高效净化养殖污水的解淀粉芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术和养殖水环境改良技术领域，具体涉及一种高效净化养殖污水的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Am11及其应用。

背景技术：

近年来，中国的水产养殖朝着高密度、集约化、规模化和名优化的方向发展，形成了高生物负载量和高投入量的养殖模式。在高投入高产出的模式下，养殖密度超过了水体容量，大量的残剩饵料、肥料和生物代谢产物累积，使得水体自净能力下降，水体富养化显著，养殖水体的自身污染日益严重。剩余的饵料、养殖生物的排泄物加上浮游生物的尸体残骸等的积累超过了水体的自净能力，使得有机物不能彻底分解而沉淀在底部，水体中厌氧分解层不断增厚，导致水体富营养化，氨氮、亚硝酸盐等有害物质的积累，从而毒害养殖生物，诱发各类水产疾病，并且水产品的品质也不断下降。

原位生物修复是最能表现生物修复方法特点和优点的方法，与传统的环境治理方法有本质的区别。向实行生物恢复的场所引入新的外来微生物，以建立新的微生物群落，改变土著微生物的低生物降解性能，获得对某类污染物质具有高降解性能的新的微生物群落，引入微生物是原位生物恢复技术的核心部分。引入新的具有某些特殊的功能的微生物才是该技术的生命力的所在。通过某种手段培育和训化出一些对某种污染物质具有特殊降解能力的菌种，然后将这些菌种引入到实施生物降解的目标地带，继续发挥其对该类污染物质的特有降解作用。

芽孢杆菌(Bacilus sp.)能够分泌具有较高活性的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等消化酶，可以高效降解残饵中蛋白质和淀粉，能够减少氨氮(NH₄⁺-N)、亚硝酸盐氮(NO₂-N)、H₂S等有害物质，高效降解有机污染物，抑制有害微生物的繁殖，有效的改善养殖生态环境促进水环境良性循环，并且微生态制剂具有成本低、收效大等优点，是目前水环境污染治理的研究热点。并且能在不利的环境中以芽孢的形式存在，具有耐高温、耐酸碱性能，易于储藏及运输，作为饲料微生态添加剂和水体微生态修复改良剂都有广阔前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高效净化养殖污水的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Am11及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种高效净化养殖污水的解淀粉芽孢杆菌，菌株为解淀粉芽孢杆菌Am11(Bacillus amyloliquefaciens Am11)已于2016年2月1日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.12123。

一种高效净化养殖污水的解淀粉芽孢杆菌，所述菌株在用于生物修复改善水产养殖环境中的应用。

一种解淀粉芽孢杆菌微生物制剂，生物制剂为将所述解淀粉芽孢杆菌Am11经发酵所得发酵物。

具体为：将解淀粉芽孢杆菌Am11于营养琼脂培养基中活化培养后以接种环接种再次接种到新鲜营养琼脂培养基中获得固体种子；

将上述获得固体种子以3wt％接种量接种至种子培养液中37℃，培养12h,培养后再以1wt％接种至发酵培养基中以37℃、150rpm扩大培养24h；

将上述发酵培养后培养液升温至50-60℃，而后加入固体氯化钙和磷酸氢二钠各0.3wt％，搅拌混匀后再加入3wt％硅藻土，板框压滤；将滤饼干燥，干燥的菌体颗粒粉碎后，即得到微生物制剂。

一种解淀粉芽孢杆菌微生物制剂的应用，所述制剂作为水体净化制剂，在原位生物修复改善水产养殖环境中的应用。

本发明所具有的的优点：

本发明新型解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Am11具有明显的净化水体的作用，可广泛应用于水产养殖行业，减少抗生素的使用，从而减轻水体污染，增加养殖户的效益，可作为用于原位生物修复能够改善水产养殖环境的解淀粉芽孢杆菌。

解淀粉芽孢杆菌Am11对饵料溶解物中蛋白、淀粉和CODMn的降解利用率在48h时趋于稳定，降解率分别为57％，52％，55％；该菌处理养殖污水24h后氨氮和亚硝酸盐含量降低至很低水平，降解率分别达到了95％和97％。改善养殖水质，不但增强水产动物的免疫力和抗病能力，还能减轻养殖污水中有机物污染源的排放，保证优良的养殖水域生态环境从而促进水产养殖行业的健康发展。

附图说明

图1为本发明实施例提供的不同因素对菌株A11产蛋白酶活力的影响图，其中，(a)培养温度对菌株产蛋白酶活力的影响，(b)不同pH值对酶活力的影响，(c)接种量对酶活力的影响，(d)不同NaCl浓度对产酶活力的影响。

图2为本发明实施例提供的采用本发明菌株A11对残饵降解率的效果图。

图3为本发明实施例提供的采用本发明菌株A11对氨盐和亚硝酸盐的降解图。

具体实施方式

实施例1通过蛋白酶活性对菌株的筛选与鉴定

1、筛选

(1)从潍坊市潍北六场水产养殖户的污水沟中取泥样50mL，80℃水浴15min，杀灭非芽孢菌；稀释后，将样品涂布于营养琼脂培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4)平板，37℃，培养24h；挑选典型芽孢杆菌菌落在营养琼脂培养基平板上划线，37℃，培养24h。

(2)产蛋白酶菌株的初筛：挑取少量菌落，接种到种子培养液(蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4)中，35℃、180r/min恒温培养24h，按照10倍稀释法将增殖菌悬液稀释成不同梯度(取100μL增值菌悬液，加入900μL无菌水，制成10^-1的稀释液。取100μL 10-¹的稀释液，加入900μL无菌水，制成10^-2的稀释液。以此类推，按照10倍稀释法适当稀释成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10等不同梯度的稀释液)后，吸取10^-8、10^-9、10^-10的不同梯度的稀释液各0.1ml依次均匀涂布于蛋白酶筛选培养基(酪蛋白10g，酵母粉3g，Na₂HPO₄·12H₂O 5g，NaCl 5g，溴麝香草酚蓝0.05g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4)平板上。恒温培养24～48h，测量水解圈的直径(D)和菌落的直径(d)，根据D/d的比值大小来判断菌株产酶的能力，筛选出产蛋白酶稳定并且酶活力高的菌株。

(3)产蛋白酶菌株的复筛：将初筛选取的菌株接种到液体培养基(蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4)中，35℃、180r/min恒温培养24h，取适量发酵液，10000r/min离心15min，上清液为粗酶液，测定粗酶液的蛋白酶活力，结合水解圈与菌落直径的比值(D/d)进行产蛋白酶菌株的复筛，于35℃恒温发酵培养，测定蛋白酶活力达到187U/ml，菌株即为解淀粉芽孢杆菌Am11(Bacillus amyloliquefaciens Am11)。

解淀粉芽孢杆菌Am11(Bacillus amyloliquefaciens Am11)进行保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2016年2月1日，保藏号为CGMCC NO.12123，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2、菌株鉴定

(1)菌落形态和菌体形态观察：将制备的菌悬液稀释适当倍数，均匀涂布于营养琼脂平板上，35℃恒温培养48h，观察单菌落形状、 大小、颜色、边缘、表面、透明度等。将菌株进行革兰氏染色，在油镜下观察菌体形态。

(2)生理生化特征：各项生理生化试验具体方法参考《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》以及相关微生物试验教程。

(3)菌种鉴定与系统进化分析：采用16SrDNA直接测序法进行分子生物学鉴定。PCR扩增采用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3’)和1492R(5’-CGGCTACCTTGTTACGAC-3’)。经0.8％的琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像分析仪观察PCR扩增产物并保存图像，PCR产物送北京华大基因测序。得到测序结果后登陆NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，在GenBank数据库中进行BLAST比对分析，寻找并下载与实验菌株亲缘关系较近的序列。使用MEGA 6软件的UPGMAM法生成系统发育树，以确定菌株的分类地位。

3、结果分析

(1)上述获得菌株Am11所产蛋白酶的酶活较高。以此，对该株菌进行进一步的研究。复筛结果显示菌株Am11所产蛋白酶的酶活力最强，酶活力达到187U/ml。

(2)Am11菌株在固体培养基上生长24h后，菌落形态为：边缘不整齐，表面粗糙，不透明，干燥，有隆起，菌落呈现浅黄色，液体培养时会有菌膜形成。通过革兰氏染色，菌株Am11呈现紫色，为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状。

(3)菌株Am11的生理生化试验结果所示，H₂O₂酶试验、V-P(伏-普)试验、酪素水解试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、硝酸盐还原试验、丙二盐试验均呈阳性，MR(甲基红)试验、海藻酸钠降解试验、Tween80降解试验、丙酸盐试验、吲哚试验、卵黄卵磷脂试验、H₂S试验、苯丙氨酸脱氢酶试验均呈阴性，可以利用D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇进行发酵，能够在较大的温度范围内生长，并且耐受10％的NaCl溶液。菌株Am11的生理生化特征与《伯杰氏细菌鉴定手册》中芽孢杆菌属特征相符，确定菌株Am11属于芽孢杆菌属(Bacilus)。

(4)以细菌为模板，菌株Am11进行16S rDNA序列扩增，PCR产物经过0.8％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下显示图像，检测出引物扩增出的序列大约在1500bp处存在荧光条带，符合常规的16S rDNA序列长度。PCR产物经过测序表明，16S rDNA扩增的序列全长为1419bp，其序列如下所示：

TGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGT CTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCC

(a)序列特征：

●长度：1419

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：解淀粉芽孢杆菌Am11(Bacillus amyloliquefaciensAm11)

将上述16S rDNA序列进行比对，确认该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名为解淀粉芽孢杆菌Am11(Bacillus amyloliquefaciensAm11)。

实施例2解淀粉孢杆菌产酶条件及酶活性质的评估

1、菌株的生长曲线和产酶曲线

将菌株Am11接种于液体培养基(蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4)中，35℃、180r/min培养。每隔2h取样，连续取6次，再每隔12h，取样，共取72h，测OD_600nm来绘制菌株生长曲线，同时对每次取样的菌液以10 000r/min离心，取上清液测定蛋白酶活性，绘制产酶曲线，以确定菌株的最高产酶量、最高产酶时间及产酶随时间的变化关系。

2、影响菌株产蛋白酶能力的因素

(1)种子液的制备：在超净台中，用接种环刮取适量保存在斜面培养基上的菌体Am11，接种到种子培养液(蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4)中，在恒温摇床，35℃、180r/min，培养12h，制成种子液。

(2)分别探究在上述种植培养过程中不同温度(15℃，25℃，35℃，45℃，55℃)，不同初始pH(5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)，不同接种量(1％，3％，5％，8％，10％)和不同NaCl浓度(1％，3％，5％，8％，10％)对菌株产蛋白酶能力的影响。

3、结果分析

(1)当培养到12-15h时菌株达到了对数生长期，菌体生长相对较旺盛，但是酶活比较低；随着稳定期的到来，酶活升高，在培养36-48h后，酶活达到了最高；随着次生代谢产物的增加，菌株生长进入了衰亡期，酶活也逐渐下降。从细菌生长曲线分析可得，细菌产酶主要在对数生长期，此时细菌繁殖速度下降；稳定期后期，酶活达到了最高，此时应该是收获酶的时期。

(2)温度对菌株产蛋白酶能力的影响，当温度在25℃-35℃之间时，蛋白酶酶活力随温度的增加而升高；当温度高于35℃时，酶活力逐渐下降；在35℃发酵时，测得的蛋白酶酶活最高，因此，确定35℃作为发酵培养时的适宜温度。

(3)初始pH值对菌株产蛋白酶能力的影响，当初始pH在7.0-7.5之间时，菌株所产蛋白酶酶活力随pH的增大而增高；当初始pH高于8.5时，Am11菌株酶活力下降，pH高于8.5时，说明Am11菌株没有较强的耐碱性。初始pH为7.5时，测得菌株的蛋白酶酶活力最高，因此，确定7.5作为发酵培养时的初始pH。

(4)接种量对菌株产蛋白酶能力的影响，Am11菌株在接种量为8％时，酶活力达到最高，Am23菌株在接种量为5％时，酶活力达到最高。

(5)NaCl浓度对菌株产蛋白酶能力的影响，随着NaCl浓度的增大，菌株Am11所产蛋白酶活力也随之下降，当NaCl浓度高于8％时，蛋白酶活力明显下降，当NaCl浓度位3％，蛋白酶活性位初始酶活性的93％，说明菌株Am11能适应3％盐度(一般海水的盐度)的环境(参见图1)。

实施例3解淀粉孢杆菌微生物制剂的制备

1、制备斜面菌种：在营养琼脂培养基上划线接种上述解淀粉芽孢杆菌Am11，37℃，培养12h；

2、制备固体种子：将步骤1制备的斜面菌种接种至茄瓶新鲜营养琼脂斜面(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4)，37℃，培养12h；

3、制备液体种子：将步骤2制备的固体种子从茄瓶斜面洗下接种至250L种子罐，接种量为0.5％，37℃，培养12h，种子罐中培养基的组分及其所占重量比分别为：豆饼粉2.5％，玉米浆2％，磷酸氢二钠0.1％，硫酸铵0.05％，硫酸锰0.05％，余量为水；

4、发酵培养：将种子罐中的种子接种到5吨发酵罐中培养，接种量5％，37℃，150rpm，培养20h，发酵罐中培养基的组分及其所占重量比分别为：豆粕4％，玉米粉2％，硫酸锰0.05％，硫酸镁0.05％，余量为水；

5、压滤：将发酵液升温至50℃，加入固体氯化钙和磷酸氢二钠各0.3％(w/v)，搅拌30min后转入储罐，加入发酵液3％(w/v)的硅藻土，板框压滤；

6、烘干：将滤饼在沸腾干燥机中干燥，进风口温度90℃，出风口温度50℃，干燥15s；

7、粉碎：干燥的菌体颗粒粉碎后，过40目筛，即得到上述解淀粉芽孢杆菌制剂。

实施例4解淀粉孢杆菌对养殖水体的净化作用

1、Am11菌株对残饵降解能力

将活化的菌液Am11(在超净台中，用接种环刮取适量保存在斜面培养基上的菌体，接种到种子培养液中，35℃、180r/min恒温培养12h，制成活化的菌液)接种到已灭菌的饵料培养基(将南美白对虾饲料研磨成粉末，取10g，溶于1L去蒸馏水中，煮沸，无菌环境中浸泡12h，6000r/min离心15min，取上清液，121℃灭菌20min)中，每隔12h(取72h小时)取上清液测定培养基中蛋白质、淀粉的含量和CODMn值。采用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白含量； 采用碘显色法测定淀粉含量；采用碱性高锰酸钾法^[22]测定COD_Mn值。计算蛋白质、淀粉和COD_Mn的降解率。

2、Am11菌株对氨氮、亚硝酸盐降解能力

将菌株Am11接种到发酵培养基(蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4)中，180r/min，30℃恒温培养12h，进行活化。吸取适量活化的菌液于离心管中，5000r/min，离心10min，去除上清液，再用无菌的PBS缓冲液洗涤沉淀，混匀，再次离心，重复三次，以除去菌种活化过程中产生的氨氮，再用PBS洗下沉淀接入氨盐培养基(酵母粉5g，(NH₄)₂SO₄ 0.25g，NaCl 1g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4)和亚硝酸盐培养基(酵母粉5g，NaNO₂ 0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g，NaCl 1g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4)中，先每隔4h，测完24h，再每隔12h测定培养液中NH₄⁺-N和NO₂-N的含量，计算出降解率，NH₄⁺-N和NO₂-N的测定分别采用次溴酸盐氧化法和萘乙二胺分光光度法。

3、结果分析

(1)本试验在以南美白对虾饵料为营养物质的情况下，测定了菌株Am11对饵料溶解物中蛋白、淀粉和CODMn的降解利用率，结果如图2所示。随着培养时间的延长，残料溶解物中的蛋白质、淀粉和CODMn的含量减少，降解率升高，并且在48h时趋于稳定，降解率分别为57％，52％，55％。

(2)本实验将已经活化的菌液接种到分别以(NH₄)₂SO₄和NaNO₃作为唯一氮源的培养基中，恒温培养，先每隔4h，测完24h，再每隔12h测定培养液中NH₄⁺-N和NO₂-N的含量，计算出降解率，结果显示，接入活液后8h后，培养液中氨氮和亚硝酸盐迅速降解，24h后氨氮和亚硝酸盐含量降低至很低水平，降解率分别达到了95％和97％(参见图3)。