一种重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵方法与发酵培养基与流程

本发明涉及工程菌发酵技术领域，具体而言，涉及一种重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵方法与发酵培养基。

背景技术：

目前，现有的用于生产出人胶原蛋白(Human Collagen)的大肠杆菌发酵方法主要是以包涵体形式进行生产，该方法虽然能够形成高产，但是在包涵体复性和后续纯化方面会形成复杂繁琐的工艺流程，限制了目标蛋白的规模化生产。目前也有可溶性表达系统用于生产出可溶性的人胶原蛋白，虽然，避开了包涵体的问题。但是，目标产物人胶原蛋白的产量很低，不足以进行规模化生产。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵方法，该发酵方法能够提高重组人源III型胶原蛋白工程菌的重组人源III型胶原蛋白的表达量。

本发明的另一目的在于提供一种发酵培养基，该发酵培养基能够适用于重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵，能够提高提高重组人源III型胶原蛋白工程菌的重组人源III型胶原蛋白的表达量。

本发明是这样实现的：

一种重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵方法，其包括：将重组人源III型胶原蛋白工程菌接种至基础发酵培养液中，进行发酵培养，基础发酵培养液按每升计包括：H₃PO₄25-27ml、CaSO₄ 0.8-1.0g、K₂SO₄ 17-19g、MgSO₄·7H₂O 13-15.5g、KOH 3.8-4.3g、甘油37-43g以及第一微量元素液3.5-4.2ml；

在发酵培养的过程中，往基础发酵培养液中加入补料，补料包括甘油和第二微量元素液；

其中，第一微量元素液和第二微量元素液均按每升计包括：CuSO₄·5H₂O 5-7g、NaI 0.06-0.09g、MnSO₄·H₂O 2.5-3.2g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1-0.3g、H₃BO₃ 0.01-0.03g、CoCl₂0.4-0.6g、ZnCl₂18-22g、FeSO₄·7H₂O 60-68g、V_H 0.1-0.3g以及H₂SO₄4-6ml。

一种发酵培养基，其包括基础发酵培养液和补料，基础发酵培养液按每升计包括：H₃PO₄ 25-27ml、CaSO₄ 0.8-1.0g、K₂SO₄ 17-19g、MgSO₄·7H₂O 13-15.5g、KOH 3.8-4.3g、甘油37-43g以及第一微量元素液3.5-4.2ml，补料包括甘油和第二微量元素液；

第一微量元素液和第二微量元素液均按每升计包括：CuSO₄·5H₂O 5-7g、NaI 0.06-0.09g、MnSO₄·H₂O 2.5-3.2g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1-0.3g、H₃BO₃ 0.01-0.03g、CoCl₂0.4-0.6g、ZnCl₂18-22g、FeSO₄·7H₂O 60-68g、V_H 0.1-0.3g以及H₂SO₄4-6ml。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵方法，根据重组人源III型胶原蛋白工程菌的生长特性，优化基础发酵培养液的成分用量为按每升计包括：H₃PO₄ 25-27ml、CaSO₄ 0.8-1.0g、K₂SO₄ 17-19g、MgSO₄·7H₂O 13-15.5g、KOH 3.8-4.3g、甘油37-43g以及第一微量元素液3.5-4.2ml，其为重组人源III型胶原蛋白工程菌的生长提供最佳营养基础，同时，根据发酵培养过程中营养物质的消耗，适时地加入含有甘油和第二微量元素液的补料，保证重组人源III型胶原蛋白工程菌的生长活力。

其中，又对第一微量元素液和第二微量元素液进行了优化，二者均按每升计包括：CuSO₄·5H₂O 5-7g、NaI 0.06-0.09g、MnSO₄·H₂O2.5-3.2g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1-0.3g、H₃BO₃0.01-0.03g、CoCl₂0.4-0.6g、ZnCl₂18-22g、FeSO₄·7H₂O 60-68g、V_H 0.1-0.3g以及H₂SO₄4-6ml，为重组人源III型胶原蛋白工程菌的生长提供充足的微量元素，进而可以高产量的表达出重组人源III型胶原蛋白，以适用于规模化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例提供的重组人源III型胶原蛋白工程菌的生物保藏信息；

图2为本发明提供的实施例1-3得到的发酵液上清的凝胶电泳图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵方法与发酵培养基进行具体说明。

本发明实施例提供的重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵方法，包括：

将重组人源III型胶原蛋白工程菌接种至基础发酵培养液中，进行发酵培养。

基础发酵培养液按每升计包括：H₃PO₄ 25-27ml、CaSO₄ 0.8-1.0g、K₂SO₄ 17-19g、MgSO₄·7H₂O 13-15.5g、KOH 3.8-4.3g、甘油37-43g以及第一微量元素液3.5-4.2ml。

在发酵培养的过程中，往基础发酵培养液中加入补料，补料包括甘油和第二微量元素液。

其中，第一微量元素液和第二微量元素液均按每升计包括：CuSO₄·5H₂O 5-7g、NaI 0.06-0.09g、MnSO₄·H₂O 2.5-3.2g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1-0.3g、H₃BO₃ 0.01-0.03g、CoCl₂0.4-0.6g、ZnCl₂18-22g、FeSO₄·7H₂O 60-68g、V_H 0.1-0.3g以及H₂SO₄4-6ml。

优选地，采用保藏编号为CGMCC No.12491的重组人源III型胶原蛋白工程菌进行发酵。

该重组人源III型胶原蛋白工程菌生物保藏信息：分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)，于2016年5月23日在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.12491。本实施例所用重组人源III型胶原蛋白工程菌的生物保藏信息以及存活证明可参见图1。

需要说明的是，本发明的实施例中采用保藏编号为CGMCC No.12491的重组人源III型胶原蛋白工程菌进行发酵培养，在其他的实施例中，也是可以采用其他的菌种进行发酵培养，菌种的选择并不限于保藏编号为CGMCC No.12491的重组人源III型胶原蛋白工程菌。本发明的所用的重组人源III型胶原蛋白工程菌只要其具有表达出重组人源III型胶原蛋白的能力即可。

优选地，在发酵培养的过程中，于基础发酵培养液的溶氧升至50％-60％时，添加补料。在溶氧升至50％-60％时，基础发酵培养液中的碳源即甘油消耗完全，此时添加含有甘油和微量元素液的补料，能够持续地为重组人源III型胶原蛋白工程菌提供碳源，保证其生长活力。

优选地，补料按每升计包括：460-520g的甘油和4-6ml的第二微量元素液。

优选地，按每升基础发酵培养液计，加入补料的体积为72-90ml。

优选地，按10-12ml/min的流速加入补料。

进一步地，在发酵培养的过程中，在添加补料后，往基础发酵培养液中添加甲醇，进行诱导培养。

优选地，于基础发酵培养液的溶氧升至80％-95％时，以第一流速添加甲醇；然后在基础发酵培养液的溶氧降至40％-45％时，以第二流速添加甲醇并控制基础发酵培养液的溶氧为10％-40％。其中，第一流速小于第二流速。

根据溶氧不同，以不同流速进行添加甲醇，先慢后快，可以使得基础发酵培养液的重组人源III型胶原蛋白工程菌能够更好地适应培养环境，避免甲醇加入初期时的流速过高重组人源III型胶原蛋白工程菌带来不适。

更优选地，第一流速为1.8-2.2ml/h·L，第二流速为4-6ml/h·L。采用该流速搭配的方式添加甲醇可以确保重组人源III型胶原蛋白工程菌不受甲醇加入带来的培养环境的改变的影响。可确保其诱导重组人源III型胶原蛋白工程菌的组人胶原蛋白表达量最高。

需要说明的是，第一流速为1.8-2.2ml/h·L是指按每升基础发酵培养液计每小时加入到基础发酵培养液中的甲醇体积为1.8-2.2ml。第二流速为4-6ml/h·L是指按每升基础发酵培养液计每小时加入到基础发酵培养液中的甲醇体积为4-6ml。

进一步地，在发酵培养过程中，控制发酵温度为27℃-29℃、控制基础发酵培养液的pH为4.8-5.2。保持发酵环境的温度和pH值处于相对恒定的状态，有利于重组人源III型胶原蛋白工程菌的生长和繁殖。

优选地，将重组人源III型胶原蛋白工程菌接种至基础发酵培养液中是指：将重组人源III型胶原蛋白工程菌种子液按1:6-12的体积比接种至基础发酵培养液中，重组人源III型胶原蛋白工程菌种子液由重组人源III型胶原蛋白工程菌经活化培养后得到。经过活化培养的重组人源III型胶原蛋白工程菌的活力更强。

更优选地，按如下步骤进行活化培养：取冷冻保存的重组人源III型胶原蛋白工程菌，融化后，将重组人源III型胶原蛋白工程菌划线接种至YPD固体培养基，培养得到单菌落。挑取单菌落接种至第一YPD液体培养基中，培养，得到活化培养液。将活化培养液接种至第二YPD液体培养基中，培养，即得到上述的重组人源III型胶原蛋白工程菌种子液。

需要说明的，在其他的实施例中，也可以不进行步骤，该活化培养的步骤是可选步骤，可根据重组人源III型胶原蛋白工程菌的活性强度进行选择。例如，接种初期时，重组人源III型胶原蛋白工程菌的活性就比较强，就可以直接将其接种中基础发酵培养基进行发酵培养。或者，需要用到长期在-80℃保存的重组人源III型胶原蛋白工程菌进行发酵培养，则可旋转先进行活化培养，得到活力较强的重组人源III型胶原蛋白工程菌种子液，然后在进行发酵培养。

另外，本发明提供的一种发酵培养基，其包括基础发酵培养液和补料。基础发酵培养液按每升计包括：H₃PO₄ 25-27ml、CaSO₄ 0.8-1.0g、K₂SO₄ 17-19g、MgSO₄·7H₂O 13-15.5g、KOH 3.8-4.3g、甘油37-43g以及第一微量元素液3.5-4.2ml。补料包括甘油和第二微量元素液。

第一微量元素液和第二微量元素液均按每升计包括：CuSO₄·5H₂O 5-7g、NaI 0.06-0.09g、MnSO₄·H₂O 2.5-3.2g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1-0.3g、H₃BO₃ 0.01-0.03g、CoCl₂0.4-0.6g、ZnCl₂18-22g、FeSO₄·7H₂O 60-68g、V_H 0.1-0.3g以及H₂SO₄4-6ml。

该发酵培养基可适用于上述发酵方法进行发酵培养，也可以适用于其他发酵方法的发酵培养。只要采用上述的发酵培养基进行发酵培养即落入本发明的保护范围。

综上，本发明的重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵方法，根据重组人源III型胶原蛋白工程菌的生长特性，优化基础发酵培养液的成分用量为按每升计包括：H₃PO₄ 25-27ml、CaSO₄ 0.8-1.0g、K₂SO₄ 17-19g、MgSO₄·7H₂O 13-15.5g、KOH 3.8-4.3g、甘油37-43g以及第一微量元素液3.5-4.2ml，其为重组人源III型胶原蛋白工程菌的生长提供最佳营养基础，同时，根据再发酵培养过程中营养物质的消耗，适时地加入含有甘油和第二微量元素液的补料，保证重组人源III型胶原蛋白工程菌的生长活力。

其中，又对第一微量元素液和第二微量元素液进行了优化，二者均按每升计包括：CuSO₄·5H₂O 5-7g、NaI 0.06-0.09g、MnSO₄·H₂O 2.5-3.2g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1-0.3g、H₃BO₃0.01-0.03g、CoCl₂0.4-0.6g、ZnCl₂18-22g、FeSO₄·7H₂O 60-68g、V_H 0.1-0.3g以及H₂SO₄4-6ml，为重组人源III型胶原蛋白工程菌的生长提供充足的微量元素，进而可以高产量的表达出重组人源III型胶原蛋白，以适用于规模化生产。

综上，本发明提供的重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵方法以及发酵培养基通过对培养基成分含量和发酵环境体系的优化，以及补料和诱导剂即甲醇的加入时间和流速等参数的优化等，使得本发明的发酵方法大大地提供了重组人源III型胶原蛋白工程菌的蛋白表达量，本发明提供的发酵方法和发酵培养基能够适用于工业化的大规模生产。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵方法的操作步骤如下。

1活化菌种

1.1取冷冻保存的重组人源III型胶原蛋白工程菌，融化后，将重组人源III型胶原蛋白工程菌划线接种至YPD固体培养基，于28℃、生长48小时至单菌落直径为3mm左右。

其中，本实施例所用的重组人源III型胶原蛋白工程菌是以重组表达载体pPICZaA转化毕赤酵母(Pichia Pastoris)后得到，其中，pPICZaA携带有编码人胶原蛋白的人胶原蛋白基因(Col3-3)，该基因5’端的酶切位点是XhoI，3’端的酶切位点是SacII。

本实施例所用的重组人源III型胶原蛋白工程菌生物保藏信息：分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)，于2016年5月23日在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.12491。本实施例所用重组人源III型胶原蛋白工程菌的生物保藏信息以及存活证明可参见图1。

其中，本实施例所用的YPD固体培养基的可参考如下方法制作。配制1L的YPD固体培养基：取20g细菌培养用胰化蛋白胨、10g细菌培养用酵母提取物、20g NaCl、20g细菌培养用琼脂，加入到容器中，加入去离子水完全溶解溶质，用去离子水定容至1L，在15lbf/in2(1.034×10⁵Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。

1.2挑取单菌落接种至200ml的第一YPD液体培养基中，于28℃、200r/min条件下，活化培养24左右，得到活化培养液。

其中，本实施例所用的第一YPD液体培养基的可参考如下方法制作。配制200ml的第一YPD液体培养基：取4g细菌培养用胰化蛋白胨、2g细菌培养用酵母提取物、4g NaCl，加入到容器中，加入去离子水完全溶解溶质定容至200ml，在15lbf/in2(1.034×10⁵Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟，待培养基温度降至50℃时方可加入不耐热的物质。

1.3按1:20的体积比，将活化培养液接种至200ml的第二YPD液体培养基中，于28℃、200r/min，培养24h左右，得到重组人源III型胶原蛋白工程菌种子液。

其中，第二YPD液体培养基的制作方法与步骤1.2中的第一YPD液体培养基相同。

2发酵培养

2.1将得到的重组人源III型胶原蛋白工程菌种子液以1:12的体积比接种至含有40L基础发酵培养液的发酵罐(上海百伦、型号：BLBIO-100STA-UIP、总发酵容量70L)。该发酵罐可显示溶氧、pH、温度、搅拌转速等参数，并带有蠕动泵可进行pH自动控制和自动补料。

其中，本实施例所用的基础发酵培养液按每升计包括：H₃PO₄ 26.7ml、CaSO₄0.93g、K₂SO₄ 18.2g、MgSO₄·7H₂O 14.9g、KOH 4.13g、甘油40g以及微量元素液4ml。

其中，本实施例所用的微量元素液按每升计包括：：CuSO₄·5H₂O 6g、NaI 0.08g、MnSO₄·H₂O 3g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g、H₃BO₃ 0.02g、CoCl₂0.5g、ZnCl₂20g、FeSO₄·7H₂O 65g、V_H0.2g以及H₂SO₄5ml。微量元素液可参考如下方法制作：按前述配方取各组分，用去离子水定容至1L，充分搅拌后，用0.22μm滤膜进行过滤除菌，于4℃保存。

2.2调节发酵罐参数，以控制发酵条件，进行发酵培养。

其中，本实施例的发酵条件具体为：控制发酵温度28℃，控制基础发酵培养液的pH为5.0，采用7mol/L氨水调节基础发酵培养液pH。

2.3添加补料。待发酵罐里的甘油消耗完，溶氧上升至50％左右时，往发酵罐中加入总体积为2880ml的补料(按每升基础发酵培养液计，加入补料的体积为72ml。)，该2880ml的补料按流速12ml/min的流速加入至基础发酵培养液。加入补料后，基础发酵培养液中的溶氧下降，继续培养。

其中，本实施例所用的补料按每升计包括：甘油500g和微量元素液4ml。

2.4添加甲醇，诱导培养。当溶氧上升至80％时，饥饿培养30分钟，再往基础发酵培养液中加入甲醇，进行诱导培养。具体地，以第一流速2ml/h·L添加甲醇；然后在基础发酵培养液的溶氧降至40％时，以第二流速4ml/h·L添加继续甲醇，并控制基础发酵培养液的溶氧为30％左右。诱导培养72h左右后，可结束整个发酵培养过程。含有重组人源III型胶原蛋白的得到发酵液。

2.5停止发酵后，采用现有提取工艺例如固液分离法、离子交换法等，可从发酵液中提纯出人胶原蛋白。

实施例2

本实施例提供的重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵方法的操作步骤如下。

1活化菌种

本实施例中的活化菌种的具体步骤与实施例1基本相同，以得到重组人源III型胶原蛋白工程菌种子液。

2发酵培养

2.1将得到的重组人源III型胶原蛋白工程菌种子液以1:10的体积比接种至含有40L基础发酵培养液的发酵罐(上海百伦、型号：BLBIO-100STA-UIP、总容量60L)。该发酵罐可显示溶氧、pH、温度、搅拌转速等参数，并带有蠕动泵可进行pH自动控制和自动补料。

其中，本实施例所用的基础发酵培养液按每升计包括：H₃PO₄ 25ml、CaSO₄ 0.8g、K₂SO₄ 19g、MgSO₄·7H₂O 15.5g、KOH 4.3g、甘油37g以及微量元素液4.2ml。

其中，本实施例所用的微量元素液按每升计包括：：CuSO₄·5H₂O 7g、NaI 0.09g、MnSO₄·H₂O 2.5g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1g、H₃BO₃ 0.01g、CoCl₂0.6g、ZnCl₂22g、FeSO₄·7H₂O 68g、V_H0.3g以及H₂SO₄6ml。微量元素液可参考如下方法制作：按前述配方取各组分，用去离子水定容至1L，充分搅拌后，用0.22μm滤膜进行过滤除菌，于4℃保存。

2.2调节发酵罐参数，以控制发酵条件，进行发酵培养。

其中，本实施例的发酵条件具体为：控制发酵温度27℃，控制基础发酵培养液的pH为5.2，采用7mol/L氨水调节基础发酵培养液pH。

2.3添加补料。待发酵罐里的甘油消耗完，溶氧上升至55％左右时，往发酵罐中加入总体积为3600ml的补料(按每升基础发酵培养液计，加入补料的体积为90ml。)，该3600ml的补料按流速10ml/min的流速加入至基础发酵培养液。加入补料后，基础发酵培养液中的溶氧下降，继续培养。

其中，本实施例所用的补料按每升计包括：甘油520g和微量元素液6ml。

2.4添加甲醇，诱导培养。当溶氧上升至85％时，饥饿培养30分钟，再往基础发酵培养液按中加入甲醇，进行诱导培养。具体地，以第一流速1.8ml/h添加甲醇；然后在基础发酵培养液的溶氧降至45％时，以第二流速6ml/h·L添加继续甲醇，并控制基础发酵培养液的溶氧为30％左右。诱导培养72h左右后，可结束整个发酵培养过程。含有重组人源III型胶原蛋白的得到发酵液

2.5停止发酵后，采用现有提取工艺例如固液分离法、离子交换法等，可从发酵液中提纯出人胶原蛋白。

实施例3

本实施例提供的重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵方法的操作步骤如下。

1活化菌种

本实施例中的活化菌种的具体步骤与实施例1基本相同，以得到重组人源III型胶原蛋白工程菌种子液。

2发酵培养

2.1将得到的重组人源III型胶原蛋白工程菌种子液以1:8的体积比接种至含有40L基础发酵培养液的发酵罐(上海百伦、型号：BLBIO-100STA-UIP、总发酵容量70L)。该发酵罐可显示溶氧、pH、温度、搅拌转速等参数，并带有蠕动泵可进行pH自动控制和自动补料。

其中，本实施例所用的基础发酵培养液按每升计包括：H₃PO₄ 27ml、CaSO₄ 1.0g、K₂SO₄ 17g、MgSO₄·7H₂O 13g、KOH 3.8g、甘油43g以及微量元素液3.5ml。

其中，本实施例所用的微量元素液按每升计包括：：CuSO₄·5H₂O 5g、NaI 0.06g、MnSO₄·H₂O 3.2g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.3g、H₃BO₃ 0.03g、CoCl₂0.4g、ZnCl₂18g、FeSO₄·7H₂O 60g、V_H0.1g以及H₂SO₄4ml。微量元素液可参考如下方法制作：按前述配方取各组分，用去离子水定容至1L，充分搅拌后，用0.22μm滤膜进行过滤除菌，于4℃保存。

2.2调节发酵罐参数，以控制发酵条件，进行发酵培养。

其中，本实施例的发酵条件具体为：控制发酵温度29℃，控制基础发酵培养液的pH为4.8，采用7mol/L氨水调节基础发酵培养液pH。

2.3添加补料。待发酵罐里的甘油消耗完，溶氧上升至60％左右时，按往发酵罐中加入总体积为2880ml的补料，该2880ml的补料按流速11ml/min的流速加入至基础发酵培养液。加入补料后，基础发酵培养液中的溶氧下降，继续培养。

其中，本实施例所用的补料按每升计包括：甘油460g和微量元素液4ml。

2.4添加甲醇，诱导培养。当溶氧上升至95％时，饥饿培养30分钟，再往基础发酵培养液按中加入甲醇，进行诱导培养。具体地，以第一流速2.2ml/h添加甲醇；然后在基础发酵培养液的溶氧降至40％时，以第二流速4ml/h·L添加继续甲醇，并控制基础发酵培养液的溶氧为30％左右。诱导培养72h左右后，可结束整个发酵培养过程。含有重组人源III型胶原蛋白的得到发酵液。

2.5停止发酵后，采用现有提取工艺例如固液分离法、离子交换法等，可从发酵液中提纯出人胶原蛋白。

实施例4

本实施例提供的重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵方法的操作步骤如下。

1活化菌种

本实施例中的活化菌种的具体步骤与实施例1基本相同，以得到重组人源III型胶原蛋白工程菌种子液。

2发酵培养

2.1将得到的重组人源III型胶原蛋白工程菌种子液以1:6的体积比接种至含有40L基础发酵培养液的发酵罐(上海百伦、型号：BLBIO-100STA-UIP、总发酵容量70L)。该发酵罐可显示溶氧、pH、温度、搅拌转速等参数，并带有蠕动泵可进行pH自动控制和自动补料。

其中，本实施例所用的基础发酵培养液按每升计包括：H₃PO₄ 26.7ml、CaSO₄0.93g、K₂SO₄ 17g、MgSO₄·7H₂O 15.5g、KOH 4.3g、甘油40g以及微量元素液4ml。

其中，本实施例所用的微量元素液按每升计包括：：CuSO₄·5H₂O 5g、NaI 0.08g、MnSO₄·H₂O 3.2g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1g、H₃BO₃ 0.01g、CoCl₂0.5g、ZnCl₂20g、FeSO₄·7H₂O 65g、V_H0.3g以及H₂SO₄5ml。微量元素液可参考如下方法制作：按前述配方取各组分，用去离子水定容至1L，充分搅拌后，用0.22μm滤膜进行过滤除菌，于4℃保存。

2.2调节发酵罐参数，以控制发酵条件，进行发酵培养。

其中，本实施例的发酵条件具体为：控制发酵温度28℃，控制基础发酵培养液的pH为5.0，采用7mol/L氨水调节基础发酵培养液pH。

2.3添加补料。待发酵罐里的甘油消耗完，溶氧上升至50％左右时，往发酵罐中加入总体积为3600ml的补料，该3600ml的补料按流速12ml/min的流速加入至基础发酵培养液。加入补料后，基础发酵培养液中的溶氧下降，继续培养。

其中，本实施例所用的补料按每升计包括：甘油500g和微量元素液4ml。

2.4添加甲醇，诱导培养。当溶氧上升至80％时，饥饿培养30分钟，再往基础发酵培养液按中加入甲醇，进行诱导培养。具体地，以第一流速2ml/h添加甲醇；然后在基础发酵培养液的溶氧降至40％时，以第二流速6ml/h·L添加继续甲醇，并控制基础发酵培养液的溶氧为30％左右。诱导培养72h左右后，可结束整个发酵培养过程。含有重组人源III型胶原蛋白的得到发酵液。

2.5停止发酵后，采用现有提取工艺例如固液分离法、离子交换法等，可从发酵液中提纯出人胶原蛋白。

对比例1

本对比例提供的重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵方法的操作步骤如下。需要说明的是，本对比例中的重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵方法各参数值未设置在本发明的保护范围内。

1活化菌种

本对比例中的活化菌种的具体步骤与实施例1基本相同，以得到重组人源III型胶原蛋白工程菌种子液。

2发酵培养

2.1将得到的重组人源III型胶原蛋白工程菌种子液以1:4的体积比接种至含有40L基础发酵培养液的发酵罐(上海百伦、型号：BLBIO-100STA-UIP、总容量70L)。该发酵罐可显示溶氧、pH、温度、搅拌转速等参数，并带有蠕动泵可进行pH自动控制和自动补料。

其中，本对比例所用的基础发酵培养液按每升计包括：H₃PO₄ 20ml、CaSO₄ 0.7g、K₂SO₄ 20g、MgSO₄·7H₂O 11g、KOH 5g、甘油35g以及微量元素液3ml。

其中，本对比例所用的微量元素液按每升计包括：：CuSO₄·5H₂O 8g、NaI 0.1g、MnSO₄·H₂O 3.5g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.5g、H₃BO₃ 0.05g、CoCl₂0.2g、ZnCl₂16g、FeSO₄·7H₂O 60g、V_H0.4g以及H₂SO₄2ml。微量元素液可参考如下方法制作：按前述配方取各组分，用去离子水定容至1L，充分搅拌后，用0.22μm滤膜进行过滤除菌，于4℃保存。

2.2调节发酵罐参数，以控制发酵条件，进行发酵培养。

其中，本对比例的发酵条件具体为：控制发酵温度28℃，控制基础发酵培养液的pH为5.0，采用7mol/L氨水调节基础发酵培养液pH。

2.3添加补料。待发酵罐里的甘油消耗完，溶氧上升至70％左右时，往发酵罐中加入补料，加入补料后，基础发酵培养液中的溶氧下降，继续培养。

其中，本对比例所用的补料按每升计包括：甘油350g和微量元素液7ml。

2.4添加甲醇，诱导培养。当溶氧上升至70％时，饥饿培养30分钟，再往基础发酵培养液按中加入甲醇，进行诱导培养。具体地，以第一流速4ml/h添加甲醇；然后在基础发酵培养液的溶氧降至50％时，以第二流速7ml/h·L添加继续甲醇，并控制基础发酵培养液的溶氧为30％左右。诱导培养72h左右后，可结束整个发酵培养过程。含有重组人源III型胶原蛋白的得到发酵液。

2.5停止发酵后，采用现有提取工艺例如固液分离法、离子交换法等，可从发酵液中提纯出人胶原蛋白。

实验例1

按常规方法，取实施例1、实施例2、实施例3以及对比例1得到的发酵液上清，进行蛋白凝胶电泳实验，检测重组人源III型胶原蛋白的表达量，结果如图2所示。

由图2可知(图中：M为蛋白Maker，1、2、3、4分别为含0.25μg、0.5μg、1μg、2μg重组人源III型胶原蛋白的标准品，5、6、7、8分别是体积为对比例1、对比例3、对比例2、对比例1的发酵液上清，上样体积均为5μl，箭头所指处是分子量为130Kd的重组人源III型胶原蛋白)，在130Kd的位置，实施例1、2和3的条带颜色较深，对比例1的条带颜色相对于实施例1、2和3较浅，说明实施例1、2 和3得到的发酵液上清中的重组人源III型胶原蛋白含量比对比例1的含量高；在实施例1、2和3中进行相互比较，可知，实施例1在130Kd位置的条带颜色最深，说明实施例1的得到发酵液上清的重组人源III型胶原蛋白含量最高，这也表明实施例1的各项参数是最优化的设计，其具有预料不到的效果。

综上，采用本发明提供的重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵方法能够提高重组人源III型胶原蛋白的表达量，且提高效果明显，也同时说明，本发明提供的发酵培养基能够提高重组人源III型胶原蛋白工程菌的重组人源III型胶原蛋白表达量。

总之，本发明提供的重组人源III型胶原蛋白工程菌的发酵方法以及发酵培养基，通过对基础发酵培养液和补料的成分含量优化和发酵环境体系的优化，以及补料和诱导剂即甲醇的加入时机和流速等参数的优化等，大大地提高了重组人源III型胶原蛋白工程菌的蛋白表达量，该发酵方法和发酵培养基能够适用于工业化的大规模生产，有助于降低经济成本，提高生产效率。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。