本发明涉及基因工程
技术领域：
：，是一种长链非编码RNAENST00000589524.1及制剂或诊断剂或药物或试剂盒及检测其的方法及其应用，即ENST00000589524.1及制剂或诊断剂或药物或试剂盒和应用。
背景技术：
：：稳定型心绞痛(stableangina,SA)是由于劳力引起心肌缺血，导致胸部及附近部位的不适，可伴有心功能障碍，但没有心肌坏死。心绞痛是由于心肌需氧和供氧之间暂时失去平衡而发生心肌缺血的临床症状。它的产生是在一定条件下冠状动脉所供应的血液和氧不能满足心肌需要的结果。在我国，随着人民生活水平的提高，生活方式的改变以及生活节奏的加快，心绞痛的发病率逐年增高。以发病率居全国首位的北京为例，2003年心绞痛合并有并发症的病死率占人口死亡总数的13％，目前仍呈上升趋势。稳定型心绞痛的早期诊断对于预防心绞痛发展为临床心血管事件具有重要价值，可以提高心绞痛患者的生存率并能够改善长期预后。因此，寻找能够早期诊断SAP患者并有较高敏感性及特异性的新的生物标志物显得尤为必要。长链非编码RNA(longnon-codingRNAs，lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，一般不编码蛋白，由RNA聚合酶II转录并经可变剪切形成，转录水平低于蛋白质编码基因，曾一度被认为是基因组转录的“噪音”。已证实，长链非编码RNA在表观遗传学、转录调控、转录后调控等多种层面调控基因表达，在多种生物学进程中发挥重要作用，包括脂肪代谢、动脉粥样硬化形成、胚胎发育及肿瘤的发生等。技术实现要素：本发明提供了一种长链非编码RNAENST00000589524.1的制剂或诊断剂或药物或试剂盒，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决稳定型心绞痛的早期诊断对于预防心绞痛发展为临床心血管事件具有重要价值，可以提高心绞痛患者的生存率并能够改善长期预后，寻找能够早期诊断稳定型心绞痛患者并有较高敏感性及特异性的新的生物标志物显得尤为必要的问题，本发明发现其表达或功能异常与人类心血管疾病的发生和发展密切相关，长链非编码RNA有望成为心血管疾病诊断、预测预后的标志物，同时也为心血管病的治疗提供了新的靶点。本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种在稳定型心绞痛患者血液中高表达的长链非编码RNAENST00000589524.1，该长链非编码RNAENST00000589524.1的序列如SEQIDNO:1所示。下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：上述该长链非编码长链非编码RNAENST00000589524.1为ENST00000589524.1:1的全长或片段。本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种体外检测血液中长链非编码RNAENST00000589524.1的制剂或诊断剂或药物或试剂盒，该制剂或诊断剂或药物或试剂盒包括特异性引物对、标准DNA模板、PCR反应液，其中，特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列为SEQIDNo:2，下游引物的核苷酸序列为SEQIDNo:3。下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：上述该试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒。上述特异性引物对用于SYBRGreen、Taqman探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。上述PCR反应液为荧光定量PCR反应液。上述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶。上述还包括荧光染料。本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种检测根据技术方案之一所述的长链非编码RNAENST00000589524.1的方法，按下述步骤进行：第一步，提取血液总RNA；第二步，制备cDNA；第三步，定量扩增长链非编码RNAENST00000589524.1。本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种根据技术方案之一所述的长链非编码RNAENST00000589524.1在制备用于检测稳定型心绞痛的试剂盒或用作检测稳定型心绞痛药物的新靶点的应用。本发明利用长链非编码表达谱芯片技术，通过差异分析，筛选到一条在稳定型心绞痛患者血液中显著高表达的长链非编码RNAENST00000589524.1，进一步丰富稳定型心绞痛发病机制的研究，同时，本发明所述的体外检测稳定型心绞痛相关基因即长链非编码RNAENST00000589524.1的试剂以及本发明所述的体外检测稳定型心绞痛相关基因即长链非编码RNAENST00000589524.1的试剂盒能够用于本发明所述的长链非编码RNAENST00000589524.1的表达水平的检测，通过本发明所述的长链非编码RNAENST00000589524.1的表达水平的检测结果获知稳定型心绞痛的筛查结果，为稳定型心绞痛的诊断和治疗提供了新方向。附图说明附图1为本发明中长链非编码RNA表达谱芯片检测ENST00000589524.1在健康对照组与稳定型心绞痛组中的检测信号值。附图2为本发明中针对长链非编码RNAENST00000589524.1的序列设计的一对特异性引物PCR扩增后行琼脂糖凝胶电泳测试引物的效果。附图3为本发明中qRT-PCR检测RNAENST00000589524.1在健康对照组与稳定型心绞痛组中的相对表达量。具体实施方式本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。在本发明中，为了便于描述，各部件的相对位置关系的描述均是根据说明书附图1的布图方式来进行描述的，如：上、下、左、右等的位置关系是依据说明书附图的布图方向来确定的。本发明利用长链非编码表达谱芯片技术，通过差异分析，筛选到一条在稳定型心绞痛患者血液中显著高表达的长链非编码RNAENST00000589524.1，其转录区域位于19号染色体，起始位置为36,440,385至36,442,421，全长2037bp。与健康人的血液含量相比，长链非编码RNAENST00000589524.1在稳定型心绞痛患者血液中显著高表达，并在样本的荧光定量实验中进一步证实长链非编码RNAENST00000589524.1在稳定型心绞痛患者血液中显著高于健康人。这一新型的长链非编码RNAENST00000589524.1将进一步丰富稳定型心绞痛发病机制的研究，也为稳定型心绞痛的早期诊断及预后监测提供了新的血液分子标志物和治疗靶点。发明人提供的稳定型心绞痛患者和健康人的血液标本各5个，共10例。通过ABI公司的Trizol试剂(货号15596-026)所需步骤提取总RNA后，采用北京博奥生物工程有限公司的芯片产品(AgilenthumanlncRNA+mRNAArrayV4.0)进行检测，筛选出一条在稳定型心绞痛患者血液中显著高表达的长链非编码RNAENST00000589524.1，其核酸序列如SEQIDNo.1所示。后期经过对样本进行荧光定量PCR验证，发现10个样本中稳定型心绞痛患者显著高于健康人。长链非编码RNAENST00000589524.1作为稳定型心绞痛的新靶点，为稳定型心绞痛的临床治疗和药物开发提供理论基础。实施例1，一种在稳定型心绞痛患者血液中高表达的长链非编码RNAENST00000589524.1，该长链非编码RNAENST00000589524.1的序列如SEQIDNO:1所示。该长链非编码RNAENST00000589524.1可丰富稳定型心绞痛发病机制的研究，并可对其进行早期诊断。实施例2，作为实施例1的优化，该长链非编码长链非编码RNAENST00000589524.1为ENST00000589524.1:1的全长或片段。实施例3，一种体外检测血液中根据实施例1和实施例2所述的长链非编码RNAENST00000589524.1的制剂或诊断剂或药物或试剂盒，该制剂或诊断剂或药物或试剂盒包括特异性引物对、标准DNA模板、PCR反应液，其中，特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列为SEQIDNo:2，下游引物的核苷酸序列为SEQIDNo:3。该长链非编码RNAENST00000589524.1的制剂或诊断剂或药物或试剂盒能够更方便的对稳定型心绞痛的血清标志物进行诊断和预测。实施例4，作为实施例3的优化，该试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒。实施例5，作为实施例3或实施例4的优化，特异性引物对用于SYBRGreen、Taqman探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。实施例6，作为实施例3、实施例4和实施例5的优化，PCR反应液为荧光定量PCR反应液。实施例7，作为实施例6的优化，荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶。实施例8，作为实施例3、实施例4、实施例5、实施例6和实施例7的优化，该试剂盒还包括荧光染料。该体外检测稳定型心绞痛的染料类荧光定量PCR试剂盒的使用方法，荧光定量PCR体系：上游引物、下游引物各0.25ul(10uM)；DNA模板cDNA0.5ul；PowerSYBRGreenPCRMaster(2×)5ul，加Nuclease-FreeWater4ul，总容量10ul。荧光定量PCR程序：第一步95℃10分钟；第2步，95℃15S，60℃1分钟；第三步，95℃15S，60℃1分钟，95℃15S，共40个循环。实施例9，一种检测根据实施例1和实施例2所述的长链非编码RNAENST00000589524.1的方法，按下述步骤进行：第一步，提取血液总RNA；第二步，制备cDNA；第三步，定量扩增长链非编码RNAENST00000589524.1。所述方法具体包括如下步骤：一、提取血液总RNA：按照ABI公司的Trizol试剂(货号15596-026)所需试剂及步骤提取总RNA，再用7300realtimePCRsystem核酸定量仪定量(AppliedBiosystemsAB)定量所提取的的纯度和浓度。二、制备样品cDNA：采用北京天根生化科技公司FastQuantcDNA第一链合成试剂盒试剂盒(货号KR106)对提取的总RNA反转录合成cDNA。1、将模板RNA在冰上解冻；5×gDNABuffer、FQ-RTPrimerMix、10×FastRTBuffer、RNase-FreeddH2O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。2、打开二级结构，反应体系及条件如表1所示；将上述组分的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。3、反转录反应，反应体系及条件如表2所示；将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。42℃，孵育15min。95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。三、扩增长链非编码RNAENST00000589524.1：采用ABI公司的PowerSYBRGreenPCRMasterMix荧光定量试剂盒(货号4367659)，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR体系如表3所示；荧光定量PCR程序：第一步95℃10分钟；第2步，95℃15S，60℃1分钟；第三步，95℃15S，60℃1分钟，95℃15S，共40个循环。实施例10，一种根据实施例1和实施例2所述的长链非编码RNAENST00000589524.1在制备用于检测稳定型心绞痛的试剂盒或用作检测稳定型心绞痛药物的新靶点的应用。用于检测稳定型心绞痛的方法，所述方法包括以下步骤：第一步，提取血液总RNA；第二步，制备样品cDNA；第三步，扩增长链非编码RNAENST00000589524.1，并根据相对定量结果进行判断。实施例11：稳定型心绞痛患者与健康人血液的长链非编码RNA芯片表达分析。一、材料和方法1.材料血液样本来自于稳定型心绞痛患者与健康人血液样本各5个。2.方法(1)稳定型心绞痛患者与健康人血液样本总RNA的提取：按照博奥生物技术有限公司提供的“用于基因芯片分析的血液样品的准备步骤”提取稳定型心绞痛患者与健康人血液样本总RNA。具体实验材料包括：淋巴细胞分离液(天津TBD生物技术发展中心)；灭菌生理盐水(普通0.9％生理盐水灭菌即可)；Trizol试剂(Invitrogen公司)。(2)晶lncRNA+mRNA表达谱芯片检测以待检测样品的总RNA为起始，进行体外扩增和荧光标记，标记过程采用晶生物芯片通用标记试剂盒。主要包括如下步骤：1)反转录合成第一链cDNA：以TotalRNA起始，含有T7启动子序列的T7Oligo(dT)Primer和T7-随机引物，既可以结合带poly(A)的mRNA，也可以结合除rRNA以外其它不带poly(A)的RNA，使用第一链EnzymeMix合成第一链cDNA。2)合成第二链DNA：用第二链EnzymeMix将DNA-RNA杂合体中的RNA链转化为第二链cDNA，合成双链DNA。3)体外转录合成cRNA：以第二链cDNA为模板，利用T7EnzymeMix合成cRNA。4)cRNA纯化：使用RNA纯化柱纯化cRNA，除去反应中的盐、酶等试剂，并对cRNA进行定量、质控。5)反转录：以cRNA为模板，RandomPrimer为引物，CbcScriptⅡ酶进行反转录。纯化回收反转录得到的cDNA并定量。6)标记：以反转录的cDNA产物为模板，RandomPrimer为引物，用KlenowFragment酶合成cDNA互补链并掺入带有荧光基团的dNTP(Cy3-dCTP、Cy5-dCTP)，纯化并定量标记产物。带有荧光基团DNA即可用于芯片杂交。7)芯片杂交及清洗：取1μLcDNA溶于杂交液，45℃杂交过夜。取出芯片在博奥SlideWasher8芯片洗干仪进行清洗，清洗程序如下：洗液I：0.2％SDS，2×SSC,42℃120S清洗2遍。洗液II：0.2％SDS，2×SSC,42℃80S清洗3遍。清洗程序完成后，离心甩干，待扫描。8)芯片扫描，数据分析，差异基因筛选：使用Agilent芯片扫描仪(G2565CA)对清洗后的芯片进行扫描，得到杂交图片。使用AgilentFeatureExtraction(v10.7)软件对杂交图片进行分析并提取数据。然后使用AgilentGeneSpring软件对数据进行归一化和差异分析，并用GeneSpringGX软件进行差异基因筛选。二、结果长链非编码表达谱芯片检测ENST00000589524.1在健康对照组与稳定型心绞痛组中的检测信号值如附图1所示。芯片筛查发现多条表达上调和表达下调的lncRNAs。其中长链非编码RNAENST00000589524.1显示出在稳定型心绞痛患者中表达显著上调，Fc值为1.895倍，其中，由图上可知，P小于0.05，具有统计学意义。鉴于其可能在稳定型心绞痛患者中存在特异性表达，本发明通过以下实施例采用芯片检测的样本进行指标的重复验证。实施例12：qRT-PCR重复验证长链非编码RNAENST00000589524.1在稳定型心绞痛患者和健康人中的差异表达。一、实验材料选取芯片测试的样本，对长链非编码RNAENST00000589524.1的表达差异进行qRT-PCR验证。二、实验方法和结果1.引物特异性鉴定(1)特异性引物的设计：从Ensemble数据库提取长链非编码RNAENST00000589524.1相关的转录本序列，并用根据转录本的序列通过NCBI的引物设计工具(PrimerBLAST)设计引物；设计后的引物序列如下：上游引物：SEQIDNo:2下游引物：SEQIDNo:3(2)将稳定型心绞痛患者与健康人血液按照ABI公司的Trizol试剂(货号15596-026)所需试剂及步骤提取总RNA，再用7300realtimePCRsystem核酸定量仪定量(AppliedBiosystemsAB)定量所提取的的纯度和浓度。采用北京天根生化科技公司FastQuantcDNA第一链合成试剂盒试剂盒(货号KR106)对提取的总RNA反转录合成cDNA。第一步将模板RNA在冰上解冻；5×gDNABuffer、FQ-RTPrimerMix、10×FastRTBuffer、RNase-FreeddH2O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。第二步打开二级结构，反应体系及条件如表4所示，将上述组分的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。第三步反转录反应，反应体系及条件如表5所示：将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。42℃，孵育15min。95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。(3)扩增长链非编码RNAENST00000589524.1：采用ABI公司的PowerSYBRGreenPCRMasterMix荧光定量试剂盒(货号4367659)，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR体系如表6所示；荧光定量PCR程序：第一步95℃10分钟；第2步，95℃15S，60℃1分钟；第三步，95℃15S，60℃1分钟，95℃15S，共40个循环。电泳检测，选用0120000Marker(北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0632)结果如附图2所示：扩增片段大小与预期相同，扩增产物只有一个条带。该引物对符合上述标准。上游的特异性引物，其序列见序列表SEQIDNo.2，下游的特异性引物，其序列见序列表SEQIDNo.2。2.标准DNA模板的制备根据长链非编码RNAENST00000589524.1碱基序列(其核酸序列如序列表SEQIDNo.1所示)，委托上海生工合成。取样2ul合成产物，连接到Puc-TTA克隆载体(北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0801)，随后转化到DH5a感受态细胞中。通过序列为SEQIDNo.2和SEQIDNo.3的特异性引物筛选阳性克隆，提取质粒DNA，质粒DNA用7300realtimePCRsystem核酸定量仪定量，并做10倍系列稀释作为标准曲线(标准DNA模板浓度范围在102-106拷贝/ul)。3.敏感性实验将标准将标准DNA模板质粒按比例稀释为102、103、104、105、106拷贝/ul，进行荧光定量PCR检测灵敏度。最低检出浓度为102拷贝/ul。4.合成cRNA模板取上述稳定型心绞痛和健康人的总RNA各5个，采用北京天根生化科技公司FastQuantcDNA第一链合成试剂盒试剂盒(货号KR106)对提取的总RNA反转录合成cDNA。第一步将模板RNA在冰上解冻；5×gDNABuffer、FQ-RTPrimerMix、10×FastRTBuffer、RNase-FreeddH2O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。第二步打开二级结构，反应体系及条件如表7所示：将上述组分的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。第三步反转录反应，反应体系及条件如表8所示：将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。42℃，孵育15min。95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。5.荧光定量PCR检测长链非编码RNAENST00000589524.1采用ABI公司的PowerSYBRGreenPCRMasterMix荧光定量试剂盒(货号4367659)，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR体系如表9所示：荧光定量PCR程序：第一步95℃10分钟；第2步，95℃15S，60℃1分钟；第三步，95℃15S，60℃1分钟，95℃15S，共40个循环。qRT-PCR检测稳定型心绞痛患者中长链非编码RNAENST00000589524.1的相对表达量如附图3所示。根据qRT-PCR的相对定量公式：2-△△ct，分别计算出长链非编码RNAENST00000589524.1在稳定型心绞痛患者和健康人中的表达水平，结果所示稳定型心绞痛患者与健康人的长链非编码RNAENST00000589524.1表达水平比较，其2-△△ct平均值为3.09。以上结果说明，长链非编码RNAENST00000589524.1在稳定型心绞痛患者血液中普遍低表达，这与前面所述的长链非编码RNA芯片结果ENST00000589524.1上调1.895倍相一致，其中，由图中可知，P小于0.05，具有统计学意义。因此，长链非编码RNAENST00000589524.1可以作为稳定型心绞痛诊断的新的血液生物标志物，用于稳定型心绞痛的筛查。以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。表1试剂用量5×gDNABuffer2ul总RNA1-2ugDEPC水补足至10uL表2试剂用量10×FastRTBuffer2ulRTEnzymeMix1ulFQ-RTPrimerMix2ulRNase-FreeddH2O补足到10μl表3试剂用量PowerSYBRGreenPCRMaster(2×)5ulcDNA样品0.5ulForwardPrimer(10μM)0.25ulReversePrimer(10μM)0.25ulNuclease-FreeWater4ul总容量10ul表4试剂用量5×gDNABuffer2ul总RNA1-2ugDEPC水补足至10uL表5表6试剂用量PowerSYBRGreenPCRMaster(2×)5ulcDNA样品0.5ulForwardPrimer(10μM)0.25ulReversePrimer(10μM)0.25ulNuclease-FreeWater4ul总容量10ul表7试剂用量5×gDNABuffer2ul总RNA1-2ugDEPC水补足至10uL表8试剂用量10×FastRTBuffer2ulRTEnzymeMix1ulFQ-RTPrimerMix2ulRNase-FreeddH2O补足到10μl表9试剂用量PowerSYBRGreenPCRMaster(2×)5ulcDNA样品0.5ulForwardPrimer(10μM)0.25ulReversePrimer(10μM)0.25ulNuclease-FreeWater4ul总容量10ul序列表<110>新疆医科大学第一附属医院<120>ENST00000589524.1及制剂或诊断剂或药物或试剂盒和应用<130><160><170><210>1<211>2037<212>DNA<213>Homosapiens<400>11gggcaacagagctacaaccctgtctgaaaaacgaaagaaagagagagagaagaaagaaag61aaagaaagagagagagagagagagagaaagaatgaaagaaagaaagaaagaaagaaagag121agagagagagaaagaaagaaagaaagaaagaaagaaagaaagaaagaaagaaagaaagaa181agagagagaaagaaagaaagaaaagggggggagggacagagggagggaagaaaagaaagg241cgggccaggcaaggtggctcatgcctgtaatcccagcgctttgaaaggctgaggcaggca301gatcaagaggtcagcagtttgagaccagcctggcctacatggtgaaaccccatctctact361aaaaatacaattagccaggcgtggtggcgggtccctgtaatcccagctactagggaggct421gaggcaggagaattgcttgaacccgggaggcagaggttgcatcgagccgagattgagcca481tcacattccagcctgggcaacagagcaagactccgtctcaaaacaacaacaacaaaccct541cccaatttgctaagtaaaagggaatgagtcacaactatgatttatagaaaaaaagactgg601agcatctatctgattaacatacagttatat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