一种新疆野苹果miR156表达量的检测方法与流程

本发明属于植物基因
技术领域：
，尤其是一种新疆野苹果miR156表达量的检测方法。
背景技术：
：新疆野苹果(Malussieversii(Ledeb.)Roem.)又名塞威氏苹果，是蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)的多年生野生果树，在我国主要分布在新疆的伊犁地区。新疆野苹果地处西部山区，受环境影响，在花期和果期经常会遇到干旱、低温、酷热等不良环境的影响，从而导致花粉败育、结实率低，进而影响下一年实生苗的繁殖与发育，从而严重影响整个新疆野苹果林的种群结构。MiR156与植物的生长发育相关，尤其在营养生长和生殖生长的时相转变调控中起到关键作用，因此，采用合适的方法检测不同发育时期以及不同生长特性新疆野苹果的miR156表达量，对后期新疆野苹果杂交育种、遗传改良实践具有重要意义。通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种新疆野苹果miR156表达量的检测方法，本方法为首次对新疆野苹果小RNA提取的新方法，该方法可以为检测木本植物小RNA表达情况提供参考，对研究营养生长和生殖生长时相转变调控网具有参考意义，同时，也可以为后期新疆野苹果杂交育种、遗传改良实践提供理论依据。本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：一种新疆野苹果miR156表达量的检测方法，步骤如下：(一)总RNA提取总RNA采用CTAB法提取，具体步骤如下：⑴取不同树龄的新疆野苹果的叶片或愈伤组织，将其在液氮中充分研磨成粉状；⑵取粉末置于加有裂解液1的离心管中，粉末与裂解液1的比例g：μL为1：8000，涡旋混匀，60-70℃温育8-15min，期间上下颠倒混匀2-3次；所述裂解液1的组成成分及比例如下：100mMpH8.0Tris-HCl；25mMEDTA；2MNaCl；质量终浓度为2％的CTAB；质量终浓度为2％的PVP；质量终浓度为0.5％的spermidine；体积终浓度为2％的β-mercaptoethanol；⑶再加入三氯甲烷，三氯甲烷与裂解液1的体积比为1：1，涡旋混匀，室温放置5min；⑷13000rpm4℃离心10min；⑸吸上清于新的离心管中，加入上清体积1/5的三氯甲烷，涡旋混匀，室温放置5-10min；⑹10000-13000rpm4℃离心13-18min，吸上清于新的离心管中，加入上清两倍体积的异丙醇，轻柔混匀；⑺10000-13000rpm4℃离心13-18min,弃上清，得沉淀；⑻加入17μLRNase-FreeWater于离心管中，加入10×DNaseI缓冲液2μL，DnaseI1μL，37℃温浴10-20min；⑼加入总体积两倍体积的异丙醇，10000-13000rpm4℃离心13-18min，弃上清，使用质量分数为80％的乙醇清洗沉淀2-3次；⑽待乙醇完全挥发后，加入30-50μLRNase-FreeWater，即得总RNA，将总RNA立即电泳检测，检测质量合格后，备用；(二)反转录(A)反转录的总RNA质量为1μg，体系为10μL，内参基因的反转录为polyA加尾法，miR156反转录为颈环引物法，引物如下：⑴内参基因反转录体系：⑵miR156反转录体系：(B)将混合物进行70-80℃、5-8min预变性，完成后取出置于冰上；待其冷却后，迅速离心，转速500-3000r/min，离心20s，，将液体全部收集于管底；(C)配制反转录体系，向每个样品加入以下10μL：(D)设置反转录程序，包括退火、延伸、逆转录酶失活三步：该程序完成后，得到完整cDNA；(三)qRT-PCR检测：(A)试剂：SYBRGreen混合液；(B)仪器：定量PCR仪；(C)2个内参基因，1个目的基因，引物如下：(D)qRT-PCRR体系，将cDNA模板稀释2倍使用：(E)反应程序：+熔解曲线；(四)对qRT-PCR获得的数据进行法分析，在excel表中作柱状图，得到目的基因新疆野苹果miR156的相对表达量。而且，所述步骤(一)⑴中不同树龄为生长1年、2年、3年、5年、6年或者几十年；或者，所述步骤(一)⑴中叶片为新疆野苹果的新生当年生枝条距顶端10cm的叶片；或者，所述步骤(一)⑴中愈伤组织为：取新疆野苹果的当年生枝条，取叶片进行组织培养获得的愈伤组织。而且，所述步骤(三)(D)中cDNA模板稀释2倍后，每个样做三个重复。而且，所述步骤(一)⑴中新疆野苹果生长于新疆维吾尔自治区伊犁新源野果林。本发明取得的优点和积极效果是：1、本方法为首次对新疆野苹果小RNA提取的新方法，该方法可以为检测木本植物小RNA表达情况提供参考，对研究营养生长和生殖生长时相转变调控网具有参考意义，同时，也可以为后期新疆野苹果杂交育种、遗传改良实践提供理论依据。2、本方法以Ms-Actin和Ms-18SrRNA为内参基因，利用qRT-PCR检测新疆野苹果miR156表达量，将不同树龄新疆野苹果的叶片或愈伤组织提取总RNA，PolyA加尾法和颈环引物法反转RNA获得cDNA，完成实时荧光定量PCR，方便简单、操作方便，提高了检测效率。3、本方法确定了miR156的最佳反转录条件及体系；确定了两个稳定性较强的内参基因序列及引物序列；明确了miR156定量表达检测的最适合条件及体系；发现了新疆野苹果愈伤组织使用此方法可以提取总RNA；确定了保存时间在两年以上的叶片材料仍可以提取出较完整的RNA。附图说明图1为本发明中RNA纯度质量检测结果图；图2为本发明中不同年份的野苹果材料的miR156的表达量分析图(其中，横坐标为野苹果材料的不同年份，纵坐标为miR156的相对表达量)。具体实施方式下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。实施例1一种新疆野苹果miR156表达量的检测方法，步骤如下：利用CTAB法提取新疆野苹果叶片和愈伤组织总RNA，PolyA加尾法和颈环引物法反转RNA获得cDNA，2倍稀释cDNA模板后(最好每个样共取6μLcDNA做三个技术重复)，进行实时荧光定量PCR。具体步骤如下：(一)总RNA提取总RNA采用CTAB法提取，具体步骤如下：1、取不同树龄的新疆野苹果的叶片或愈伤组织，将其在液氮中充分研磨成粉状。2、取0.1g粉末置于加有800μL裂解液1的离心管中，涡旋混匀，65℃温育10min，期间上下颠倒混匀2-3次。其中，所述裂解液1的组成成分及比例如下：100mMpH8.0Tris-HCl；25mMEDTA；2MNaCl；质量终浓度为2％的CTAB；质量终浓度为2％的PVP(聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinylpyrrolidone)；质量终浓度为0.5％的spermidine(三盐酸亚精胺)；体积终浓度为2％的β-mercaptoethanol(β-巯基乙醇)；3、再加入800μL三氯甲烷，涡旋混匀，室温放置5min。4、13000rpm4℃离心10min；5、吸上清于新的离心管中，加入上清体积1/5的三氯甲烷，涡旋混匀，室温放置5min。6、13000rpm4℃离15min，吸上清于新的2ml离心管中，加入上清两倍体积的异丙醇，轻柔混匀。7、10000-13000rpm4℃离13-18min,弃上清；8、加入17μL的RNase-FreeWater于离心管中，加入10×DNaseI缓冲液2μL，DnaseI1μL，37℃温浴15min；9、加入总体积两倍体积的异丙醇，10000-13000rpm4℃离心13-18min，弃上清，使用质量分数为80％的乙醇清洗2-3次；10、待乙醇完全挥发后，加入30-50μLRNase-FreeWater，即得总RNA，将总RNA立即电泳检测，检测质量合格后，备用；RNA质量检测标准如下：取所提取的RNA溶液1μL，于nanodrop微量分光光度计中测定OD吸光值及浓度，当OD260/280比值介于1.8-2.0之间时，说明RNA中污染蛋白等物质较少，OD260/230比值大于1.8时，说明无机盐离子较少，RNA纯度适合后续实验。取4μLRNA溶液电泳检测完整性，当检测图如图1所示，获得完整锐利的28s和18srRNA条带，且28srRNA的亮度大于等于18srRNA的两倍时，所提取总RNA完整度较好。(二)反转录(A)反转录的总RNA质量为1μg，体系为10μL，内参基因的反转录为polyA加尾法，miR156反转录为颈环引物法。引物如下：1、内参基因反转录体系：2、miR156反转录体系：(B)将混合物进行70℃、5min预变性，完成后取出置于冰上。待其冷却后，迅速离心，转速500-3000r/min，离心20s，将液体全部收集于管底。(C)配制反转录体系，向每个样品加入以下10μL：(D)设置反转录程序，包括退火、延伸、逆转录酶失活三步。该程序完成后将得到完整cDNA。(若需保存，可放－20℃)(三)qRT-PCR检测：(A)试剂：SYBRGreen混合液(SYBRGreenPCRMasterMix)(B)仪器：定量PCR仪(C)2个内参基因，1个目的基因，引物如下：Malus×domesticaactin-FGTCCGTGGAGAAGAGTTACMalus×domesticaactin-RATGGATGGCTGGAAGAGG18SrRNA-FATAAACGATGCCGACCAG18SrRNA-RCCTTGCGACCATACTCCCmiR156-FAGAAGACAGTGGGTCGACCTCACAmiR156-RAACTGGTGTCGTGGAG(D)qRT-PCRR体系：(将cDNA模板稀释2倍使用，)(E)反应程序：+熔解曲线；(四)对qRT-PCR获得的数据进行法分析，在excel表中作柱状图，得到目的基因新疆野苹果miR156的相对表达量。上述新疆野苹果生长于新疆维吾尔自治区伊犁新源野果林，待新疆野苹果植株生长1年、2年、3年、5年、6年甚至几十年，分别取其新生当年生枝条距顶端10cm左右的叶片至液氮中，或取当年生枝条带回实验室处理，取叶片进行组织培养获得愈伤组织。CTAB法提取组织总RNA检测质量合格后，进行反转录(PolyA加尾法和颈环引物法)获得cDNA模板，2倍稀释cDNA模板后可以每个样共取6μLcDNA做三个技术重复，完成实时荧光定量，进行数据分析得到目的基因的相对表达量。分析结果如图2所示，由图2可以看出，不同年份的野苹果材料，miR156的表达量随年份变化而呈现不同的表达水平。实施例2一种新疆野苹果miR156表达量的检测方法，步骤如下：(一)总RNA提取总RNA采用CTAB法提取，具体步骤如下：⑴取不同树龄的新疆野苹果的叶片或愈伤组织，将其在液氮中充分研磨成粉状；⑵取粉末置于加有裂解液1的离心管中，粉末与裂解液1的比例g：μL为1：8000，涡旋混匀，60-70℃温育8-15min，期间上下颠倒混匀2-3次；所述裂解液1的组成成分及比例如下：100mMpH8.0Tris-HCl；25mMEDTA；2MNaCl；质量终浓度为2％的CTAB；质量终浓度为2％的PVP；质量终浓度为0.5％的spermidine；体积终浓度为2％的β-mercaptoethanol；⑶再加入三氯甲烷，三氯甲烷与裂解液1的体积比为1：1，涡旋混匀，室温放置5min；⑷13000rpm4℃离心10min；⑸吸上清于新的离心管中，加入上清体积1/5的三氯甲烷，涡旋混匀，室温放置5-10min；⑹10000-13000rpm4℃离心13-18min，吸上清于新的离心管中，加入上清两倍体积的异丙醇，轻柔混匀；⑺10000-13000rpm4℃离心13-18min,弃上清，得沉淀；⑻加入17μLRNase-FreeWater于离心管中，加入10×DNaseI缓冲液2μL，DnaseI1μL，37℃温浴10-20min；⑼加入总体积两倍体积的异丙醇，10000-13000rpm4℃离心13-18min，弃上清，使用质量分数为80％的乙醇清洗沉淀2-3次；⑽待乙醇完全挥发后，加入30-50μLRNase-FreeWater，即得总RNA，将总RNA立即电泳检测，检测质量合格后，备用；其检测结果同实施例1；(二)反转录(A)反转录的总RNA质量为1μg，体系为10μL，内参基因的反转录为polyA加尾法，miR156反转录为颈环引物法，引物如下：⑴内参基因反转录体系：⑵miR156反转录体系：(B)将混合物进行70-80℃、5-8min预变性，完成后取出置于冰上；待其冷却后，迅速离心，转速500-3000r/min，离心20s，将液体全部收集于管底；(C)配制反转录体系，向每个样品加入以下10μL：(D)设置反转录程序，包括退火、延伸、逆转录酶失活三步：该程序完成后，得到完整cDNA；(三)qRT-PCR检测：(A)试剂：SYBRGreen混合液；(B)仪器：定量PCR仪；(C)2个内参基因，1个目的基因，引物如下：Malus×domesticaactin-FGTCCGTGGAGAAGAGTTACMalus×domesticaactin-RATGGATGGCTGGAAGAGG18SrRNA-FATAAACGATGCCGACCAG18SrRNA-RCCTTGCGACCATACTCCCmiR156-FAGAAGACAGTGGGTCGACCTCACAmiR156-RAACTGGTGTCGTGGAG(D)qRT-PCRR体系，将cDNA模板稀释2倍使用：(E)反应程序：+熔解曲线；(四)对qRT-PCR获得的数据进行法分析，在excel表中作柱状图，得到目的基因新疆野苹果miR156的相对表达量。而且，所述步骤(一)⑴中不同树龄为生长1年、2年、3年、5年、6年或者几十年；或者，所述步骤(一)⑴中叶片为新疆野苹果的新生当年生枝条距顶端10cm的叶片；或者，所述步骤(一)⑴中愈伤组织为：取新疆野苹果的当年生枝条，取叶片进行组织培养获得的愈伤组织。而且，所述步骤(三)(D)中cDNA模板稀释2倍后，每个样做三个重复。而且，所述步骤(一)⑴中新疆野苹果生长于新疆维吾尔自治区伊犁新源野果林。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术方案作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明的技术方案的范围内。当前第1页1 2 3