)挑野生型单菌落接种到5mL复合培养于25℃孵育12h，取2mL培养液转接到50ml复合培养基继续培养至OD600nm＝7。(2)转入50mL离心管，置冰上冷却10min，4℃，2000g离心5min收集菌体。(3)用20mL 1M预冷的山梨醇洗涤一次，然后用buffer A(0.6M山梨醇，0.1M醋酸锂，10mM DTT)重悬，置于冰上30min。(4)4℃，2000g离心5min收集菌体，3mL buffer B(10mM磷酸氢二钾，5mM氯化镁，1M山梨醇)重悬。(5)取100uL上述细胞加入4ug过表达质粒pGZ1723混匀后，置于0.2cm电转杯(Bio-Rad)，冰上放置10min后置于电脉冲仪转化。电转参数包括：电压1.4KV、占空比30％、频率1000Hz、脉冲数30次。

转化后，转接至合成培养基中，于25℃复苏12h，然后涂布含有30ug/mL博来霉素的琼脂平板，25℃培养3天。获得过表达工程藻株SD006::G6PDH2。

最后，对工程菌株进行发酵培养，于40h后加入3g/L KNO₃进行诱导，发酵终点收集细胞，提取总油脂，利用气相色谱分析脂肪酸组成及含量。

合成培养基为葡萄糖60g/L，硫酸铵6g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1g/L，氯化钠10g/L，硫酸钠2g/L，维生素B₁ 30mg/L，维生素B₆ 30mg/L，泛酸钙10mg/L，生物素3mg/L，维生素B₁₂ 30mg/L，pH＝6.5。

获得G6PDH过表达工程菌株SD006::G6PDH2。与野生型菌株比较，生物量提高9.6％，总脂肪含量提高10.7％。表2给出了野生菌株和工程菌株的脂肪酸组成变化。

表2野生菌株和工程菌株的脂肪酸组成变化

实施例4：来源于诱导型苹果酸酶对裂殖壶菌脂肪酸合成的影响。

通过在裂殖壶菌细胞内诱导型过表达苹果酸酶基因增强转氢酶循环途径。

首先，通过现有技术方式利用同源重组方法在商业化质粒PMD-18T的基础上构建诱导型苹果酸酶基因过表达质粒pGZ1622SEQ ID NO：14，该质粒包含18S rRNA上游同源臂、18S rRNA下游同源臂，苹果酸酶基因硝酸根诱导表达盒与博来霉素抗性基因表达盒。

然后，转化裂殖壶菌。(1)挑野生型单菌落接种到5mL复合培养于25℃孵育12h，取2mL培养液转接到50ml复合培养基继续培养至OD600nm＝7。(2)转入50mL离心管，置冰上冷却10min，4℃，2000g离心5min收集菌体。(3)用20mL 1M预冷的山梨醇洗涤一次，然后用buffer A(0.6M山梨醇，0.1M醋酸锂，10mM DTT)重悬，置于冰上30min。(4)4℃，2000g离心5min收集菌体，3mL buffer B(10mM磷酸氢二钾，5mM氯化镁，1M山梨醇)重悬。(5)取100uL上述细胞加入3ug过表达质粒pGZ1622混匀后，置于0.2cm电转杯(Bio-Rad)，冰上放置10min后置于电脉冲仪转化。电转参数包括：电压1.2KV、占空比40％、频率1500Hz、脉冲数40次。

转化后，转接至合成培养基中，于25℃复苏6h，然后涂布含有30ug/mL博来霉素的琼脂平板，25℃培养5天。获得过表达工程藻株SD006::ME2。

最后，对工程菌株进行发酵培养，于40h后加入3g/L KNO₃进行诱导，发酵终点收集细胞，提取总油脂，利用气相色谱分析脂肪酸组成及含量。

合成培养基为葡萄糖60g/L，硫酸铵6g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1g/L，氯化钠10g/L，硫酸钠2g/L，维生素B₁ 30mg/L，维生素B₆ 30mg/L，泛酸钙10mg/L，生物素3mg/L，维生素B₁₂ 30mg/L，pH＝6.5。

结果表明，成功获得苹果酸酶基因过表达工程藻株SD006::ME2。与野生型菌株比较，工程菌株的苹果酸酶比活提高5倍，生物量提高11.2％，总脂肪含量提高12.6％，总不饱和脂肪酸产量提高11.9％。

序列为：

SEQ ID NO：1Zoecin抗性基因(zeo^R)：

Atggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactga

SEQ ID NO：2延长因子启动子(PEF1a)：

Aagttttataacctacacccctggtggggtaggggcgaattctatgtacacagcacctcagaacttgcgcgcgttccgtgacaaatgaggggtgtggcggc gcattcggccgcatcgccacattcagatatctaacatacccccccttcgcgatgagtggcaggcgaggcggattcgctcgcgagaggcgaggtgccacagcagaccagtaacgaggagccaaggtaggtgaccaccgacgactacgaccacgaccacagccacggcggctgcagccacgggacgcctcgcatggcagcgcagcagcaccagcaacgacagctacaaggagtgcagggccgatctagacgcgccggagccgcacgaccaatgccgacgcaacgctgattcttctggattccctctatacattcatatatatgaagagaagcggatgagacggcctgcgaataaatgaatggcttggagtttgcttgcttgccgtatgctcgaaagtgcgtgtgcagacacaggcacgaccgagaggacaacagtctgtgcttacctcaccagcacattcttgcaacgccattcgaagcacgcgaaatcttgtggctcagagcaaaaggcatccgtggtacgggaacgtggggaacgctatcaatttggaattcaaaatgagtgaaccagacaactaactgtgacttgaactgttgctccacgcatcaaaaccaaacccttaacagaagtagaccagttcgaagctactagcaccaaacaaa

SEQ ID NO：3细胞色素C终止子(CYCTT)：

Cacgtccgacgcggcccgacgggtccgaggcctcggagatccgtcccccttttcctttgtcgatatcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaa

SEQ ID NO：4G6PDH:

atgctcaaaagctttatctccgaggaggagtaccatgtggcagactttcttgacctgaagcaggagccatggctcgaggaaaagctctctgtggtcgttttcggcgcatctggtgatcttgccaagaaaaagacttacccttcaatctttgatttgcaccgcgttggtgcattgccccgtgagaccatcgtcatgggctacgctcggtccaagatgagtgacgaggactttcgccagcgcatccgcgactaccttaaggatcgtggcaccgaggaggatgttgagcgcttcttggacatctgtatctaccgtaacggacagtacgacggcgtggaggagttccaagcgatctcagatgagcttcgtgaacttcacgaatgtgaaaaggaggacgtcgagaaccgcatgttctaccttgccattcctcctgctcagttcctcaactccgtacaaaccactcgtgaggctggcatggctaaaaatggctggacccgcgtcgttgtggagaagccctttggtcatgacaccgagtccgccaagaaactcggcattgacatggccgagttctttgatgagtctcacctctaccgcatcgaccactaccttggcaaggagatggttcagaaccttgtcacccttcgcttcggcaacgccttcctcgaacctctatttaatcgtgaccacattgcatccgtaatcatctctttcaaggagcccttcggcacagaaggtcgcggtggctactttgactccaacggaattatccgtgacgtcatgcagaaccacctcatgcaacttctcagtatcatcgcaatggagccccccgtcaaggttgcaggacacaccaacgacggcactgattactctcgctacgttcgcgacgaaaaggtcaaggtcctttctgccatcgcgccctggaggctcgaagatgttgtccttggccaatatgtttccaacggtaccgaccccggttacctcgacgacgacaccgtgcctcctgactcaaacatccccacttacgcagctgtacgtatgttcattgataacaaacgctgggatggcgtgcccttcatcatgaaggcaggaaaggctctcgatgagaagaaatgcgaggtccgtatccagtttaaagatcctgcaggagctgctgccatgtttggccagagcgagatccctcgcaacgaactcgtgcttgttcttcagccccaggagagcatctacatgaagcttaacgtgaagaagcccggtctcgccacaagcattcttcagagcgagcttgacctaaactaccacgaccgctacgacaagcacgccattcctgaggcctacactcgcctcttgcttgatgtccttcgtggaaagcaggccacctttgtgcgcgatgatgaacttgtcgcagcatgggagattgtcacccctctgcttgaggctatcgagagcggtggagtcaagcccatcccgtacacttacggttcgcgtggacctgctgaggccgatgagctcgtgcgcgaatctggataccgtcgcaacgccaagtacgctgatcattacaatgactggaagaccaaaaaatcgaagcagcatggcaagagtaagtaa

SEQ ID NO：5ME:

atgggtctcttcaaccgcaagagcgtctcccacaagcccgccaccgagagctcaatcgctcttaaggcatccagccgtggcaccgaggccaccagcattgagcgtgtcaggaatccccacttcaacaagggcacctccttcaccgctgaagagcgcaagcagtatggtcttgagggtctcgttcccagcgtcgtggagtccatcgatctccaggccaagcgtgagctccagcaccttcgtcgcaagcccagccccatcgagaagtacgtcttccttatgggcctcctcgaccgcaacgttgagctcttctacaaaatcgtaactgagaacgtctccgaatgcatgcccctcgtgtacacgcctaccgtaggccaagcctgccaagagttccacctcatctaccagcagcccaagggtctctatgtctctctcgaggaccttggcaacgtggagactctcgtgaacaactggcctgaggacaatgttacctgcattgtcatgaccgacggaggccgtatcctcggactcggagatctcggtgccaacggtctcggaatcccccaaggtaagctccagctctactctgcctgcgccggaatcccccaccaccagtgcctgccggtcattttggacgtcggcaccaacaacaagaccctgcttgaagatgagctgtacatgggtctccgccgtgaacgtgaacgtggcgagacttacgaccacctcgtcaaggagttcatggccgccgcccagaagcgctggggaaggtctctcttgatccagttcgaggactttgacaacaccaacgcattcagactcctcgaggagacccgcaactcatacacaaccttcaacgacgatatccagggtaccgcggcagtctcgcttgctggagttctggcttcgcttagggtcacaagcaaggttgaaggcggcaagaagaagctccgcgaccacacctttgtgtttatgggcgctggagaagctggtacaggtattgccaacctcattgcacatgccatccaggaggaggctgttgacgacggcattacccccatctctgaggacgatgcaagacgccagatctggctcgttgacagcaagggacttgtcaccaagacccgcggagacaacggagaactccagcaccacaagcttgactttgcccatgagctgtctgaggacctcatcgagaaggtcgcaggcaccgaatgggaagtcaaggatggcaaggtcacctcgcttgagcaggctgtgcgtatcatgaacccgactgccatcattggtgtctgcgccatgcctaataccttcaccgagagcattattgagtacatggctgagattaatgaggcaccccttgtctttgccctgagtaaccctacttccaaggccgagtgcactgctgagcaggcatacaagtggtctgatggacgtgccatctttgtcagcggatctcccttcgaccccgtcgacatcaccctcagctctggagaggaggtcaccaagtaccctggccagggtaacaacgcatacatcttccccggtcttggccttggagtgcttgctgccaaggccacgactatccccaacgagctcctttacgtgtctgcccaggcgcttgctgagcaggtcgttgaagacgatcttaacaacggacgcatgtaccctcaccttgacaacatccgcgaggtttcggccaacattgcataccgtgttgctgagcgtgcctttcagctctccatcgcatcggcgaagaagcctgctgacctcgaggcatatgtccgctcctgcatggctaaccctggatggtga

SEQ ID NO：6硝酸还原酶基因启动子

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SEQ ID NO：7硝酸还原酶基因终止子

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SEQ ID NO：8机动蛋白启动子(Pactin)：

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SEQ ID NO：9肌动蛋白终止子(actinTT)：

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SEQ ID NO：10ME过表达质粒pGZ1521：

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SEQ ID NO：11 18S上游同源臂：(18S1)

Taattctggaaataatacatgctgtaagagccctgtatggggctgcacttattagattgaagccgattttattggtgaatcatgataattgagcagattgacatttttgtcgatgaatcgtttgagtttctgccccatcagttgtcgacggtagtgtattggactacggtgactataacgggtgacggagagttagggctcgactccggagagggagcctgagagacggctaccatatccaaggatagcagcaggcgcgtaaattacccactgtggactccacgaggtagtgacgagaaatatcgatgcgaagcgtgtatgcgttttgctatcggaatgagagcaatgtaaaaccctcatcgaggatcaactggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccagaagcatatgctaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaatttctggcatgggcgaccggtgctttccctgaatggggattgattgtctgtgttgccttggccatctttttcttttctttataggggagaaatctttcactgtaatcaaagcagagtgttccaagcaggtcgtatgaccggtatgtttattatgggatgataagataggacttgggtgctattttgttggtttgcacgcctgagtaatggttaataggaacagttgggggtattcgtatttaggagctagaggtgaaattcttggatttccgaaagacgaactagagcgaaggcatttaccaagcatgttttcattaatcaagaacgaaagtctggggatcgaagatgattagataccatcgtag

SEQ ID NO：12 18S下游同源臂(18S2):

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SEQ ID NO：13G6PDH过表达质粒pGZ1420：

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SEQ ID NO：15质粒pGZ1723

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SEQ ID NO：16 18S rDNA基因序列：

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