一种猪链球菌2型XD株及应用的制作方法

本发明属于疫苗制备技术领域，具体为一种猪链球菌2型XD株及应用。

背景技术：

猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2，S.suis 2)是一种重要的人畜共患病病原体，可以引起猪发生脑膜炎、败血症、关节炎等症状，病死率高达40％，如与猪呼吸与繁殖综合征并发，死亡率更高，即使病后能够存活的猪，其生长缓慢，料肉比增加，给养猪业带来极大的经济损失，故该菌对全球的养猪生产是一个潜在的威胁。猪链球菌2型可以通过伤口、消化道感染人，1998年和2005年分别在我国江苏和四川发生猪链球菌病的暴发，并且均发生人感染死亡的病例，引起人们的高度关注。目前针对猪链球菌病，尚无适用人群的疫苗，所以预防猪发生猪链球菌病，不仅仅是对猪的保护，更是对人的一种保障。

目前对于猪链球菌病的防控主要依赖于猪场的综合管理、菌苗的免疫、药物预防等。而现在由于大量耐药菌株的出现，药物治疗及药物预防的效果急剧下降。所以疫苗免疫是猪链球菌病防控的关键，目前市场上猪链球菌病疫苗包括灭活单苗和灭活多价苗，灭活疫苗是将细菌通过甲醛灭活处理获得的全菌体死疫苗，灭活疫苗优点是生产方便、稳定、易保存；但是灭活苗存在较多的缺陷：1)灭活疫苗接种后在动物体内不能繁殖，因此免疫剂量较大，而且一般要加入免疫佐剂来增强其免疫效果；2)灭活疫苗保护期也相对较短，往往1次免疫不能产生较强的免疫保护效果，仅仅是“初始化”免疫系统，必须进行第二次加强免疫才能产生较强的免疫保护；3)灭活疫苗需要多次免疫、免疫剂量大并且免疫部位易出现损伤。然而，减毒活疫苗的优点是成本低，接种剂量少，且免疫保护期长，同时，活疫苗可有效刺激机体产生良好的体液免疫和细胞免疫，具有很广阔的应用前景。开发弱毒疫苗是控制该疾病的有效策略之一，但目前弱毒疫苗研发方面暂无突破，因此开发一种弱毒疫苗具有积极意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种猪链球菌2型XD株，该菌株具有致病性低、免疫原性好等特点，所述菌株已于2016年10月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2)XD株，保藏编号为：CCTCC NO：M2016573，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供一种适用于猪链球菌2型XD株的冻干保护剂。

本发明另一个目的在于提供了一种适用于猪链球菌2型XD株疫苗稀释液佐剂。

本发明还有一个目的在于提供了一种猪链球菌2型XD株在制备疫苗中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种猪链球菌2型XD株(本发明或称为SS2-XD株)，是申请人从湖北、湖南、四川、浙江、江苏、广东等省市100多株临床分离毒株中经过筛选得到，所述菌株已于2016年10月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：猪链球菌2型(Streptococcus suis seroty pe 2)XD株，保藏编号：CCTCC NO：M2016573，地址：中国武汉武汉大学。

猪链球菌2型XD株生物学特性鉴定如下：

猪链球菌2型XD株形态学特性：对营养需求较高，在基础琼脂平皿上生长较差，37℃温箱培养20小时以上可见针尖大小菌落。在TSA平皿(含5％新生牛血清)上生长良好，37℃温箱培养12小时即见针尖大小菌落。SS2-XD株形成的菌落呈灰色、半透明、湿润，透光45°可观察菌落现浅蓝色荧光。在绵羊鲜血琼脂平板上形成的菌落周围可见β溶血环。SS2-XD株接种缓冲肉汤培养基与TSB培养基(含5％新生牛血清)中培养6至8小时可见明显一致混浊，偶见沉淀于瓶底。新鲜培养物玻片固定后进行革兰氏染色，镜检结果为革兰氏阳性，个体呈圆球状或卵圆形，多见短链或长链排列，少见单个或双个排列(图1)。

一种适用于猪链球菌2型XD株的冻干保护剂，每100ml冻干保护剂中包括：YEAST EXT RACT 0.2～2g，谷氨酸钠0.1～1g、赖氨酸0.1～1g、山梨醇0.5～5g、蔗糖2～10g、TSB 0.1～2g、水解明胶1～5g，其余为去离子水。

以上所述方案中，优选的：每100ml冻干保护剂中包括：YEAST EXTRACT 1g，谷氨酸钠0.5g、赖氨酸0.5g、山梨醇0.5g、蔗糖4g、TSB 1g、水解明胶2g，其余为去离子水。

一种适用于猪链球菌2型XD株疫苗稀释液佐剂，每1L疫苗稀释液佐剂包括：左旋咪唑5～30g，β-葡聚糖0.01～0.1L，Summit-Poly Liquid 0.1～0.4L，其余为去离子水。

以上所述方案中，优选的，每1L稀释液佐剂中，包括β-葡聚糖0.05L，左旋咪唑含量为10g，Summit-Poly Liquid 0.15L，其余为去离子水。

一种猪链球菌2型XD株在制备疫苗中的应用，包括利用该菌株作为主要成分制备成单苗；或该菌株作为有效成分之一与其他抗原制备成联苗。

本发明涉及细菌活疫苗及其适用于该疫苗的专用稀释液佐剂，尤其向猪提供宽泛、安全和有效保护免遭猪链球菌所感染。本发明涉及包含细菌(例如，减毒活细菌)的免疫原或疫苗组合物。这些细菌可以在组合物中是灭活的，但是可能更有利的是活菌。本发明还涉及用于制备和/或配制这类组合物的方法；例如，合适的可兽用或可药用载体、赋形剂、稀释剂或媒介物和/或佐剂和/或稳定剂混合。

针对哺乳动物作为目标物种的组合物剂量体积，例如，基于细菌抗原的猪用组合物的剂量体积，通常在约0.4至约4.0ml之间。最佳免疫剂量为2.0ml/头份(5.0×10⁸CFU/头份)。可以在终末免疫后约4周通过用猪链球菌2型强毒菌株攻击动物如猪类动物，来检验疫苗的效力。可以通过IM或SC注射、喷雾、鼻内、眼内、气管内和/或经口方式攻击动物。可以在攻击之前和之后采集来自血清、关节、肺/或脑的样品对其猪链球菌特异性抗体和带毒量的存在进行分析。

本领域技术人员应当理解，本文的公开内容通过示例方式提供并且本发明不限于此。从本文中的公开内容和本领域知识，在不进行任何过多实验的情况下，技术人员可以确定施用次数、施用途径和用于每种注射方案的剂量。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.SS2-XD株是自然弱毒株，分离于健康猪的肺组织，对多种实验动物均无致病力，且对仔猪不造成病理损伤。

2.SS2-XD株活疫苗能快速有效持续刺激机体产生抗体，使机体应答同时产生细胞免疫和体液免疫，通过大量临床试验证据表明本发明的活疫苗对控制猪链球菌病起到积极作用，具有早期预防，诱导黏膜免疫、细胞免疫等特点。对临床上经常发生链球菌病的预防具有明显优势。

3.与灭活疫苗相比，接种剂量少、免疫后吸收更完全，在接种部位几乎不会引起炎症反应，不会对机体造成影响。

4.与灭活疫苗相比，生产成本更低。

附图说明

图1为SS2-XD株革兰氏染色镜检图片。

400×镜检，SS2-XD株新鲜培养菌液革兰氏染色结果呈阳性；个体呈圆球状或卵圆形，多见短链或长链排列，少见单个或双个排列。

图2为SS2-XD株gdh与cps2J基因PCR鉴定图；

其中M：为DL2000plus marker；2和4：为SS2-XD株；3和5为：参考菌株A7；1与6：阴性对照H₂O。

图3为培养基的pH值随时间变化的规律示意图。

图4为生长曲线(OD600nm值)。

图5为生长曲线(活菌数CFU)。

图6为免疫后仔猪平均抗体消长规律。

具体实施方式

结合具体实施例对本发明做进一步描述和论证，但本发明内容并不局限于此。本发明实施例所用保护剂如下，如未特别说明，均为本领域的常规方案或试剂，均购自于商业渠道。

冻干机：德国，型号：CHRIST公司2-6D LSC型号。

在本申请中，每头份免疫的疫苗如无特别说明，均按稀释后2ml/头份(活菌含量5.0×10⁸CFU)使用。

实施例1：

猪链球菌2型XD株的获得：

申请人从湖北、湖南、四川、浙江、江苏、广东等省市100多株临床分离毒株中经过PCR鉴定和毒力筛选，其中有60株三大毒力基因sly+mrp+epf+均为阳性。这与我国目前猪链球菌2型所流行毒力基因一致。将筛选到的60株猪链球菌2型分别用小鼠进行致病力初步评估，筛选到3株低致病力菌株，进一步比较三株菌株毒力，进行安全试验，试验结果表明：猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)安全性最高。腹腔接种对小鼠的LD50约为9.0×10⁸CFU，皮下接种最高剂量为9.0×10⁹CFU还是安全；SS2-XD株耳静脉接种仔猪3.0×10⁹CFU无明显症状，耳静脉接种最高剂量6.0×10⁹CFU对仔猪也没用造成异常影响。为进一步确定疫苗用SS2-XD株，又展开相关分子生物学鉴定。通过对猪链球菌2型XD株gdh与cps2J基因分别进行PCR，扩增结果(图2)说明，SS2-XD株能够扩增到特异性的gdf条带(689pb)，与特异性的cps2J条带(557pb)，此结果，与猪链球菌2型标准菌株扩增一致，表明SS2-XD株是猪链球菌2型或(1/2型)，结合凝集试验结果，SS2-XD株与猪链球菌2型标准血清发生凝集，而与1型标准血清不发生凝集。同时，对猪链球菌2型XD株进行形态学、培养特性、生化特性、血清型特性、安全性和免疫原性展开初步研究。结果表明SS2-XD株符合猪链球菌2型全部特征，至此，申请人获得了一株猪链球菌2型菌株，该菌株已于2016年10月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：猪链球菌2型(Strep tococcus suis serotype 2)XD株，保藏编号：CCTCC NO：M2016573，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2)XD株生理生化特性：

猪链球菌2型XD株生化试验：猪链球菌2型SS2-XD株在低温(10℃)与高温(45℃)下无法生长，在高盐环境下(6.5％NaCl)无法生长，在碱性环境中不生长，在富含胆酸盐环境中(麦康凯培养基)无法生长(表1)。唯一碳源利用的生化实验结果(表2与表3)说明猪链球菌2型SS2-XD株符合猪链球菌属的生化特性。

表1猪链球菌的生长特性结果

表2猪链球菌生化反应结果

表3猪链球菌生化反应结果

猪链球菌2型XD株血清学特性：将猪链球菌2型分离株SS2-XD株与猪链球菌1型和2型参考分型血清(购于丹麦皇家血清研究所)进行玻片凝集试验，同时以A7株(2型参考菌株)与ST1株(1型参考菌株)作参考对照。结果显示(表4)对照成立，SS2-XD株可与猪链球菌2型参考血清发生凝集反应，与1型参考血清没有发生凝集反应，根据判定标准，SS2-XD株符合猪链球菌2型血清学特性。

表4玻片凝集试验结果

猪链球菌2型XD株培养特性：将冻干菌种经TSA琼脂培养皿划线复壮纯化(F1代)，挑取单菌落接种液体培养基，连续传代3次(F2至F4代)以适应。以F4代新鲜菌液为种子液1:100体积比接种TSB培养基，于37℃摇床150转/分钟振荡培养。其间每隔两小时取样进行活菌计数。每小时取样测定培养液pH值，同时用分光光度计测定菌液的OD_600nm值。结果见图3、图4、图5所示。

从图3可以看出，在液体培养基中培养猪链球菌2型，溶液的pH值下降非常快，培养时间为10小时左右，其pH值达到最低，此时pH值仅为5.13，由此说明，猪链球菌2型在培养过程中产酸能力强。维持发酵液pH值(7.0～7.5)可能有助于细菌生长。

从图4可以看出，在液体培养基中培养SS2-XD株，在接种种子菌后8小时内，溶液的OD值成对数增长，培养10小时后进入平稳期。

从图5可以看出，在液体培养基中培养链球菌，种子液接种后4个小时左右开始进入对数生长期，培养8～10h活菌数达到最高峰，但从12个小时开始活菌数一直呈现下降趋势。

实施例3：

猪链球菌病活疫苗(SS2-XD株)的制备方法，包括：

1、取猪链球菌2型XD株冻存菌种接种于5％新生牛血清TSA培养基中，在37℃培养20-24h后，经检验合格后作为一级种子。选取5个以上典型菌落接种于5％新生牛血清TSB培养基中。在37℃150r/min培养8-10h，经纯粹检验合格后作为二级种子。将二级种子液在无菌条件下按照2％(v/v)接种装有30L的TSB液体培养基(含5％v/v新生牛血清)的50L发酵罐中。然后通过电脑自动控制系统，控制和维持发酵罐通气量1.5VVM、溶解氧浓度40％-60％、搅拌速率100r/min、pH值7.2±0.2。在发酵过程中通入无菌空气，以保证正压和溶氧，在37℃培养10-12h后收获菌液，收获的菌液浓度≥6×10⁹CFU/ml，置于2-8℃保存。

2、猪链球菌2型XD株冻干保护剂的制备：

将水解明胶、蔗糖、YEAST EXTRACT、TSB加入到70-80℃去离子水中，搅拌直至完全溶解，高压灭菌条件为116℃，20min。即为A组储备液。

将谷氨酸钠、赖氨酸、山梨醇溶解在去离子水中，然后，利用0.22微米滤器滤过除菌，即为B组储备液。然后，将A组储备液和B组储备液按照体积比1:1混合后，即为冻干保护剂，每100ml冻干保护剂中包括：YEAST EXTRACT 1g，谷氨酸钠0.5g、赖氨酸0.5g、山梨醇0.5g、蔗糖4g、TSB 1g、水解明胶2g，其余为去离子水。

3、冻干过程

将冻干保护剂和菌液按照1：3(v/v)体积比混合均匀。分装于10ml管制瓶中，3ml/瓶，进行冻干，在冻干结束后观察冻干试验样品形态，测定冻干后活菌数。冻干前半成品的活菌数应≥5×10⁹CFU/ml。

冻干过程如下：

在产品预冻阶段：4℃进箱，然后1h内将板层温度下降到-42℃并维持2h。在主干燥阶段：2h内将板层温度由-42℃上升到0℃并维持8h，然后再1h内将板层温度由0℃上升到15℃并维持2h。终干燥阶段：在2h内将板层温度由15℃上升到28℃并维持8h。冻干结束，出箱、压盖，并于4℃保存，即制得猪链球菌病活疫苗(SS2-XD株)，用于以下实施例。

4、成品苗检验

活菌数检测按照《中国兽药典》附录活菌计数方法进行检测。使得冻干后成品苗活菌数应≥5.0×10⁸CFU/头份。

物理性状性状为淡黄色或灰白色海绵状疏松团块，饼块疏松多孔，形态完整，易于脱瓶，加冻干稀释液迅速溶解。

纯粹性 按照《中国兽药典》附录方法进行检测应符合规定。

剩余水分 按照《中国兽药典》附录方法进行检测应符合规定。

真空度 按照《中国兽药典》附录方法进行检测应符合规定。

5、疫苗保存期试验

将试制3批疫苗分别在2～8℃放置3个月、6个月、9个月、12个月，-15℃放置6个月、12个月、18个月、24个月后各抽取3瓶，测定活菌数。同时对样品按照《中国兽药典》附录方法进行物理性状、溶解性、真空度、剩余水分测定。经过检查结果发现在2～8℃条件下保存9个月时与冻干后活菌数相比在80％以上，在-15℃条件下保存18个月时与冻干后活菌数相比在80％以上，因此在确定-15℃以下保存有效期为18个月。具体结果见表5、表6、表7。

表5：3批疫苗在2～8℃条件下保存期试验

表6：3批疫苗在-15℃条件下保存期试验

表7：3批苗在2～8℃和-15℃条件下物理性状、溶解性、真空度、剩余水分检测结果

实施例4：

适用于猪链球菌病活疫苗(SS2-XD株)的稀释液佐剂：

稀释液佐剂的制备方法，包括：

适用于猪链球菌病活疫苗(SS2-XD株)稀释液佐剂，包括：左旋咪唑、β—葡聚糖和Su mmit-Poly Liquid。

其猪链球菌病活疫苗(SS2-XD株)冻干稀释液佐剂具体制备方法如下：

将无菌级β-葡聚糖溶液(湖北安琪酵母股份有限公司)作为A储备溶液

将左旋咪唑(Sigma公司)溶解在去离子水中，制备成50mg/ml的储备溶液。然后，利用0.22微米滤器过滤除菌作为B储备溶液。

将Summit-Poly Liquid佐剂(台湾国盛生物科技有限公司)溶液116℃高压灭菌20min作为C贮备液佐剂。

最后将A液、B液、C液分别依次缓慢加入无菌去离子水中，边加边搅拌，搅拌的转速为500r/min。搅拌时间为30min。混合均匀的制剂即为猪链球菌2型XD株冻干稀释剂。

以1L稀释剂为例进行配制时，取无菌级β-葡聚糖A储备溶液0.05L，取左旋咪唑B储备溶液0.2L，取Summit-Poly Liquid佐剂C储备液0.15L分别依次缓慢加入无菌去离子水中，最后定容到1L。边加边搅拌，搅拌的转速为500r/min。搅拌时间为30min。混合均匀的制剂即为猪链球菌2型XD株稀释液佐剂，每1L稀释液佐剂中，包括β-葡聚糖0.05L，左旋咪唑含量为10g，Summit-Poly Liquid 0.15L，其余为去离子水。

猪链球菌病活疫苗(SS2-XD株)稀释液佐剂与生理盐水的效果比较：

用上述制备的猪链球菌病活疫苗(SS2-XD株)稀释液佐剂和生理盐水分别稀释猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗，5.0×10⁸CFU/头份，免疫28～35日龄断奶仔猪(购自湖北某猪场)。经猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒(武汉科前生物股份有限公司)检测，抗体为阴性方可用于本试验。试验共分3组，5头/组，免疫剂量为：1头份/头。组1为：猪链球菌病活疫苗(SS2-XD株)稀释液佐剂稀释的猪链球菌病活疫苗(SS2-XD株)；组2为：生理盐水稀释的猪链球菌病活疫苗(SS2-XD株)；组3为：空白对照。在免疫28天后，采血分离血清检测猪链球菌2型抗体水平。试验结果见表(8)。

表8：比较SS2-XD株稀释液佐剂和生理盐水免疫28天后抗体水平

由表8可以看出，用制备的猪链球菌病活疫苗(SS2-XD株)稀释液佐剂稀释的疫苗免疫28天后抗体在同等条件下明显高于生理盐水。说明使用本发明的猪链球菌病活疫苗(SS2-XD株)稀释液佐剂可显著提高活疫苗的免疫刺激能力。

实施例5：

猪链球菌病活疫苗(SS2-XD株)最佳免疫剂量测定及抗体水平与攻毒保护率之间平行关系

1材料与方法

1.1试验用疫苗猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗，5.0×10⁸CFU/头份，由实施例3所制备的冻干粉和实施例4所制备稀释剂稀释制得。

1.2攻毒用菌株选取猪链球菌血清2型LT株，来源于武汉科前生物股份有限公司，仅用于攻毒试验。

1.3实验动物选取28～35日龄断奶仔猪，购自湖北某猪场。经猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒(武汉科前生物股份有限公司)检测，抗体为阴性方可用于本试验。

1.4疫苗中活菌数的测定猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗，用生理盐水稀释恢复原装量，按照《中国兽药典》附录进行活菌计数测定。

1.5动物实验设计

用猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗免疫21～28日龄断奶仔猪。试验共分7组，每组5头。按剂量2.5×10⁷CFU、1.0×10⁸CFU、5.0×10⁸CFU，分一次免疫和两次免疫(首免间隔21天)进行免疫接种，两次免疫组提前7天免疫。另外设立非免疫空白对照组5头。

在一次免疫28天和两次免疫35天后，前腔静脉采血分离血清检测猪链球菌2型抗体水平，并进行一个致死剂量(1.2×10⁶CFU)猪链球菌血清2型LT株攻毒试验。在攻毒后观察14天，分析攻毒保护率与免疫剂量、免疫次数之间相关性，分析攻毒保护率与抗体水平之间相关性。

2结果与分析

2.1疫苗最佳免疫剂量测定与攻毒保护结果

在一次免疫28天和两次免疫的首免35天后，前腔静脉采血分离血清检测猪链球菌2型抗体水平，并进行一个致死剂量(1.2×10⁶CFU)猪链球菌血清2型强毒LT株攻毒试验。统计每组免疫后抗体水平及攻毒保护率。

结果表明：在使用猪链球菌2型XD株2.5×10⁷CFU剂量免疫仔猪，无论是一次免疫还是两次免疫，猪群产生的抗体水平都较低，且不能提供有效的攻毒保护；在使用1.0×10⁸CFU、5.0×10⁸CFU剂量免疫仔猪，都可以产生较高抗体水平，但5.0×10⁸CFU剂量提供的攻毒保护最好。另外以相同剂量进行两次免疫诱导产生的抗体水平明显高于一次免疫，非免疫空白对照组抗体均为阴性，经攻毒后全部发病或死亡，详细结果见表9。

表9：不同免疫剂量与免疫次数接种仔猪抗体及攻毒结果

2.2抗体水平与攻毒保护相关性分析结果

对比分析一次免疫28天和两次免疫35天后抗体检测结果和攻毒保护结果(表9)，抗体水平在低于0.5(OD630nm值)时，攻毒保护率在20％以下，抗体水平在0.5～0.9(OD630nm值)时，攻毒保护率在80％以上，抗体水平高于0.9(OD630nm值)时，可以提供100％攻毒保护。对以上结果表明，猪链球菌活疫苗XD株(SS2-XD株)免疫抗体水平与攻毒保护有正相关。鉴于试验结果，我们将5.0×10⁸CFU作为SS2-XD株最佳免疫参考剂量。

实施例6：

猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)安全检验与效力检验

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物选取武汉某猪场28-35日龄健康仔猪，要求仔猪来源一致，个体均匀，使用武汉科前生物股份有限公司生产猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒检测抗体为阴性，且符合猪链球菌健康易感仔猪要求。

1.1.2试验用疫苗

猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗，5.0×10⁸CFU/头份，由实施例3所制备的冻干粉和实施例4所制备稀释剂稀释制得。

上海海利生物药品有限公司生产猪链球菌病灭活疫苗(马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型)简称海利苗、

武汉科前生物股份有限公司提供猪链球菌病三价灭活疫苗(2型LT株+7型YZ株+C群XS株)简称科前苗。

1.1.3攻毒用毒株选取猪链球菌血清2型LT株，来源于武汉科前生物股份有限公司，仅用于攻毒试验。

1.2方法

1.2.1疫苗安全性比较试验将30头健康仔猪随机分为6组，每组5头。其中第一组至第三组为猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗，每头仔猪颈部肌肉接种10头份；第四组为海利苗，每头仔猪颈部肌肉接种2头份；第五组为科前苗，每头仔猪颈部肌肉接种2头份；第六组为空白对照。于各疫苗组接种后观察14天，监测猪群体温和临床症状，评价猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗和商品疫苗安全性之间差异。

1.2.2疫苗效力比较试验将40头健康仔猪随机分4组，每组10头。其中，第一组为猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗；第二组为海利苗；第三组为科前苗；第四组为攻毒对照组。各试验组，每头仔猪颈部肌肉接种1头份。其中，第二组按照说明书首免21天后以相同剂量进行二免，在二免后14天进行攻毒。由于海利苗需两次免疫，所以其他疫苗免疫组较海利疫苗免疫组推迟一周免疫接种。

1.2.3疫苗攻毒保护性试验将猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗和科前苗免疫28天后，即海利苗免疫35天后(提前7天初次免疫)，对包括攻毒对照组的所有仔猪进行攻毒保护试验。攻毒用菌株为猪链球菌2型强毒株LT株，攻毒方式为耳静脉注射，攻毒剂量为一个致死剂量(1.2×10⁶CFU)，比较3种疫苗的免疫效力。

2结果与分析

2.1疫苗安全性比较猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗高剂量(10头份/头)接种仔猪，在接种部位不见红肿、感染等异常。科前苗高剂量(2头份/头)接种仔猪，接种部位眼观可见红肿，但在观察期内逐渐恢复，海利苗高剂量(2头份/头)接种仔猪，接种部位眼观可见轻微红肿。

疫苗接种前后对猪群体温与临床症状监测结果表明，在接种活疫苗后引起机体体温波动幅度较小，体温升高较灭活疫苗低。科前苗由于佐剂为油包水疫苗在接种后12h内，猪群平均体温超过40.5℃，第二天恢复正常。海利苗在接种12h内，猪群平均体温超过40℃，第二天恢复正常。猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗在接种疫苗后12h内，猪群平均体温上升幅度较小，均不超过基础体温0.5℃(见表10)

表10：仔猪安全试验疫苗接种前后体温检测结果

2.2免疫攻毒保护试验结果

采用猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗和科前苗在免疫28天后，海利灭活苗35天后(提前7天初次免疫)，对包括攻毒对照组在内所有仔猪进行攻毒保护试验。攻毒后观察发病和死亡情况，统计疫苗保护率，(结果见表11)。

表11：仔猪免疫后攻毒试验结果

由表11结果可以看出，未免疫攻毒对照仔猪9/10发病，死亡7/10，说明攻毒试验成立。而免疫组中，猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗，攻毒后2/10发病，1/10死亡；疫苗对照组中海利苗攻毒后3/10发病，1/10死亡；科前苗攻毒后1/10发病，0/10死亡。

3结论

从攻毒保护试验可以看出，猪链球菌2型XD株活疫苗与对照试验苗攻毒保护相当，均在80％-100％，能对猪群起到有效保护。通过攻毒保护试验可以证明SS2-XD株活疫苗针对猪链球菌2型免疫效力和灭活疫苗一致。

实施例6：

猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗免疫持续期与抗体消长规律检验

1材料与方法

1.1疫苗

猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗，5.0×10⁸CFU/头份，由实施例3所制备的冻干粉和实施例4所制备稀释剂稀释制得。

1.2实验动物购买于武汉某猪场28-35日龄健康仔猪，经猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒(武汉科前生物股份有限公司提供)检测抗体为阴性。

1.3攻毒用毒株选取猪链球菌血清2型LT株，来源于武汉科前生物股份有限公司，仅用于攻毒试验。

1.4方法

1.4.1免疫程序猪链球菌2型XD株(SS2-XD株)疫苗进行颈部肌肉接种28-35日龄仔猪，每头仔猪免疫1头份，一共接种免疫仔猪15头。同时设立非免疫空白对照仔猪5头。

1.4.2抗体检测于免疫后14天、28天、60天、90天、120天、150天采血分离血清，使用猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒检测抗体水平，了解抗体消长规律和免疫持续期。

1.4.3攻毒试验将免疫120天后的15头仔猪中随机抽取5头和空白对照5头进行耳静脉攻毒试验。攻毒剂量为一个致死剂量(1.2×10⁶CFU)。攻毒后观察14天，统计临床发病与死亡情况。

2结果与分析

2.1抗体消长规律检测结果

从抗体检测结果表明，仔猪在免疫后14天ELISA抗体即可以转阳，在免疫后28天～60天抗体达到最高水平，在60天后开始下降，保护抗体水平(OD630值≥0.5)能持续至首免120天，(结果见表12和图6)

表12：抗体消长规律检测结果

2.2攻毒保护试验结果

通过检测抗体水平，疫苗免疫期至少可以持续120天(OD630nm≥0.6)，为进一步验证该疫苗免疫期，将免疫120天后随机挑选5头和空白组5头进行一个致死量(1.2×10⁶CFU)耳静脉攻毒试验。攻毒结果表明，在攻毒3天内，非免疫空白组全部发病，死亡4头，而免疫组在14天观察期内有一头发病，保护率达到80％以上(见表13)。此攻毒结果和免疫抗体消长规律分析结论一致。因此可以认为该疫苗可以提供4个月保护。

表13：疫苗免疫120天后攻毒保护结果

从免疫抗体消长规律和攻毒结果看，仔猪在免疫14天后抗体开始转阳，在免疫60～90天时抗体水平最高，在90天后开始下降。结合抗体水平与攻毒保护相关性分析，抗体保护期可以持续120天。于免疫120天后，随机抽取免疫仔猪5头，连同空白对照5头，进行攻毒试验，免疫组保护在80％以上，而空白组全部发病。因此可以说明疫苗的保护期为4个月。