本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一株不仅能够抑制单增李斯特菌、还能够更有效地抑制粪肠球菌生长的产细菌素的乳酸菌。
背景技术：
食品在加工、储藏、运输等过程中往往会受到腐败微生物和病原微生物的污染，从而引发食源性疾病，为了防止食品中腐败菌和病原菌生长而导致的食品腐败变质，添加食品防腐剂是不可缺少的。通常使用的食品防腐剂多为化学防腐剂。但是近年来，食品安全恶性事件不断发生，大部分是食品添加剂过量使用而带来的新的食品安全问题，化学防腐剂作为一类食品添加剂具有一定的安全隐患，长期过量使用对人体健康不利，消费者对添加化学防腐剂的食品心存顾忌，因此迫切需要寻找即可以抑菌，又无毒副作用、无残留、高效、安全的天然食品防腐剂。
乳酸菌产生的细菌素在这方面具有独特的优势。细菌素是细菌通过核糖体合成的一类蛋白质或肽类物质，因其具有抑菌活性而受到广泛关注。与化学防腐剂相比，细菌素作为一种蛋白类物质，可被蛋白酶水解而不会残留于人或动物体内，因此不易产生耐药性，故具有较高的安全性，可作为天然食品防腐剂和抗菌剂而应用于食品和医药领域。
乳酸菌是人和动物体内以及一些环境中存在的一类重要的微生物，其中绝大部分是人体内必不可少的且具有重要生理功能的益生菌，广泛存在于人体肠道中。它不仅能够调节胃肠道菌群平衡，提高人体免疫力，还具有其他一些生理功能，因此乳酸菌作为益生菌在食品领域中已经应用多年。另外，乳酸菌还能够产生对病原微生物具有拮抗作用的物质，如有机酸、细菌素等，这些物质能够抑制食源性致病菌和腐败菌的生长，在食品以及医药等行业具有潜在的应用价值，尤其是细菌素，由于它不会影响食品的风味，更适于用作天然的食品防腐剂。
目前由乳酸乳球菌产生的细菌素Nisin已被FDA批准用于食品生物保鲜中。但由于Nisin仅对部分革兰氏阳性菌有抑制作用，且在中性条件下溶解性差，稳定性较低，因而限制了Nisin在食品防腐保鲜中的应用。于是发现新的乳酸菌细菌素具有很大的应用潜力。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一株产细菌素的弯曲乳杆菌及其应用。本发明从中国传统发酵食品泡菜中筛选并提供了一株产细菌素的乳酸菌，不仅可以有效地控制食源性病菌单增李斯特菌的生长，还可以更有效地控制食源性病菌粪肠球菌的生长，并有效地控制食品体系中的粪肠球菌和单增李斯特菌污染，相对于化学防腐剂和抗生素而言，具有无残留、不产生抗药性和安全等特点。
本发明的技术方案如下：
本发明提供的乳酸菌为：弯曲乳杆菌SK1(Lactobacillus curvatus SK1)，保藏号为：CCTCC NO：M 2016540，保藏日期为2016年9月30日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心，中国，武汉，武汉大学。
所述弯曲乳杆菌SK1菌株产生的细菌素对粪肠球菌和单增李斯特菌具有有效的抑制作用。
本申请人还提供了所述弯曲乳杆菌的应用：将所述弯曲乳杆菌培养液直接喷涂于食品的表面，或混合于食品中，用于抑制食品中的粪肠球菌和单增李斯特菌。
本申请人还提供了所述弯曲乳杆菌产生细菌素的方法：将所述弯曲乳杆菌的菌株接种于MRS液体培养基于20～37℃培养16～48h，收集发酵上清液，得到液态细菌素产品。
优选的，将所述细菌素经冷冻干燥或喷雾干燥后得到粉末状细菌素产品。
所述细菌素对粪肠球菌和单增李斯特菌都有抑菌活性，具有很好的耐热性和耐酸性，并可被多种蛋白酶快速水解，不会引起残留。
本申请人还提供了所述弯曲乳杆菌产生纯的细菌素的方法：将所述弯曲乳杆菌的菌株接种于MRS液体培养基于20～37℃培养16～48h，收集发酵上清液，进行三步pH调节，即先将发酵液pH值调至6.5，离心或过滤后收集细胞；再将细胞重悬于0.1M NaCl中并将pH值调至2.0，离心或过滤后收集上清液；最后将pH值调至6.0，得到纯的细菌素产品。
本申请人还提供了制备得到的细菌素的应用：将所述细菌素产品直接喷涂于食品的表面，或混合于食品中，用于抑制食品中的粪肠球菌和单增李斯特菌；所述细菌素在食品中的添加量为不低于20AU/103cfu。
这株乳酸菌为能够产生细菌素的乳酸菌，从韩式泡菜中分离得到，为兼性厌氧型，在MRS固体培养基30℃培养48h后，菌落四周光滑透明，扁平，乳白色，革兰氏染色呈阳性，经16S rDNA鉴定为弯曲乳杆菌。
这株菌于MRS液体培养基中培养后的发酵上清液即为液态细菌素产品，对粪肠球菌和单增李斯特菌都具有良好的抑菌活性。经冷冻干燥或喷雾干燥后，得到粉末状细菌素产品。
由这株菌制备的细菌素具有很好的耐热性，100℃加热60min后仍能保留全部活性；它还具有比较好的耐酸性能和一定的耐碱性能，在pH 2～6下保存2h能保留全部活性，在pH 7～10下保存2h仍能保留一半活性。此外，这个细菌素可以被所测试的所有蛋白酶，包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶等快速水解而完全失去活性，因此该细菌素产品随食品摄入人体后，可以被消化道内的酶类快速降解，并吸收、再利用，不会残留，也不会对人体产生任何毒副作用。
对这株菌的发酵液采用三步pH调节法的具体操作方法为：1)先将pH值调至6.5，使细菌素吸附到弯曲乳杆菌SK1细胞表面，离心或过滤后收集细胞；2)再将细胞重悬于0.1M NaCl中并将pH值调至2.0，使细菌素从SK1细胞表面解吸下来，离心或过滤后收集上清液；3)最后将pH值调至6.0，就可以得到纯的细菌素产品。
纯化细菌素通常的方法是：先采用硫酸铵沉淀等方法进行粗分离，再采用阳离子交换色谱、凝胶过滤色谱或疏水色谱等进行细分离，从而得到纯的细菌素产品。与通常的方法相比，采用三步pH调节法纯化SK1细菌素具有简便、快速、成本低且规模大的优点。
当细菌素产品以不低于20AU/103cfu的添加量添加到染菌食品中，在1～7天内可将粪肠球菌和单增李斯特菌的数量降低1～2个数量级，抑菌效果明显。
具体实施方式
本乳酸菌保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC M 2016540，分类学命名：弯曲乳杆菌SK1(Lactobacillus curvatus SK1)。下列所述实施例中各原料和操作仪器均为普通市售。
实施例1：产细菌素乳酸菌的筛选和鉴定
MRS培养基的配制：将蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，葡萄糖20g，无水乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，磷酸氢二钾2.62g，七水硫酸镁0.58g，一水硫酸锰0.19g，吐温-80 1mL，加蒸馏水至1L，pH 6.2-6.4。
TSBYE培养基的配制：将Tryptone soya broth(TSB)30g，酵母提取物6g，加蒸馏水至1L，pH 7.2～7.4。
固体培养基的配制：在液体培养基中添加1.5％～2.0％琼脂。
(1)乳酸菌的分离与纯化
本发明所用泡菜材料均为自制，其制作方法为：将蔬菜(白菜、豆角、白萝卜)洗干净，与食盐、辣椒、香料混匀，放入泡菜缸中密封，置于阴凉干燥处，20℃左右发酵约一周，即得到泡菜。在无菌条件下，吸取100μL泡菜汁，进行梯度稀释，得到10-5、10-6、10-7的梯度稀释液。取不同梯度的稀释液100μL，分别加入到MRS固体平板上，并将菌悬液均匀涂布于平板表面，置于30℃培养48h。根据菌落形态的差异，用枪头挑取各种典型菌落，在另一MRS固体平板上进行划线，置于30℃培养48h。挑取单菌落重新划线两次，直至菌落完全纯化。
(2)产细菌素乳酸菌的筛选
将步骤(1)得到的纯菌株分别接种于MRS液体培养基中，置于30℃静置培养24h，得到发酵液，经20℃、10000rpm离心10min，得到发酵上清液。用5M NaOH将发酵上清液pH值调至5.5～6.0，排除有机酸的干扰；再置于80℃水浴加热10min，加热的目的是排除过氧化氢的干扰，得到乳酸菌待测样品。
将过夜培养的单增李斯特菌稀释到106cfu/mL，取100μL涂布于TSBYE固体平板，在表面放入几个牛津杯，在每个牛津杯中各加入100μL乳酸菌待测样品或MRS液体培养基，37℃下静置培养12h，通过牛津杯扩散法筛选出能够产生抑菌圈的乳酸菌待测样品，并保存对应的乳酸菌菌株。对于筛选出的乳酸菌待测样品，用终浓为2mg/mL的胰蛋白酶于37℃处理2h，再通过牛津杯扩散法检测处理后样品是否产生抑菌圈，若抑菌圈消失，则说明该菌株为产细菌素的菌株。
(3)产细菌素乳酸菌的鉴定
将筛选出的一株产细菌素的乳酸菌菌株SK1培养至对数生长期，提取其基因组DNA。利用细菌16S rDNA通用引物(正向引物AGAGTTTGATCCTGGCTC AG；反向引物ACGGCTACCTTGTTACGACTT)扩增出它的16S rDNA片段，连接到pMD19-T载体，测序，序列全长为1618bp(见序列表)。通过序列比对，证明为弯曲乳杆菌，命名为弯曲乳杆菌SK1。
实施例2：弯曲乳杆菌SK1细菌素的耐热性
细菌素活力的测定采用牛津杯连续二倍稀释法，指示菌为单增李斯特菌。一个活力单位(AU)定义为能使指示菌产生清晰透明圈的最少细菌素量。溶液的细菌素活力(AU/mL)＝2n×(1000/x)。n表示使指示菌产生抑菌圈的细菌素溶液的最大连续二倍稀释的次数；x表示每孔中添加的细菌素溶液的体积(μL)。测定活力所用的稀释液为20mM pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液。
SK1细菌素样品的制备：接种弯曲乳杆菌SK1至5mL MRS液体培养基中，30℃培养24h，以3％接种量转接至50mL MRS液体培养基中，30℃培养24h，发酵液经20℃、10000rpm离心10min，得到发酵上清液。用5M NaOH将发酵上清液pH值调至6.0，置于80℃水浴加热10min，得到SK1细菌素样品。
SK1细菌素样品的耐热性测定：将SK1细菌素样品在不同温度(25℃、80℃、100℃、121℃)下加热不同时间(30min、60min)，之后立即置于4℃，再通过牛津杯扩散法测定其残余活力。结果见表1所示。SK1细菌素样品具有良好的耐热性能，100℃加热60min后保留全部活性，只有在121℃加热30min才能使它失活。
表1 弯曲乳杆菌SK1细菌素的耐热性
实施例3：弯曲乳杆菌SK1细菌素的耐酸耐碱性
细菌素活力的测定方法同实施例2，SK1细菌素样品的制备方法基本同实施例2，但转接后于20℃培养48h。
SK1细菌素样品的耐酸耐碱性测定：将SK1细菌素样品用5M NaOH或4M HCl调至不同pH值(pH 2～10)，置于25℃下保存2h，再回调至pH 6.0，最后通过牛津杯法测定其残余活力。结果见表2所示。SK1细菌素样品具有比较好的耐酸性能，在pH 2～6下保存2h能保留全部活性，并具有一定的耐碱性能，在pH 7～10下保存2h仍能保留一半活性。
表2 弯曲乳杆菌SK1细菌素的耐酸耐碱性
实施例4：弯曲乳杆菌SK1细菌素的蛋白酶水解性能
细菌素活力的测定方法同实施例2，SK1细菌素样品的制备方法基本同实施例2，但转接后于37℃培养16h。
SK1细菌素样品的蛋白酶水解性能测定：将SK1细菌素样品分别用终浓为2mg/mL的胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶于37℃水解2h，再通过牛津杯扩散法测定其残余活力。结果见表3所示。SK1细菌素样品可以被所测试的所有四种蛋白酶在2h内快速水解而完全失去活性，因此易被降解，不会产生残留，故不会对人体产生任何毒副作用。
表3 弯曲乳杆菌SK1细菌素的酶解性
实施例5：弯曲乳杆菌SK1细菌素的抑菌谱
SK1细菌素样品的制备方法同实施例2。
然后制备涂布有不同细菌的指示平板：
分别接种单增李斯特菌CMCC54005、单增李斯特菌NB、单增李斯特菌2、金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌ATCC6538、痢疾志贺氏菌CMCC51334、阪崎肠杆菌ATCC51329、枯草杆菌WB01、沙门氏菌WS0001于TSBYE液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，稀释到一定浓度后涂布于TSBYE固体平板，使其菌落数约为106cfu。
分别接种植物乳杆菌SHC096、植物乳杆菌SHC167、短乳杆菌CC085、短乳杆菌SHC197、粪肠球菌WX108、粪肠球菌MT133、嗜热链球菌HI050、嗜热链球菌HI061、弯曲乳杆菌ATCC51436于MRS液体培养基中，30℃培养过夜，稀释到一定浓度后涂布于MRS固体平板，使其菌落数约为106cfu。
分别接种大肠杆菌JM109、大肠杆菌DH5α和大肠杆菌ATCC8099于LB液体培养基，37℃、200rpm培养过夜，稀释到一定浓度后涂布于LB固体平板，使其菌落数约为106cfu。
最后在不同指示平板上通过牛津杯扩散法检测弯曲乳杆菌SK1细菌素样品对不同细菌的菌苔是否产生抑菌圈，并测量抑菌圈直径。结果见表4所示。SK1细菌素样品对三株单增李斯特菌和两株粪肠球菌都有较强的抑菌活性，抑菌圈均超过15mm，尤其是对两株粪肠球菌，抑菌圈甚至大于20mm，而对其他细菌无抑菌活性。
表4 弯曲乳杆菌SK1细菌素的抑菌谱
牛津杯孔径大小为8mm；-：无抑菌圈；+：抑菌圈直径为8～15mm；++：抑菌圈直径为15～20mm；+++：抑菌圈直径>20mm。
实施例6：弯曲乳杆菌SK1细菌素纯品的制备
接种弯曲乳杆菌SK1至10mL MRS液体培养基中，30℃培养24h，以3％接种量转接至250mL MRS液体培养基中，30℃培养24h。将发酵液置于80℃水浴10min，排除过氧化氢的干扰，然后冷却至室温。
用5M NaOH调pH值至6.5，静置1h，使细菌素吸附到弯曲乳杆菌SK1细胞表面，再于4℃、10000rpm离心10min，收集菌体细胞沉淀。随后将菌体重悬于25mL 0.1M NaCl溶液中，用5％(v/v)磷酸调节pH值至2.0，在常温下轻微震荡3～4h，使细菌素从SK1细胞表面解吸下来，再于4℃、10000rpm离心10min，收集上清液。最后将上清液pH值调至6.0，得到SK1细菌素纯品。
实施例7：SK1细菌素产品对牛奶中单增李斯特菌的控制效果
取5mL牛奶加入到10mL的无菌试管中，加入105cfu/mL的单增李斯特菌溶液0.05mL，然后加入终浓度为20～40AU/mL的SK1细菌素产品，放置到4℃下，每24h测一次液体里面的活菌数，对比实验中加入等体积的无菌水代替。
结果表明，SK1细菌素产品作用于牛奶1天后，活菌数维持在8～9×102cfu/mL，随后的七天活菌数会逐渐增加至2.0×107cfu/mL；而对比实验中活菌数则增长至在1.3～7.9×108cfu/mL，SK1细菌素产品可将牛奶中单增李斯特菌的数量降低0.8～1.6个数量级，抑菌效果明显。
实施例8：SK1细菌素产品对牛奶中粪肠球菌的控制效果
取5mL牛奶加入到10mL的无菌试管中，加入105cfu/mL的粪肠球菌溶液0.05mL，然后加入终浓度为20～40AU/mL的SK1细菌素产品，放置到4℃下，每24h测一次液体里面的活菌数，对比实验中加入等体积的无菌水代替。
结果表明，SK1细菌素产品作用于牛奶2天后，活菌数维持在0.6～1.2×104cfu/mL，随后的七天活菌数会逐渐增加至2.1×106cfu/mL；而对比实验中活菌数则增长至在0.6～4.0×108cfu/mL，SK1细菌素产品可将牛奶中粪肠球菌的数量降低1.5～2.3个数量级，抑菌效果明显。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株产细菌素的弯曲乳杆菌及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1618
<212> DNA
<213> 弯曲乳杆菌 SK1
<400> 1
acgggccagt gattcgagct cggtacccgg ggatcctcta gagattacgg ctaccttgtt 60
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