一种马铃薯专用复合微生物菌剂及其制备方法与流程

本发明属于农业微生物技术领域，涉及一种马铃薯专用复合微生物菌剂及其制备方法。

背景技术：

马铃薯（solanumtuberosum）又称土豆、洋芋、山药蛋等，其食用部位是地下块茎，富含淀粉和粗蛋白质，可粮菜饲兼用；工业上可生产淀粉、酒精等，是典型的高产作物，也是我国部分马铃薯主产区农民脱贫致富、增加收入的支柱产业。马铃薯是全球第四大粮食作物，中国是世界马铃薯总产最多的国家。2016年2月23日，农业部发布《关于推进马铃薯产业开发的指导意见》，将马铃薯作为主粮产品进行产业化开发。

连作障碍引起的土壤恶化、病害积累等一直是困扰马铃薯生产的一大障碍。近年来，随着马铃薯产业化程度的提高，连作问题更加突出。马铃薯连作障碍的发生，不仅影响马铃薯产量和品质，同时还降低了产品的安全性。因此，急需解决马铃薯连作障碍问题，从而实现马铃薯的高产、稳产。

总结国内外马铃薯连作的研究成果，马铃薯连作障碍形成机制主要有土壤微生物变化、养分比列失调、盐渍化加重、土壤物理结构改变及植物自毒作用等，通过实施轮作、科学施肥等措施，可以有效控制连作障碍对马铃薯生产的影响。马铃薯的施肥，一般是以“有机肥为主，化肥为辅，重施基肥，早施追肥”为原则。鉴于马铃薯对肥料的特殊需求，尤其是对基肥的需求特殊，所以，普通的化肥和有机肥并不能够直接用于马铃薯。然而复合微生物菌剂是一种环境友好型肥料，其选用的微生物菌种均是来自于植物组织（根、茎、叶、鳞茎等）和根际土壤的有益菌，能够促进植物生长，消减作物的连作障碍，提高作物品质和产量，预防和治疗病虫害，改善土壤营养结构和理化性质，保持生态平衡，减少环境污染等。目前马铃薯施用的肥料以化学肥料为主，造成土壤板结，肥力下降等问题；病虫害的防治主要采用化学农药，不仅易产生抗药性，还会造成严重的环境污染等问题，而现有技术中还没有专门为降低马铃薯连作障碍而设计的复合微生物菌剂。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种符合马铃薯生长营养需求的马铃薯专用复合微生物菌剂及其制备方法。

本发明所述复合微生物菌剂用于协调营养，促进马铃薯生长，降低马铃薯连作障碍，提高马铃薯品质、产量以及抗病抗逆性，达到改善土壤特性的目的。

一种马铃薯专用复合微生物菌剂，其特征在于该复合微生物菌剂为含有菌株aspergilluapseududeflectusds03、菌株metarhiziumanisopliaesms07、菌株bacillussp.ds18、菌株bacilluslaterosporusles15、菌株bacillusmegateriumfbs3和菌株bacillussubtilisfbrs14的发酵液；所述发酵液中aspergilluapseududeflectusds03、metarhiziumanisopliaesms07、bacillussp.ds18、bacilluslaterosporusles15、bacillusmegateriumfbs3和bacillussubtilisfbrs14的群落总数依次为：1.0×10³～5.0×10⁴cfu/ml、1.0×10³～5.0×10⁴cfu/ml、8.0×10⁸～1.5×10¹⁰cfu/ml、8.0×10⁸～1.5×10¹⁰cfu/ml、8.0×10⁸～1.5×10¹⁰cfu/ml、8.0×10⁸～1.5×10¹⁰cfu/ml。

所述菌株aspergilluapseududeflectusds03保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号，中科学院微生物研究所，保藏日期为2015年12月7号，种名：假弯头曲霉，保藏号为cgmccno.11791。

所述菌株metarhiziumanisopliaesms07保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号，中科学院微生物研究所，保藏日期为2015年12月7号，种名：绿僵菌，保藏号为cgmccno.11792。

所述菌株bacillussp.ds18保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号，中科学院微生物研究所，保藏日期为2015年12月7号，种名：芽孢杆菌，保藏号为cgmccno.11829。

所述菌株bacilluslaterosporusles15保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号，中科学院微生物研究所，保藏日期为2015年12月7号，种名：侧孢芽孢杆菌，保藏号为cgmccno.11832。

所述菌株bacillusmegateriumfbs3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号，中科学院微生物研究所，保藏日期为2015年12月7号，种名：巨大芽孢杆菌，保藏号为cgmccno.11834。

所述菌株bacillussubtilisfbrs14保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号，中科学院微生物研究所，保藏日期为2015年12月7号，种名：枯草芽孢杆菌，保藏号为cgmccno.11835。

所述发酵液中aspergilluapseududeflectusds03、metarhiziumanisopliaesms07、bacillussp.ds18、bacilluslaterosporusles15、bacillusmegateriumfbs3和bacillussubtilisfbrs14的群落总数依次为：2.0×10⁴cfu/ml、3.0×10⁴cfu/ml、2.0×10⁹cfu/ml、6.0×10⁹cfu/ml、4.0×10⁹cfu/ml、6.0×10⁹cfu/ml。

上述马铃薯专用复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1）斜面培养：将菌株aspergilluapseududeflectusds03、菌株metarhiziumanisopliaesms07、菌株bacillussp.ds18、菌株bacilluslaterosporusles15、菌株bacillusmegateriumfbs3和菌株bacillussubtilisfbrs14六种微生物菌株分别接种于固体培养基，活化菌株；

2）一级种子培养：，将步骤1）活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，150-180rpm摇床培养；

3）混合发酵培养：将步骤2）一级种子接种于液体培养基中，进行复合菌剂摇床培养，即得马铃薯专用复合微生物菌剂。

步骤1）中，菌株aspergilluapseududeflectusds03、菌株metarhiziumanisopliaesms07在15℃～38℃条件下接种于pda固体培养基上培养3-5天；菌株bacillussp.ds18、菌株bacilluslaterosporusles15、菌株bacillusmegateriumfbs3和菌株bacillussubtilisfbrs14在20℃～30℃条件下接种于na固体培养基上，培养2-3天。

步骤2）中，菌株aspergilluapseududeflectusds03、菌株metarhiziumanisopliaesms07在20℃～38℃条件下接种于pda液体培养基中摇床培养3-5天；菌株bacillussp.ds18、菌株bacilluslaterosporusles15、菌株bacillusmegateriumfbs3和菌株bacillussubtilisfbrs14在20℃～30℃条件下接种于na液体培养基中摇床培养3-5天。

步骤3）中，接种量为液体培养基的体积的0.5%-2%，优选1%。

步骤3）中，所述混合发酵培养条件：温度20-28℃；150-200rpm，优选180rpm；培养3-5天。

所述pda培养基成分为：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000ml，ph6.0-6.5；na培养基成分：牛肉膏5g、蛋白胨10g、nacl5g、蒸馏水1000ml，ph7.0-7.2，121℃灭菌20min。

本发明所述复合微生物菌剂能促进马铃薯生长、降低连作障碍、提高抗逆性及改良作物土壤特性。本发明所述复合微生物菌剂施用在种植马铃薯的根际土壤中，施用方法为土壤灌溉。

上述操作步骤如无特别说明，均按本领域常规操作。

本发明的有益效果：本发明的马铃薯专用复合微生物菌剂施用后大量的有益菌补充到土壤中后，在作物根系周围形成保护屏障，抑制有害菌的生长，繁殖，保护作物根系，同时抑制各种病虫害，从而提高马铃薯抗旱、抗病虫害等抗逆性；活菌在根际定殖后，能够改善种植土壤生态环境，改良土壤结构和理化性质，降低连作障碍。

本发明的马铃薯专用复合微生物菌剂能够为马铃薯生长提供营养。发酵过程中微生物产生多种有效代谢产物具有固氮、解磷、解钾的作用，从而提高马铃薯的生物产量和品质；

本发明的马铃薯专用复合微生物菌剂的菌株是来源于植物组织（根、茎、叶、鳞茎等）和根际土壤的有益菌，不会引入致病菌，不污染环境，无毒副作用；现有技术中多种菌复合容易出现菌株之间相互抑制，影响生长的现象，本发明经过长期摸索，选择的菌株之间不会相互抑制，在定殖生长、功能效果上还能互补。

本发明产品的各个组分配比，可根据具体的土壤条件和不同生育期的需求顾虑，进行适当的调整，以满足作物的生长。

附图说明

图1为不同处理的30株马铃薯块茎总数。

图2为不同处理的30株马铃薯块茎总重量。

图3为不同重量马铃薯块茎所占比例，主要展示不同处理对马铃薯产量的影响。

图4为不同粗糙度马铃薯块茎所占比例，主要展示不同处理对马铃薯品质的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下述实施例中所用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。

实施例1.

马铃薯专用复合微生物菌剂的组成：

假弯头曲霉菌株ds032.0×10⁴cfu/ml；

绿僵菌菌株sms073.0×10⁴cfu/ml；

芽孢杆菌菌株ds182.0×10⁹cfu/ml；

侧孢芽孢杆菌菌株les156.0×10⁹cfu/ml；

巨大芽孢杆菌菌株fbs34.0×10⁹cfu/ml；

枯草芽孢杆菌菌株fbrs146.0×10⁹cfu/ml。

上述马铃薯专用复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1）斜面培养：将菌株ds03（aspergilluapseududeflectus）、菌株sms07（metarhiziumanisopliae）、菌株ds18（bacillussp.）、菌株les15（bacilluslaterosporus）、菌株fbs3（bacillusmegaterium）和菌株fbrs14（bacillussubtilis）六种微生物菌株分别接种于固体培养基，活化菌株；

2）一级种子培养：将步骤1）活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，180rpm摇床培养；

3）混合发酵培养：将步骤2）一级种子接种于液体培养基中，进行复合菌剂摇床培养，得到马铃薯专用复合微生物菌剂。

上述制备方法中，在步骤1）中，将菌株ds03（aspergilluapseududeflectus）、菌株sms07（metarhiziumanisopliae）在30℃条件下接种于pda固体培养基上培养4天；菌株ds18（bacillussp.）、菌株les15（bacilluslaterosporus）、菌株fbs3（bacillusmegaterium）和菌株fbrs14（bacillussubtilis）在28℃条件下接种于na固体培养基上，培养3天；

在步骤2）中，将菌株ds03（aspergilluapseududeflectus）、菌株sms07（metarhiziumanisopliae）在30℃条件下接种于pda液体培养基中摇床培养3天；菌株ds18（bacillussp.）、菌株les15（bacilluslaterosporus）、菌株fbs3（bacillusmegaterium）和菌株fbrs14（bacillussubtilis）在28℃条件下接种于na液体培养基中摇床培养3天；

在步骤3）中，接种量为液体培养基的体积的1%；

在步骤3）中，混合发酵培养条件：温度28℃；180rpm；培养5天。

实施例2

马铃薯专用复合微生物菌剂的组成：

假弯头曲霉菌株ds031.0×10³cfu/ml；

绿僵菌菌株sms071.0×10³cfu/ml；

芽孢杆菌菌株ds188.4×10⁸cfu/ml；

侧孢芽孢杆菌菌株les158.1×10⁸cfu/ml；

巨大芽孢杆菌菌株fbs38.2×10⁸cfu/ml；

枯草芽孢杆菌菌株fbrs148.8×10⁸cfu/ml；

所述菌剂制备方法同实施例1.区别在于：

在步骤1）中，将菌株ds03（aspergilluapseududeflectus）、菌株sms07（metarhiziumanisopliae）在20℃条件下接种于pda固体培养基上培养5天；菌株ds18（bacillussp.）、菌株les15（bacilluslaterosporus）、菌株fbs3（bacillusmegaterium）和菌株fbrs14（bacillussubtilis）在20℃条件下接种于na固体培养基上，培养3天；

在步骤2）中，将菌株ds03（aspergilluapseududeflectus）、菌株sms07（metarhiziumanisopliae）在15℃条件下接种于pda液体培养基中摇床培养3天；菌株ds18（bacillussp.）、菌株les15（bacilluslaterosporus）、菌株fbs3（bacillusmegaterium）和菌株fbrs14（bacillussubtilis）在20℃条件下接种于na液体培养基中摇床培养3天；

在步骤3）中，接种量为液体培养基的体积的0.5%；

在步骤3）中，混合发酵培养条件：温度20℃；180rpm；培养4天。

实施例3

马铃薯专用复合微生物菌剂的组成：

假弯头曲霉菌株ds033.0×10⁴cfu/ml；

绿僵菌菌株sms075.0×10⁴cfu/ml；

芽孢杆菌菌株ds181.2×10¹⁰cfu/ml；

侧孢芽孢杆菌菌株les151.5×10¹⁰cfu/ml；

巨大芽孢杆菌菌株fbs31.3×10¹⁰cfu/ml；

枯草芽孢杆菌菌株fbrs141.4×10¹⁰cfu/ml。

所述菌剂制备方法同实施例1。区别在于：

在步骤1）中，将菌株ds03（aspergilluapseududeflectus）、菌株sms07（metarhiziumanisopliae）在38℃条件下接种于pda固体培养基上培养3天；菌株ds18（bacillussp.）、菌株les15（bacilluslaterosporus）、菌株fbs3（bacillusmegaterium）和菌株fbrs14（bacillussubtilis）在30℃条件下接种于na固体培养基上，培养2天；

在步骤2）中，将菌株ds03（aspergilluapseududeflectus）、菌株sms07（metarhiziumanisopliae）在38℃条件下接种于pda液体培养基中摇床培养2天；菌株ds18（bacillussp.）、菌株les15（bacilluslaterosporus）、菌株fbs3（bacillusmegaterium）和菌株fbrs14（bacillussubtilis）在30℃条件下接种于na液体培养基中摇床培养3天；

在步骤3）中，接种量为液体培养基的体积的2%；

在步骤3）中，混合发酵培养条件：温度20℃；150rpm；培养5天。

实施例4马铃薯专用复合微生物菌剂田间应用效果

试验设计：

施用时间为马铃薯块茎形成期。

施用方法为土壤灌溉，以不施用本产品同一地域同品种马铃薯为试验对照。

试验地点：甘肃省兰州市七里河区西果园乡马铃薯种植基地，露地直播，覆盖地膜。

供试品种：“新大坪”一级种。

试验设计采用完全随机区组设计，共2个区组，株距30~40cm，行距70cm，各处理间设2保护行。各种栽培管理措施按照当地高产优质马铃薯栽培技术精心管理。各处理马铃薯达到收获期进行样品采集。

试验结果：

（1）施用本发明所述马铃薯专用复合微生物菌剂处理的马铃薯总重量及单个个体重量明显比常规对照组高，两者达到显著差异，复合菌剂处理的马铃薯产量比对照提高了57.5%。由此表明施用复合微生物菌剂能明显降低连作障碍，提高马铃薯的产量。具体见表1、图1、2。

表1不同处理马铃薯产量

（2）施用本发明所述马铃薯专用复合微生物菌剂对马铃薯生长具有明显的促进作用，处理组马铃薯在生长性状指标上明显优于常规对照组。复合微生物菌剂处理的马铃薯单个重量大于150g的数量明显大于常规对照组，而常规对照组单个重量大多数小于100g，由此表明复合微生物菌剂对马铃薯产量提升起到很大的作用。具体见表2、图3。

表2不同处理马铃薯产量性状指标

（3）马铃薯的表皮粗糙程度反映马铃薯的品相、口感，表皮粗糙程度与产品品相和口感成正比。施用本发明所述马铃薯专用复合微生物菌剂对马铃薯品相和口感有很大的协同增强效应，处理的马铃薯表皮粗糙度明显大于常规对照。由此可见，马铃薯专用复合微生物菌剂不仅提高马铃薯产量，同时对马铃薯的生物品质和品相方面都有极大的提高，提升了马铃薯的市场竞争力。具体见表3、图4。

表3不同处理马铃薯品质

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