用于筛选Nrf2激活剂的重组质粒及其构建方法和用途与流程

本发明涉及生物医药领域，具体涉及用于筛选Nrf2激活剂的重组质粒及其构建方法和用途。

背景技术：

人体在受到多种环境因素如紫外照射等情况下，会产生活性氧族(reactive oxygen species，ROS)。ROS作为第二信使，诱发炎症反应、细胞膜脂质过氧化、蛋白和DNA氧化损伤，直接或间接地破坏细胞内蛋白质、脂质、核酸等大分子物质的生理功能，进而诱发包括细胞氧化应激损伤或凋亡，进一步导致肿瘤等的形成。当暴露于ROS时，机体自身能诱导一系列保护性蛋白，其中核因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,简称Nrf2)信号通路是最为重要的抗氧化应激通路，它可以启动II相酶和抗氧化酶等基因转录，维持体内氧化还原平衡，提高细胞抗氧化应激能力。但损害过量或由于年龄因素导致细胞内源性抗氧化能力下降，细胞中的ROS产生量超出细胞自身清除能力，则导致损伤。因此，采用抗氧化剂诱导II相酶和抗氧化酶等基因的表达和提高细胞内的抗氧化能力是探索安全有效且作用机制明确的抗氧化药物和化妆品行业的重点。

如上所述，Nrf2信号通路是最重要的抗氧化应激通路，激活后的Nrf2，由胞浆转移至胞核，与Maf蛋白形成异二聚体，识别并与核内抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)结合，启动II相酶和抗氧化酶基因转录，维持体内氧化还原平衡，提高细胞抗氧化应激能力。

目前已有报道利用ARE顺式转录原件(cis-regulatory element)调控报告基因来监控Nrf2的转录激活作用，这些报告基因主要包括萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)、绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein)、β-半乳糖甘酶(β-galactosidase)等。然而，这些报告系统还存在一系列的问题：(1)以萤火虫荧光素酶等各种酶作为报告基因，后续检测其活性时均需要裂解细胞后检测，操作步骤复杂而不方便，难以实现长期检测；(2)检测灵敏度较差，还有待进一步提高；(3)上述报告基因采用瞬时转染，其中最常用的HaCaT细胞其转染效率非常低(转染效率20％左右)，导致结果不稳定。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种简便、快速、高效的用于筛选Nrf2激活剂的重组质粒及其构建方法和用途，从而实现了对能否激活Nrf2通路的抗氧化剂进行高通量的筛选和比较，以及长期效应的检测，而且检测灵敏度可靠、稳定。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

提供用于筛选Nrf2激活剂的重组质粒，所述重组质粒包含一个或两个以上相互串联的抗氧化反应元件以及基础转录元件、分泌型荧光素酶基因、分泌型碱性磷酸酶基因；所述抗氧化反应元件为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

其中，所述基础转录元件包含SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

其中，所述分泌型荧光素酶基因是源于Gaussia princeps的分泌型荧光素酶基因。

其中，所述源于Gaussia princeps的分泌型荧光素酶基因包含其野生型序列以及SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

其中，所述分泌型碱性磷酸酶基因包含SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

其中，所述重组质粒还包含有抗性基因。

其中，所述抗性基因选自新霉素抗性基因或嘌呤霉素抗性基因或潮霉素抗性基因。

本发明还提供上述重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)在含有分泌型荧光素酶基因和含有CMV启动子序列的分泌型碱性磷酸酶质粒中，将基础转录元件通过分子克隆技术构建到分泌型荧光素酶基因的上游；

(2)通过分子克隆技术将一个或两个以上相互串联的抗氧化反应元件构建到步骤(1)获得的质粒的基础转录元件的上游，从而获得重组质粒；

(3)将步骤(2)获得的重组质粒转染至体外培养的细胞中，然后加入含有TBHQ或者SF培养基，对细胞刺激诱导，继续培养2-24h后，取出培养基上清，然后加入荧光素酶检测试剂，检测荧光素酶活性，选出对TBHQ或者SF诱导响应最高的质粒即为所述用于筛选Nrf2激活剂的重组质粒。

本发明还提供上述重组质粒在筛选抗氧化剂中的应用。

本发明还提供上述重组质粒筛选抗氧化剂的方法，包括以下步骤：

(1)将所述重组质粒转染到细胞，然后加入待筛选的药物，继续培养2-24h；

(2)取出培养基上清，加入荧光素酶检测试剂反应5～15min，然后检测荧光素酶的相对活性，若随待筛选的药物浓度增加，荧光素酶的相对活性也增加，则判定该药物具有抗氧化活性。

本发明的有益效果是：

本发明的重组质粒包含一个或两个以上相互串联的抗氧化反应元件以及基础转录元件、分泌型荧光素酶基因、分泌型碱性磷酸酶基因和抗性基因；所述抗氧化反应元件为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。该重组质粒通过将抗氧化反应元件中的核心保守序列(SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列)置于基础转录元件的上游，并以分泌型荧光素酶基因作为报告基因和以分泌型碱性磷酸酶作为内参基因。与现有的技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)与现有技术采用萤火虫荧光素酶等作为报告基因相比，本发明采用分泌型荧光素酶作为报告基因，该酶在多种哺乳动物细胞中进行高效的分泌表达，其检测灵敏度是萤火虫荧光素酶的1000倍以上，灵敏性好，线性范围宽，在哺乳动物中基本没有内源性活性，而且后续检测荧光素酶基因活性时无需裂解细胞，只需要取转染细胞后的培养基上清即可进行荧光素酶基因活性检测，可以直接在96孔板内进行，非常适合高通量应用，大大简化了操作步骤，检测更加方便快捷，从而实现长期活性的监测；

(2)本发明的重组质粒载体包含了新霉素抗性基因，在转染细胞后可通过在培养基中加入G418抗生素进行筛选培养，从而获得稳定转染的细胞。

(3)本发明为筛选抗氧化剂或检测抗氧化剂活性提供了一种高效、快速、简便的方法，也为研究一些抗氧化剂机制提供了方便，可应用于具有抗氧化作用天然药物和人工合成的化合物的筛选，亦可用从天然药物中筛选具有抗氧化作用的有效成分。

附图说明

图1是实施例1的重组质粒的图谱结构图。

图2是实施例1的1个抗氧化反应元件的测序结果图。

图3是实施例1的2个串联的抗氧化反应元件的测序结果图。

图4是实施例1的4个串联的抗氧化反应元件的测序结果图。

图5是实施例1的8个串联的抗氧化反应元件的测序结果图。

图6是实施例2的p1XARE-ML-Gluc-AP-Puro、p2XARE-ML-Gluc-AP-Puro、p4XARE-ML-Gluc-AP-Puro、p8XARE-ML-Gluc-AP-Puro重组质粒对抗氧化剂SF和tBHQ的反应性结果图。

图7是实施例2的p1XARE-CV-Gluc-AP-Puro、p2XARE-CV-Gluc-AP-Puro、p4XARE-CV-Gluc-AP-Puro、p8XARE-CV-Gluc-AP-Puro重组质粒对抗氧化剂SF和tBHQ的反应性结果图。

图8是实施例3的已知Nrf2激活剂不同作用时间的反应活性图。

具体实施方式

结合以下实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：重组质粒的构建方法

(一)实验材料

质粒、菌株和细胞HaCaT细胞，分泌型荧光素酶载体，大肠杆菌质粒(购自上海中国科学院细胞研究所)。

试剂：Secrete-Pair Dual Luminescence Assay Kit(购自Genecopoeai公司)；lipofec3000脂质体(购自Invitrogen公司)。

设备：Infinite F200Pro多功能酶标仪(购自TECAN公司)，UV灯管(购自Philips公司)。

(二)实验步骤

本实施例以源于Gaussia princeps的分泌型荧光素酶(Gaussia Luciferase，Gluc)为报告基因，通过筛选抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)，构建易检测、高灵敏和高稳定性的Nrf2信号通路激活的报告系统，具体步骤如下：

(1)将编码分泌型碱性磷酸酶(如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列)的cDNA用PCR扩增，在5'末端带上CMV启动子序列，在其3'末端带上polyA序列，然后插入经过AgeI-PmeI限制性内切酶消化的带有Puromcin抗性基因的pPuro质粒中，获得pAP-Puro质粒；

(2)将编码Gaussia princeps的分泌型荧光素酶(如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列)的cDNA用PCR扩增，在其3'末端带上SV40polyA序列，然后插入经过HindIII-AgeI限制性内切酶消化的pAP-Puro质粒，获得pGluc-AP-Puro质粒；

(3)人工合成基础转录元件mini-ML(如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列)和mini-CV(如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列)，并在其5′端和3′端分别带有XhoI和HindIII酶切位点，随后插入到经过XhoI-HindIII限制性内切酶消化的pGluc-AP-Puro质粒中，获得pML-Gluc-AP-Puro质粒和pCV-Gluc-AP-Puro质粒；

(4)人工合成单链DNA片段：

分别构建串联1个、2个、4个和8个抗氧化反应元件的分泌型荧光素酶的ARE/Gluc克隆，同时以SV40启动子驱动的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)作为内参报告基因。在EcoRI片段和XhoI片段之间分别串联了1个、2个、4个、8个抗氧化反应元件。每个抗氧化反应元件的3’端引物序列如表1所示。

表1.抗氧化反应元件的3’端引物序列

(5)将1ARE PF+1ARE PR；2ARE PF+2ARE PR；4ARE PF+4ARE PR；8ARE PF1+8ARE PF2+8ARE PR1+8ARE PR2分别进行褪火，获得不同数目(1,2,4,8个)的抗氧化反应元件串联序列；

(6)将不同数目(1,2,4,8个)的抗氧化反应元件串联序列插入到经EcoRI-XhoI消化pML-Gluc-AP-Puro质粒和pCV-Gluc-AP-Puro质粒中，获得p1XARE-ML-Gluc-AP-Puro、p2XARE-ML-Gluc-AP-Puro、p4XARE-ML-Gluc-AP-Puro、p8XARE-ML-Gluc-AP-Puro；p1XARE-CV-Gluc-AP-Puro、p2XARE-CV-Gluc-AP-Puro、p4XARE-CV-Gluc-AP-Puro、p8XARE-CV-Gluc-AP-Puro，图谱结构如图1所示；

(7)提取质粒DNA后进行测序，1，2，4，8个抗氧化反应元件串联序列测序结果分别如图2至图5所示，其中：

1个抗氧化反应元件为SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列(见图2)；

2个串联的抗氧化反应元件为SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列(见图3)；

4个串联的抗氧化反应元件为SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列(见图4)；

8个串联的抗氧化反应元件为SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列(见图5)；

实施例2：用已知的Nrf2激活剂鉴定实施例1的重组质粒在细胞内的反应性

(1)HaCaT细胞在补充了100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清的DMEM培养基中、在含5％CO2的气氛下、在37℃下培养，用Life Technologies公司(Carlsbad,CA,USA)购买的Lipofectamine 2000试剂按推荐流程用于实施例1制备的重组质粒转染细胞；

(2)转染24h后，更换含有SF(10uM)和tBHQ(20uM)的新鲜培养基，继续培养24h；

(3)取100ul培养基上清，用于荧光素酶活性检测。各报告物活性的测定使用Genecopoeai公司的Secrete-Pair Dual Luminescence Assay Kit和采用TECAN公司Infinite F200Pro多功能酶标仪，按照其化学发光测量办法，测定荧光素酶(Gluc)和碱性磷酸酶(AP)的活性；

(4)以AP作为内部对照，先以实施例1的各重组质粒转染细胞上清的Gluc活性读数除以AP活性读数，计算出比值。当以ML序列作为基础转录序列时，以没有插入ARE元件的ML空载体(ML-Vehicle)的比值设为1，然后计算出在其前分别插入1，2，4和8个ARE元件的诱导倍数，其结果是以3次实验的平均±SD表示，结果见图6；当以CV序列作为基础转录序列时，以没有插入ARE元件的CV空载体(ML-Vehicle)的比值设为1，然后计算出在其前分别插入1，2，4和8个ARE元件的诱导倍数，其结果是以3次实验的平均±SD表示，结果见图7。从图6和图7的结果可以看出，随着多个串联ARE元件的插入，在Nrf2激活剂诱导下，Gluc相对活性也随之增加，8个串联ARE元件的Gluc相对活性最大。

实施例3：用实施例1的重组质粒检测已知的Nrf2激活剂不同作用时间的反应活性以及筛选抗氧化剂的应用

1.重组质粒用于检测已知的Nrf2激活剂不同作用时间的反应活性

(1)HaCaT细胞细胞在补充了100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清的DMEM培养基中、在含5％CO2的气氛下、在37℃下培养，用Life Technologies公司(Carlsbad,CA,USA)购买的Lipofectamine 2000试剂按推荐流程用于实施例1的p8XARE-ML-Gluc-AP-Puro质粒转染细胞；

(2)转染24h后，更换含有SF(10uM)和tBHQ(20uM)的新鲜培养基，然后于0、6、24h取100ul培养基上清，用于荧光素酶(Gluc)的活性检测。

(3)已知Nrf2激活剂不同作用时间的反应活性的测定，使用Genecopoeai公司的Secrete-Pair Dual Luminescence Assay Kit和采用TECAN公司Infinite F200Pro多功能酶标仪，按照其化学发光测量办法，测定Gluc和AP活性；以AP作为内部对照，以实施例1的重组质粒转染细胞上清的Gluc活性读数除以AP活性读数，计算出比值，结果见图8。从图8的结果可以看出，SF(10uM)和tBHQ在处理6h是作用最强。

2.重组质粒用于筛选抗氧化剂的方法

将实施例1的重组质粒转染细胞后，加入待筛选的药物，5％CO2，37℃培养24h后，取细胞上清，然后并加入荧光素酶检测试剂，检测荧光素酶的相对活性，若随待筛选的药物浓度增加，荧光素酶的相对活性也增加，则说明该药物为抗氧化剂。

本发明为筛选抗氧化剂或检测抗氧化剂活性提供了一种高效、快速、简便的方法，也为研究一些抗氧化剂机制提供了方便，可应用于具有抗氧化作用天然药物和人工合成的化合物的筛选，亦可用从天然药物中筛选具有抗氧化作用的有效成分。

最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。