一种分子标记辅助选择定向改良烟草黑胫病抗性的育种方法与流程

本发明属于烟草抗病育种技术领域，具体涉及一种分子标记辅助选择定向改良烟草黑胫病抗性的育种方法。

背景技术：

分子生物学技术，尤其是分子标记技术的发展为品种改良提供了有效手段。分子标记辅助选择育种是在育种过程中，借助与目标基因紧密连锁的分子标记对目标性状进行选择。2010年启动的中国烟草基因组计划重大专项，绘制了以绒毛状烟草、林烟草、栽培烟草全基因组序列图谱、烟草分子遗传连锁图谱、烟草单倍体型图为核心的一整套高质量的基因组图谱，为分子标记辅助育种奠定了坚实基础；

烤烟品种红花大金元是云南在上世纪70年代选育的优质特色品种，清香型风格突出，深受卷烟工业企业的喜爱，但易感黑胫病。20多年来，我国烟草育种工作者试图利用常规育种技术改良红花大金元对黑胫病的抗性，但一直未获成功，选育的后代材料存在无法保持红花大金元品种的特征特性以及黑胫病抗性丢失的问题；而且在传统回交育种中，往往需要经过回交五代才能达到较高的遗传背景回复率，育种进程较长；并且，需要大规模在田间种植进行表型筛选，田间工作量较大，并且受环境影响较大，甚至出现结果不准确的问题。因此，研发一种能解决上述问题的育种方法是非常必要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种分子标记辅助选择定向改良烟草黑胫病抗性的育种方法。

本发明的目的是这样实现的，具体包括以下步骤：

A、分子标记的获得：用全基因组序列数据开发的SSR标记对轮回亲本、供体亲本及其F₁的叶片提取DNA进行分子标记筛选，选出在两亲本间有多态、且在F₁中呈共显性的分子标记，再对F₁与轮回亲本回交得到的BC₁F₁作图群体进行分子标记的基因型分析、构建遗传连锁图谱，以及对BC₁F₁进行黑胫病抗性鉴定，选出与抗黑胫病紧密连锁的分子标记作为前景标记，其他与抗黑胫病非连锁的分子标记作为背景标记；

B、分子标记辅助第一次选择：将步骤A中的BC₁F₁抗病单株自交得到BC₁F₂，对BC₁F₂进行黑胫病抗性鉴定，提取不发病单株叶片的DNA，利用步骤A中的前景标记对BC₁F₂辅助前景选择，再用步骤A中的背景标记辅助背景选择，选出含抗黑胫病基因、表型接近轮回亲本且背景回复率高的后代单株，再与轮回亲本回交，得到BC₂F₁；

C、分子标记辅助第二次选择：对BC₂F₁的后代进行黑胫病抗性鉴定，提取不发病单株叶片的DNA，利用步骤A中的前景标记对BC₂F₁辅助前景选择，再用步骤A中的背景标记辅助背景选择，选出含抗黑胫病基因、表型接近轮回亲本且背景回复率高的后代单株，再与轮回亲本回交，得到BC₃F₁；

D、分子标记辅助第三次选择：对BC₃F₁的后代进行黑胫病抗性鉴定，提取不发病单株叶片的DNA，利用步骤A中的前景标记对BC₃F₁辅助前景选择，再用步骤A中的背景标记辅助背景选择，选出含抗黑胫病基因、表型接近轮回亲本且背景回复率高的后代单株，再与轮回亲本回交，得到BC₄F₁；

E、分子标记辅助第四次选择：在历年烟草黑胫病重病田块种植BC₄F₁，提取BC₄F₁单株叶片的DNA，利用步骤A中的前景标记对BC₄F₁辅助前景选择，再用步骤A中的背景标记辅助背景选择，选出含抗黑胫病基因、表型接近轮回亲本且背景回复率高的BC₄F₁单株，自交得到BC₄F₂；

F、分子标记辅助第五次选择：提取BC₄F₂单株叶片的DNA，利用步骤A中的前景标记对BC₄F₂辅助前景选择，再用步骤A中的背景标记辅助背景选择，选出纯合、背景回复率高、渐渗片段相对较短的抗性单株作为定向改良新品系。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

1、本发明利用精确的紧密连锁分子标记辅助对抗黑胫病基因进行前景选择以及利用红花大金元优良性状的高密度分子标记进行全基因组遗传背景选择，相对较短的含抗病基因的渐渗片段导入到优良品种红花大金元中，达到了既完整保留红花大金元的现有优良性状、又增加了抗黑胫病能力的效果，并且田间生长整齐，遗传性状稳定；

2、本发明辅助背景选择时采用递进式两步法辅助背景选择，先利用均匀分布于烟草全基因组24个连锁群上的120个背景标记，约1/5的背景标记辅助背景的初步选择，淘汰一批单株后，再利用剩余的457个全基因组范围的背景标记辅助背景选择，递进式两步法辅助背景选择既可以有效覆盖定向改良原始品种的全基因组遗传背景，又可以减少4/5的背景分子标记辅助选择的工作量，从而大大提高定向改良效率；

3、本发明中回交3代BC₃F₁经分子标记辅助选择的单株的背景回复率可达到97.5%以上，大大提高轮回亲本的背景回复率，有效缩短育种进程；

4、本发明前景标记是与抗烟草黑胫病紧密连锁的分子标记，背景标记覆盖改良原始品种全基因组，通过增加回交代数分子标记辅助选择，绘制各代典型单株的基因型，比较基因图就可以相当直观地选出纯合、背景回复率高、渐渗片段相对较短的抗性单株，定向改良精确度高；

5、本发明使用室内、温室培养的烟苗进行分子标记分析，而不需要大规模的田间种植进行表型筛选，只需要对分子标记辅助选出的后代进行田间验证，具有田间工作量少、绝大部分工作受环境影响小、结果更准确的优点。

附图说明

图1为分子标记辅助选择定向改良烟草黑胫病抗性的育种流程图；

图2为分子标记辅助选择绘制BC₁F₂典型单株W67-23的基因型示意图；

图3为分子标记辅助选择绘制BC₄F₂典型单株A091的基因型示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

如附图1~3所示本发明具体包括以下步骤：

A、分子标记的获得：用全基因组序列数据开发的SSR标记对轮回亲本、供体亲本及其F₁的叶片提取DNA进行分子标记筛选，选出在两亲本间有多态、且在F₁中呈共显性的分子标记，再对F₁与轮回亲本回交得到的BC₁F₁作图群体进行分子标记的基因型分析、构建遗传连锁图谱，以及对BC₁F₁进行黑胫病抗性鉴定，选出与抗黑胫病紧密连锁的分子标记作为前景标记，其他与抗黑胫病非连锁的分子标记作为背景标记；

B、分子标记辅助第一次选择：将步骤A中的BC₁F₁抗病单株自交得到BC₁F₂，对BC₁F₂进行黑胫病抗性鉴定，提取不发病单株叶片的DNA，利用步骤A中的前景标记对BC₁F₂辅助前景选择，再用步骤A中的背景标记辅助背景选择，选出含抗黑胫病基因、表型接近轮回亲本且背景回复率高的后代单株，再与轮回亲本回交，得到BC₂F₁；

C、分子标记辅助第二次选择：对BC₂F₁的后代进行黑胫病抗性鉴定，提取不发病单株叶片的DNA，利用步骤A中的前景标记对BC₂F₁辅助前景选择，再用步骤A中的背景标记辅助背景选择，选出含抗黑胫病基因、表型接近轮回亲本且背景回复率高的后代单株，再与轮回亲本回交，得到BC₃F₁；

D、分子标记辅助第三次选择：对BC₃F₁的后代进行黑胫病抗性鉴定，提取不发病单株叶片的DNA，利用步骤A中的前景标记对BC₃F₁辅助前景选择，再用步骤A中的背景标记辅助背景选择，选出含抗黑胫病基因、表型接近轮回亲本且背景回复率高的后代单株，再与轮回亲本回交，得到BC₄F₁；

E、分子标记辅助第四次选择：在历年烟草黑胫病重病田块种植BC₄F₁，提取BC₄F₁单株叶片的DNA，利用步骤A中的前景标记对BC₄F₁辅助前景选择，再用步骤A中的背景标记辅助背景选择，选出含抗黑胫病基因、表型接近轮回亲本且背景回复率高的BC₄F₁单株，自交得到BC₄F₂；

F、分子标记辅助第五次选择：提取BC₄F₂单株叶片的DNA，利用步骤A中的前景标记对BC₄F₂辅助前景选择，再用步骤A中的背景标记辅助背景选择，选出纯合、背景回复率高、渐渗片段相对较短的抗性单株作为定向改良新品系。

所述的定向改良新品系有多个时，首先利用步骤A中的前景标记、背景标记分别对定向改良新品系进行辅助前景选择、辅助背景选择，选出含抗黑胫病基因且背景回复率保持稳定的品系，再进一步选出与轮回亲本的主要植物学性状、农艺性状最接近的品系为最优品系。

所述的前景标记有4个，分别为Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617。

Scf_30K分子标记引物序列为：

Scf_30KF：5’-GAGAAGCCCATCACCTTTTG-3’，

Scf_30KR：5’-TTCGAAATAAAGGCTCCCTCT-3’；

TM62分子标记引物序列为：

TM62F：5’-AG ACGGGGC TAAATTTGACA-3’，

TM62R：5’-AGCGGAAGAGTT GAGGA CA A-3’；

ST141分子标记引物序列为：

ST141F：5’-CCATTCTAGCAAAGCCCATAA-3’，

ST141R：5’-CAGA GGCAACAATGCATACG-3’；

InDel0617分子标记引物序列为：

InDel0617F：5’-TGGCTTTGCGGTCCTATTAC-3’，

InDel0617R：5’-GCTCTGCAGATGCAAAGGTT-3’。

所述的背景标记有577个。

所述的辅助背景选择为递进式两步法辅助背景选择，所述的递进式两步法辅助背景选择是先利用均匀分布于烟草全基因组24个连锁群上共120个背景标记辅助背景选择，再利用剩余的457个全基因组范围的背景标记辅助背景选择。

所述的BC₃F₁经分子标记辅助选择的单株的背景回复率大于96.5%。

所述的定向改良新品系的背景回复率大于99%。

所述的轮回亲本、供体亲本及其F₁、BC₁F₁、BC₁F₂、BC₂F₁、BC₃F₁烟苗均在室内或温室培养。

所述的轮回亲本为红花大金元，所述的供体亲本为抗黑胫病基因来源于烟草野生种N.plumbaginifolia的育种中间材料RBST。

所述的历年烟草黑胫病重病田块至少包括2地4点。

所述的遗传连锁图谱构建是利用作图软件JoinMap 4.0（Van Ooijen, J.W. JoinMap® 4.0, Software for the calculation of genetic linkage maps in experimental populations. Kyazma B.V, Wageningen. 2006）进行遗传图谱构建。Grouping选择recombination frequency 参数，阈值为Start（0.250）、End（0.050）、Step（-0.050）；Mapping algorithm选择regression mapping 参数，mapping function选择Kosambi 函数；其余参数采用默认值。利用MapChart 2.2软件（Voorrips, R.E. MapChart: software for the graphical presentation of linkage maps and QTLs. The Journal of Heredity. 2002, 93:77-78）绘制遗传图谱。

所述的步骤B~F中PCR反应体系：PCR扩增体系为20 μL，其中包含2.0 μL 的1 x buffer （10 mM Tris-Cl、PH=8.4，50 mM KCl，1.5 mM MgCl₂），200 μM 的 dNTPs（Takara Biotechnology Co. Ltd.，大连），0.5 μM 的上下游引物（Takara），1.0 U 的 rTaq 聚合酶（Takara），20-50ng模板DNA，最后用ddH₂O补齐20 μL。

PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，30个循环（95℃变性30秒，复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5分钟，4℃保存。其中复性温度共有三个梯度57℃、60℃、62℃，不同的标记对应不同的退火温度。

PCR扩增产物加1/6体积的6 × Loading Buffer，取2.5μL利用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（non-denaturing PAGE，220V，3.5h）在电泳仪上电泳分离，然后进行银染检测。

实施例1：前景、背景分子标记的获得

用红花大金元全基因组数据开发的23626个SSR标记对云南省烟草农业科学研究院研和实验基地温室种植的轮回亲本红花大金元、供体亲本RBST（中国发明专利ZL 201410819251.2）及其F₁叶片提取的DNA在云南省烟草农业科学研究院玉溪市南祥路14号实验室进行分子标记筛选，筛选出在两亲本间有多态、且在F₁中呈共显性的分子标记601个，再用作图软件Joinmap 4.0对601个标记在云南省烟草农业科学研究院研和实验基地大田获得的213株BC₁F₁作图群体进行分子标记的基因型分析、构建遗传连锁图谱，最终构建获得了一张含有581个SSR标记的覆盖烟草全基因组的高密度遗传图谱，结合3批次温室8030株BC₁F₁黑胫病抗性鉴定（中国发明专利申请号201510617233.0）结果，选出与抗黑胫病基因两侧紧密连锁的分子标记Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617（中国发明专利申请号201610054257.4）作为前景标记，其他的577个与抗性非连锁的SSR标记作为背景标记。

实施例2：BC₁F₂分子标记辅助选择

2012年的BC₁F₁抗病单株自交得到BC₁F₂，BC₁F₂播种育苗3盘（128株/盘），成苗后移栽至小花盆、还苗后进行黑胫病抗性鉴定，不发病单株移栽至大田，共移栽90株，然后提取各不发病单株叶片DNA；先利用与抗黑胫病基因两侧紧密连锁的4个前景标记Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617助前景选择，选择含有抗黑胫病基因的单株，再利用基于构建的改良原始品种全基因组遗传图谱上24个连锁群、每个连锁群选择5个背景标记共120个均匀分布在各连锁群的背景标记辅助背景选择，初步选出含有抗黑胫病基因、背景回复率高的8个单株；再利用剩余的分布烟草全基因组的457个背景标记进一步对这8个单株辅助背景选择，绘制各单株的基因型，选出W67-23和89共2株抗黑胫病、含有85%以上红花大金元基因组片段的BC₁F₂；根据表型观测，W67-23与红花大金元株型更接近，故选择W67-23与轮回亲本红花大金元回交，得到BC₂F₁。

实施例3：BC₂F₁分子标记辅助选择

BC₂F₁播种育苗5盘（168株/盘），成苗后移栽至小花盆、还苗后进行黑胫病抗性鉴定，不发病单株移栽至大田，共移栽306株，然后提取各不发病单株叶片DNA；先利用与抗黑胫病基因两侧紧密连锁的4个前景标记Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617辅助前景选择，选择含有抗黑胫病基因的单株；基于构建的改良原始品种全基因组遗传图谱上24个连锁群、每个连锁群选择5个背景标记共120个均匀分布在各连锁群的背景标记辅助背景的初步选择，初步选出含有抗黑胫病基因、背景回复率高的33个单株；再利用剩余的分布烟草全基因组的457个背景标记进一步对这33个单株进一步辅助背景选择，绘制各单株的基因型，结合表型观测，选出编号分别为T27、T53、T101、T115、T204和T251的6个单株，这6个BC₂F₁单株背景回复率均在93%以上，再用这6个单株均与红花大金元回交，得到BC₃F₁。

实施例4：BC₃F₁分子标记辅助选择

各BC₃F₁单株成苗后，经黑胫病抗性鉴定，然后提取各不发病单株叶片DNA，共提取了13567个单株DNA，其中来自T27、T53、T101、T115、T204、T251与红花大金元回交获得的BC₃F₁单株数分别为1110株、4544株、3325株、1581株、1872株、1135株；先利用与抗黑胫病基因两侧紧密连锁的4个前景标记Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617辅助前景选择，初步得到约1800个候选单株，移栽至临时大棚；经表型观察选出7株，直接用577个背景标记辅助背景选择；这7个单株均含抗黑胫病基因，估算红花大金元背景回复率见表1，T53-64的背景回复率达到97.6%，其余6个单株的背景回复率在96.7%~97.5%之间，这7个单株均与红花大金元进行了回交，获得了BC₄F₁。

表1 7个BC₃F₁单株根据分子标记分析估算的红花大金元背景回复率

实施例5：BC₄F₁田间试验和后代单株选择

2015年安排在玉溪峨山及研和试验基地，随机区组设计，3次重复。除黑胫病防治措施外，其余各项农事操作同当地优质烟叶生产技术措施；试验材料为实施例4得到的7个BC₄F₁株系，亲本红花大金元、RBST。

旺长期观察各试验点黑胫病发病情况表明，玉溪峨山试点发病较重，其次是研和基地病圃试点。现蕾开花期，玉溪峨山试点发病最重，红花大金元绝大部分死亡，BC₄F₁株系存活株数接近于死亡株数，RBST全部存活；研和基地病圃的红花大金元绝大部分死亡，BC₄F₁株系存活株数略多于死亡株数，RBST全部存活，符合预期。

经表型观测，各株系仍有一定分离，现蕾后选取表型接近红花大金元的植株套袋自交，每片叶片挂牌。打顶后，挂牌、套袋单株测定了打顶株高、叶片数、茎围、节距、腰叶长宽等农艺性状，供单株选择时参考（表2）。

表2 部分挂牌单株的农艺性状

BC₄F₁株系进入旺长期后，所有试点的所有BC₄F₁单株均取叶片提取DNA，试点1（研和基地大田）取样863株，试点2（研和基地病圃）取样1126株，试点3（玉溪峨山）取样1155株。

利用与抗黑胫病基因两侧紧密连锁的4个前景标记Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617辅助前景选择，兼顾表型观测、农艺性状结果，初步选出32个单株；再直接用577个背景标记辅助背景选择，选出6个BC₄F₁单株；估算6个BC₄F₁单株的红花大金元背景回复率（表3），最高达到99.1%，其次是98.3%，剩下4个单株介于97.4%-97.9%之间；6个BC₄F₁自交得到BC₄F₂。

表3 6个BC₄F₁单株根据分子标记分析估算的红花大金元背景回复率

BC₄F₁成熟时分单株采烤，8个BC₄F₁单株初烤烟叶卷烟，评吸鉴定发现2个BC₄F₁单株（A2和H2）与对照红花大金元评吸得分、主要特征比较接近，2个BC₄F₁单株（T1和T2）略逊于对照红花大金元（表4）。

表4 8个BC₄F₁单株初烤烟叶的评吸鉴定结果

实施例6：BC₄F₂后代单株选择

BC₄F₂播种育苗，在移栽至小花盆的同时取叶片提取DNA，共提取2067个BC₄F₂单株DNA；首先利用与抗黑胫病基因两侧紧密连锁的4个前景标记Scf_30K、TM62、ST141和InDel0617辅助前景选择，选择含有抗黑胫病基因的单株；再利用基于构建的改良原始品种全基因组遗传图谱上24个连锁群、每个连锁群选择5个背景标记共120个均匀分布在各连锁群的背景标记辅助背景的初步选择，初步选出含有抗黑胫病基因、背景回复率高的33个单株；这33个BC₄F₂单株成苗后进行黑胫病抗性鉴定，验证基因型分析与表型分析的吻合程度；然后再利用剩余的分布烟草全基因组的457个背景标记进一步对这33个单株辅助背景选择，绘制各单株的基因型；根据分子标记辅助选择结果和农艺性状表现，选出8个BC₄F₂单株，其中背景回复率最高可达99.5%（表 5）。

表 5 8个BC₄F₂单株根据分子标记分析估算的红花大金元背景回复率

最后，综合考虑实施例5中BC₄F₁单株的表现，H2和A2农艺性状、感官评吸与红花大金元非常接近，T1长势较强、感官评吸略逊于红花大金元；而BC₄F₂单株A091、H291、T033和T056含有纯合抗黑胫病基因、高抗黑胫病菌0号生理小种，其中A091和H291的遗传背景回复率在99%以上，A091和H291两个单株已套袋繁殖种子，并与红花大金元杂交，作为定向改良的抗黑胫病红花大金元新品系用于生产试验示范，T033和T056也已套袋繁殖种子、可作为抗黑胫病新品系加以利用。

实施例7：定向改良品系的田间比较鉴定

2016年试验安排在大理弥渡、昆明石林及玉溪研和试验基地。其中大理弥渡两个点，东海点5亩、西河点5亩；昆明石林两个点，景区点5亩、烟庄点6亩；玉溪研和试验基地两个点，大田点2.3亩、病圃点2.3亩。

改良新品系（A091B、H291B、T033B、T056B）和对照品种红花大金元（HDS）同田相邻种植，不设重复。大理弥渡4月14日播种，漂浮育苗；西河点、东海点分别于5月20日、21日膜下小苗移栽。昆明石林4月19日播种，漂浮育苗；5月31日膜下小苗移栽。玉溪研和试验基地4月22日播种，漂浮育苗；大田点、病圃点分别于6月2日、6月3日膜下小苗移栽。栽培管理参照当地红花大金元生产技术措施。

弥渡东海点A091B于7月12日现蕾，7月15日开花，7月20日打顶，与同田对照DHS一致。A091B株式塔形，田间生长势中，腰叶长椭圆形，叶色绿，叶耳大，生长整齐，与同田对照HDS相当（表6）；H291也接近HDS。T033B株式塔形，田间生长势强，叶面较平；T056B田间生长势稍强于T033B。西河点前期比较干旱，田间长势整体弱于东海点。A091B于7月13日现蕾，7月16日开花，7月21日打顶；植物学性状与东海点表现类似。其余试点陆续进入现蕾开花期，主要植物学性状与弥渡表现类似。

表6 改良新品系与对照品种的主要植物学性状（大理弥渡）

现蕾-开花期调查黑胫病自然发病情况，所有试点新品系黑胫病自然发病率均为0；弥渡东海点HDS黑胫病自然发病率为6.99%、西河点为7.87%，研和大田点HDS黑胫病自然发病率为3.07%（表7）。研和病圃点采用人工接种诱发鉴定，新品系无黑胫病发生，HDS发病率已达34.00%（表7）。

表7 改良新品系与对照品种的黑胫病自然发病情况

打顶后测量打顶株高、有效叶数、茎围、节距和腰叶长宽等农艺性状。弥渡东海点A091B与同田HDS各测定20株，A091B平均打顶株高105.8cm，有效叶数17.7片，茎围11.1cm，节距6.4cm，腰叶长82.6cm、宽31.6cm，与对照HDS接近、无显著差异（表8）。西河点A091B与同田HDS各测定30株，平均打顶株高109.3cm，有效叶数17.9片，茎围11.6cm，节距6.1cm，腰叶长79.4cm、宽29.1cm，与对照HDS接近（表8）。

表8 改良新品系A091B与对照品种HDS的主要农艺性状（大理弥渡）

打顶后测量打顶株高、有效叶数、茎围、节距和腰叶长宽等农艺性状。弥渡东海点A091B与同田HDS各测定20株，A091B平均打顶株高105.8cm，有效叶数17.7片，茎围11.1cm，节距6.4cm，腰叶长82.6cm、宽31.6cm，与对照HDS接近、无显著差异（表8）。西河点A091B与同田HDS各测定30株，平均打顶株高109.3cm，有效叶数17.9片，茎围11.6cm，节距6.1cm，腰叶长79.4cm、宽29.1cm，与对照HDS接近（表8）。

随机选取A091B新品系共30个单株，提取DNA；首先，利用与目的基因紧密连锁的4个前景标记辅助前景选择；结果表明，A091B含抗黑胫病基因；然后，直接利用577个背景标记辅助背景选择，选取背景回复率较高的前5个BC₄F₁单株；最后，再结合入选的5个BC₄F₁单株的田间综合表现（植物学性状、农艺性状）及评吸鉴定结果，最终选择编号为A091B的单株，经分析可知，其基因组除3个含有抗黑胫病基因前景小片段外，其余全部回复为红花大金元的基因型，背景回复率99%。

综上所述，A091B高抗黑胫病菌，主要植物学性状和农艺性状与对照品种红花大金元（DHS）相当，保持了红花大金元的特征特性，田间生长整齐，遗传性状稳定，实现了红花大金元品种抗黑胫病的定向改良，通过区试、工业验证的新品系就可以作为新品种申请审定。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种分子标记辅助选择定向改良烟草黑胫病抗性的育种方法

<130> 2016

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

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agacggggct aaatttgaca 20

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