本发明涉及基因工程及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种ApoE基因引物组、检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
ApoE基因与多种心脑血管疾病密切相关，其编码的载脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）参与高血脂症、动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病的整个发生发展过程，ApoE基因多态性是这些疾病早期及发展过程中个体差异的主要原因。
根据ApoE表型提出ApoE基因模型，认为ApoE的合成是由位于一个基因位点上的三个等位基因所控制，即E2、E3和E4，每一个等位基因对应于一个主要异构体产生三种纯合子(E2/2，E3/3，E4/4)和三种杂合子(E2/3，E2/4，E3/4)共六种常见表型。ApoE3/3型又称野生型。ApoE是一个多态性蛋白，有三个常见的异构体，即E2、E3和E4。ApoE的氨基酸序列的112位（Cys112Arg，rs429358，以下简称358）和158位（Arg158Cys，rs7412，以下简称412）两种氨基酸残基即精氨酸（Arg）和半胱氨酸（Cys）的交换决定了异构体的种类。ApoE4在这两个位置上都是Arg；E2都是Cys；112位为Cys和158位是Arg者为ApoE3异构体。自然人群中，基因频率E3分布最高，ApoE3/3表型分布约70%。
另外国内外多项研究发现，ApoE基因是目前已知的阿尔茨海默病最密切的遗传标志物，ApoE4携带者阿尔茨海默病的易感性增加。ApoE突变后，其与LDL-R的亲和力发生改变。携带一个E4等位基因的个体其发展为AD的可能性高于无E4等位基因的个体约3-4倍。E4等位基因在普通人群中比例大约为15%，而在AD患者中的比例可达40%。ApoE4是AD的重要危险因素。通过检测ApoE的基因型，可了解是否为AD易感人群，继而从病因学延缓AD的发生、发展；并定期检查，以便早诊断、早治疗、最大程度的降低疾病造成的损害。
通过对患者的ApoE基因进行检测，得到特定位点的基因型，以基因检测结果作为中间结果的信息的方法，不属于疾病的诊断方法；以基因型的检测结果来确定药物的选择，就可以实现个体化用药，避免对免疫抑制剂不良反应。
目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法、基因芯片杂交法、Taqman荧光探针法、等位基因特异性扩增法（Amplification Refractory Mutation System Real Time PCR，ARMS-RT PCR）、等位基因特异性扩增法（Amplification Refractory Mutation System Real Time PCR，ARMS-RT PCR）等。上述方法灵敏度低、假阳性率高、耗时较长，通量小。
因此，需要一种新的检测ApoE基因基因突变的试剂盒及检测方法，使得对ApoE基因突变的灵敏度高，假阳性率低，且检测周期短。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种ApoE基因检测试剂盒及检测方法，旨在解决现有技术中ApoE基因检测灵敏度低、假阳性率高、周期长，通量小的技术问题。
本发明提供了一种ApoE基因检测引物组，一种ApoE基因检测引物组，包括rs429358引物组和rs7412引物组中的至少一种；
所述rs429358引物组用于扩增含rs429358位点的核酸片段，包括rs429358上游引物和rs429358下游引物，所述rs429358上游引物具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的序列，所述rs429358下游引物具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的序列；
所述rs7412引物组用于扩增含rs7412位点的核酸片段，包括rs7412上游引物和rs7412下游引物，所述rs7412上游引物具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或、SEQ ID NO:21的序列，所述rs7412下游引物具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:22的序列。
优选的，所述rs429358引物组包括ApoE引物组和rs429358内引物组；所述rs7412引物组包括ApoE引物组和rs7412内引物组；所述ApoE引物组用于扩增ApoE基因片段，所述rs429358内引物组用于扩增含rs429358位点的ApoE基因片段；所述rs7412内引物组用于扩增含rs7412位点的ApoE基因片段。
本发明还提供了一种ApoE基因检测试剂盒，所述ApoE基因检测试剂盒包括上述任一种ApoE基因检测引物组。
优选的，所述ApoE基因检测试剂盒还包括接头，所述接头上含有标签序列，所述接头用于直接与含rs429358位点和/或rs7412位点的扩增产物连接。
优选的，所述ApoE基因检测试剂盒还包括rs429358测序引物和/或rs7412测序引物，所述rs429358测序引物具有SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的序列；所述rs7412测序引物具有SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的序列。
优选的，所述ApoE基因检测试剂盒还包括无荧光标记的寡聚核苷酸探针。
本发明还提供了一种ApoE基因检测方法，包括以下步骤：
A、采用rs429358引物组，对含rs429358位点的核酸片段进行扩增，得rs429358扩增产物；或利用rs7412引物组，对含rs7412位点的核酸片段进行扩增，得rs7412扩增产物；
所述rs429358引物组用于扩增含rs429358位点的核酸片段，包括rs429358上游引物和rs429358下游引物，所述rs429358上游引物具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的序列，所述rs429358下游引物具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的序列；
所述rs7412引物组包括rs7412上游引物和rs7412下游引物，所述rs7412上游引物具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的序列，所述rs7412下游引物具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:22的序列；
B、在所述rs429358扩增产物和/或rs7412扩增产物上连接接头，得到rs429358文库分子和/或rs7412文库分子；
C、采用第二代高通量基因测序技术对所述文库分子进行测序，确定rs429358和/或rs7412位点的基因型。
优选的，所述步骤A包括以下步骤：
A1、采用ApoE引物组扩增ApoE基因片段，得第一扩增产物，所述ApoE引物组包括ApoE上游引物和ApoE下游引物，所述ApoE上游引物具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列，所述ApoE下游引物具有SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的序列；
A2、以第一扩增产物为模板，采用rs429358内引物组扩增含rs429358位点的ApoE基因片段，得第二rs429358扩增产物，所述rs429358内引物组包括rs429358内上游引物和rs429358内下游引物，所述rs429358内上游引物具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的序列，所述rs429358内下游引物具有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的序列；或所述rs429358内上游引物具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11，所述rs429358内下游引物具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的序列；采用rs7412内引物组扩增含rs7412位点的ApoE基因片段，得第二rs7412扩增产物，所述rs7412内引物组包括rs7412内上游引物和rs7412内下游引物，所述rs7412内上游引物具有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的序列，所述rs7412内下游引物具有SEQ ID NO:22的序列。
优选的，所述步骤B包括以下步骤：
B1、在所述第二rs429358扩增产物和/或第二rs7412扩增产物上连接接头，得到rs429358文库分子和/或rs7412文库分子；
B2、通过接头上的生物素标记，将所述rs429358文库分子和/或rs7412文库分子固定在含亲和素的磁珠上；将磁珠可寻址的固定在固相载体上。
优选的，步骤C中采用rs429358测序引物和/或rs7412测序引物对含待测位点的文库分子进行测序，所述rs429358测序引物具有SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的序列；所述rs7412测序引物具有SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的序列。
采用本发明提供的ApoE基因检测引物组扩增含待测位点的核酸片段，降低了扩增多个靶位点的可能性，提高了对含待测位点的核酸片段扩增的特异性和灵敏度，降低了假阳性率；同时，采用第二代高通量基因测序技术，使得对待测位点的检测周期短，通量高。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
本发明提出第一实施例，一种ApoE基因检测引物组，包括rs429358引物组和rs7412引物组中的至少一种；
所述rs429358引物组用于扩增含rs429358位点的核酸片段，包括rs429358上游引物和rs429358下游引物，所述rs429358上游引物具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的序列，所述rs429358下游引物具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的序列；
所述rs7412引物组用于扩增含rs7412位点的核酸片段，包括rs7412上游引物和rs7412下游引物，所述rs7412上游引物具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或、SEQ ID NO:21的序列，所述rs7412下游引物具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:22的序列。
本方案提供的ApoE基因检测引物组，能够特异性扩增含rs429358位点和/或rs7412的核酸片段，降低了扩增非目的片段的可能性，从而使得对rs429358位点和/或rs7412位点检测的灵敏度高，假阳性率低。
优选的，所述rs429358引物组包括ApoE引物组和rs429358内引物组；所述rs7412引物组包括ApoE引物组和rs7412内引物组；所述ApoE引物组用于扩增ApoE基因片段，所述rs429358内引物组用于扩增含rs429358位点的ApoE基因片段；所述rs7412内引物组用于扩增含rs7412位点的ApoE基因片段。
所述ApoE引物组包括ApoE上游引物和ApoE下游引物；所述ApoE上游引物具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列，所述ApoE下游引物具有SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的序列。
所述rs429358内引物组包括rs429358内上游引物和rs429358内下游引物；所述rs429358内上游引物具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的序列，所述rs429358内下游引物具有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的序列；或所述rs429358内上游引物具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的序列，所述rs429358内下游引物具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的序列。
所述rs7412内引物组包括rs7412内上游引物和rs7412内下游引物；所述rs7412内上游引物具有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的序列，所述rs7412内下游引物具有SEQ ID NO:22的序列。
采用本方案提供的两组ApoE基因检测引物组对待测位点进行两轮巢式扩增，由于同时与两组引物组都互补的序列很少，从而降低了非特异性扩增的可能性，增加了对待测位点检测的敏感度。本方案中，SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21上均包含ACCU序列，采用本方案的ApoE基因引物组对含待测位点的核酸片段进行扩增，得到的扩增产物上包含ACCU序列，采用特异性切割尿嘧啶的酶对扩增产物进行切割，会形成粘性末端，该粘性末端在后续连接接头的过程中连接效率更高。
本发明提出第二实施例，一种ApoE基因检测试剂盒，含有上述任一种ApoE基因检测引物组。
本发明的试剂盒，能够特异性扩增含rs429358位点和/或rs7412的核酸片段，降低了扩增非目的片段的可能性，从而使得对rs429358位点和/或rs7412位点检测的灵敏度高，假阳性率低。
采用两组ApoE基因检测引物组对待测位点进行两轮巢式扩增，由于同时与两组引物组都互补的序列很少，从而降低了非特异性扩增的可能性，增加了对待测位点检测的敏感度。
优选的，所述试剂盒还包括无荧光标记的寡核苷酸探针。
需要说明的是，所述无荧光标记的寡核苷酸探针与连接测序技术中所使用的荧光探针相比，序列完全相同，区别仅在于无荧光标记。本方案的试剂盒，在测序过程中加入无荧光标记的寡核苷酸探针，能够有效减少连接测序中出现的错误信号，提高了对待测位点检测的准确性。
优选的，所述试剂盒还包括特异性切割尿嘧啶的酶，所述特异性切割尿嘧啶的酶为USER酶、RNase H或UDG酶。
由于第二轮扩增的SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21序列上均包含ACCU序列，因此得到的扩增产物上也包含ACCU序列，采用特异性切割尿嘧啶的酶对扩增产物进行切割，形成粘性末端，该粘性末端在后续连接接头的过程中连接效率更高。
优选的，所述试剂盒还包括接头，所述接头上含有标签序列，所述接头用于直接与所述含rs429358位点和/或rs7412位点的扩增产物连接。
需要说明的是，本发明提供的试剂盒，对不同待测位点的扩增步骤是分开进行的，对多个含不同待测位点的扩增产物可以混合在一起同时进行测序。当采用本发明的试剂盒在同一体系中对同一样本的rs429358位点和rs7412位点同时进行检测时，与含rs429358位点的扩增产物连接的接头和与含rs7412位点的扩增产物连接的接头，其上的标签序列可以相同，也可以不同。当接头上的标签序列不同时，可以通过对接头标签序列的检测来区分待测位点的基因型，当接头上的标签序列相同时，可以通过所使用的测序引物的不同来区分待测位点的基因型。
当采用本发明的试剂盒对在同一体系中同时对不同样本的同一待测位点进行检测时，由于在测序过程中使用的测序引物是相同的，因此需要采用含不同标签序列的接头分别连接不同的样本，通过对标签序列进行测序，无需对样本进行多次测序即可有效区分不同样本的测序结果。
本发明的接头可以采用多种形式，包括但不限于平末端接头、突出末端接头、分叉接头或者含茎环结构的接头。
优选的，所述接头为突出末端接头，所述突出末端与所述扩增产物经特异性切割尿嘧啶的酶切割后形成的粘性末端完全互补配对，本方案使得扩增产物与接头之间的连接效率更高。
优选的，所述接头上含有生物素标记，用于使其固定在含亲和素的磁珠上。
更优选的，所述接头包括接头A、接头B、接头C中的至少一种，所述接头A为由SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24组成的双链核酸分子；所述接头B为由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成的双链核酸分子；所述接头C为由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28组成的双链核酸分子；所述接头中的NNNN为标签序列，所述N为A、G、C或T。
优选的，所述试剂盒还包括rs429358测序引物和/或rs7412测序引物，所述rs429358测序引物具有SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的序列；所述rs7412测序引物具有SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的序列。
更优选的，所述测序引物上用于连接探针的一端距待测位点为1至9bp，更优选在1至5bp。本方案使得在测序过程中，只需要进行一次连接测序即可确定待测位点的基因型。
优选的，所述试剂盒还包括连接酶。在连接酶的作用下，所述扩增产物和接头之间能够稳定的连接。
优选的，所述试剂盒还包括连接缓冲液。
本发明提出第三实施例，一种ApoE基因检测方法，包括以下步骤：
A、采用rs429358引物组，对含rs429358位点的核酸片段进行扩增，得rs429358扩增产物；或利用rs7412引物组，对含rs7412位点的核酸片段进行扩增，得rs7412扩增产物；
所述rs429358引物组用于扩增含rs429358位点的核酸片段，包括rs429358上游引物和rs429358下游引物，所述rs429358上游引物具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的序列，所述rs429358下游引物具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的序列；
所述rs7412引物组包括rs7412上游引物和rs7412下游引物，所述rs7412上游引物具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的序列，所述rs7412下游引物具有SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:22的序列；
B、在所述rs429358扩增产物和/或rs7412扩增产物上连接接头，得到rs429358文库分子和/或rs7412文库分子；
C、采用第二代高通量基因测序技术对所述文库分子进行测序，确定rs429358和/或rs7412位点的基因型。
优选的，所述步骤A包括以下步骤：
A1、采用ApoE引物组扩增ApoE基因片段，得第一扩增产物，所述ApoE引物组包括ApoE上游引物和ApoE下游引物，所述ApoE上游引物具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列，所述ApoE下游引物具有SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的序列；
A2、以第一扩增产物为模板，采用rs429358内引物组扩增含rs429358位点的ApoE基因片段，得第二rs429358扩增产物，所述rs429358内引物组包括rs429358内上游引物和rs429358内下游引物，所述rs429358内上游引物具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的序列，所述rs429358内下游引物具有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的序列；或所述rs429358内上游引物具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11，所述rs429358内下游引物具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的序列；采用rs7412内引物组扩增含rs7412位点的ApoE基因片段，得第二rs7412扩增产物，所述rs7412内引物组包括rs7412内上游引物和rs7412内下游引物，所述rs7412内上游引物具有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的序列，所述rs7412内下游引物具有SEQ ID NO:22的序列。
本方案通过设计两对扩增引物组，对含待测位点的核酸片段进行两轮特异性扩增，能够有效确保第二扩增产物中没有因引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染，降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了扩增的特异性和灵敏度。
优选的，所述步骤B中还包括向第二rs429358扩增产物和/或第二rs7412扩增产物中加入特异性切割尿嘧啶的酶进行切割的步骤，所述扩增产物经特异性切割尿嘧啶的酶切割产生粘性末端。由于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20以及SEQ ID NO:21上均包含ACCU序列，通过扩增得到第二rs429358扩增产物和/或第二rs7412扩增产物后，特异性切割尿嘧啶的酶切割第二rs429358扩增产物和/或第二rs7412扩增产物G和U之间的磷酸二酯键，形成5’末端含有磷酸基团的粘性末端，该粘性末端有利于在后续反应过程中连接接头。
优选的，所述特异性切割尿嘧啶的酶为USER酶、RNase H或UDG酶。
优选的，所述步骤B包括以下步骤：
B1、在所述第二rs429358扩增产物和/或第二rs7412扩增产物上连接接头，得到rs429358文库分子和/或rs7412文库分子；
B2、通过接头上的生物素标记，将所述rs429358文库分子和/或rs7412文库分子固定在含亲和素的磁珠上；将磁珠可寻址的固定在固相载体上。
优选的，所述接头上含有标签序列，所述接头用于直接与所述含rs429358位点和/或rs7412位点的扩增产物连接。
需要说明的是，本方案提供的检测方法，对不同待测位点的扩增步骤是分开进行的，对多个含不同待测位点的扩增产物可以混合在一起同时进行测序。当在同一体系中对同一样本的rs429358位点和rs7412位点同时进行检测时，与含rs429358位点的扩增产物连接的接头和与含rs7412位点的扩增产物连接的接头，其上的标签序列可以相同，也可以不同。当接头上的标签序列不同时，可以通过对接头标签序列的检测来区分待测位点的基因型，当接头上的标签序列相同时，可以通过所使用的测序引物的不同来区分待测位点的基因型。
当在同一体系中同时对不同样本的同一待测位点进行检测时，由于在测序过程中使用的测序引物是相同的，因此需要采用含不同标签序列的接头分别连接不同的样本，通过对标签序列进行测序，无需对样本进行多次测序即可有效区分不同样本的测序结果。
本发明的接头可以采用多种形式，包括但不限于平末端接头、突出末端接头、分叉接头或者含茎环结构的接头。
优选的，所述接头为突出末端接头，所述突出末端与所述扩增产物经特异性切割尿嘧啶的酶切割后形成的粘性末端完全互补配对，本方案使得扩增产物与接头之间的连接效率更高。
更优选的，所述接头包括接头A、接头B、接头C中的至少一种，所述接头A为由SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24组成的双链核酸分子；所述接头B为由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成的双链核酸分子；所述接头C为由SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28组成的双链核酸分子；所述接头中的NNNN为标签序列，所述N为A、G、C或T。
优选的，所述步骤C包括以下步骤：
C1、利用无荧光标记的寡核苷酸探针，对rs429358文库分子和/或rs7412文库分子进行一次连接测序；
C2、利用荧光探针对rs429358文库分子和/或rs7412文库分子进行连接测序，确定rs429358和/或rs7412位点的基因型。
需要说明的是，所述无荧光标记的寡核苷酸探针与连接测序技术中所使用的荧光探针相比，序列完全相同，区别仅在于无荧光标记。本方案的检测方法，在测序过程中加入无荧光标记的寡核苷酸探针，能够有效减少连接测序中出现的错误信号，提高了对待测位点检测的准确性。
每一次连接测序均包括以下步骤：测序引物锚定，冲洗（除去多余的未锚定的测序引物），连接探针，冲洗（除去多余探针，连接酶等），采图（获得探针上荧光标记所对应位置的序列信息），变性洗脱连接产物（以便下一次连接测序反应中测序引物的锚定）。步骤C1中的连接测序反应，因为使用的是无荧光标记的寡核苷酸探针，因此可以不进行采图步骤，以减少实验步骤，提高实验效率。
本发明提供了第四实施例，一种ApoE基因检测方法，以两个人的血液基因组DNA为模板，分别检测各模板ApoE基因片段上的rs429358位点和rs7412位点。按以下步骤建立反应体系：
A1、针对上述两个样本，各配制两个扩增ApoE基因片段共4个反应体系：50ng的血液基因组DNA；5U/μLde Ex Taq 0.25μL；2×long Taq Mix（深圳华因康基因科技有限公司生产）10μL；10μM的ApoE上游引物2μL；10μM的ApoE下游引物2μL；2.5mM的dNTP各4μL；加去离子水至50μL；混匀并离心。然后将离心管置于PCR仪中，设置反应程序：94℃条件下持续3分钟；94℃条件下持续15秒，57℃条件下持续20秒，72℃条件下持续45秒，一共20个循环；72℃条件下持续3分钟；扩增反应完成后，得到第一扩增产物。其中，ApoE上游引物组为SEQ ID NO:1，ApoE下游引物为SEQ ID NO:12；
A2、以上述两个样本的第一扩增产物为模板，各配置一个扩增含rs429358位点和rs7412位点的ApoE基因片段的反应体系，扩增样本一rs429358位点的体系为扩增体系1，扩增样本一rs7412位点的体系为扩增体系2，扩增样本二rs429358位点的体系为扩增体系3，扩增样本二rs7412位点的体系为扩增体系4，反应体系组分如下：100ng第一扩增产物；10μM的内引物组共4μL；2.5mM的dNTP各4μL；5U/μLde Ex Taq 0.25μL；2×long Taq Mix（深圳华因康基因科技有限公司生产）10μL；加去离子水至50μL；混匀并离心。将离心管置于PCR仪中，设置反应程序：94℃条件下持续3分钟；94℃条件下持续15秒，57℃条件下持续20秒，72℃条件下持续45秒，一共30个循环；72℃条件下持续3分钟；PCR反应完成后，得第二扩增产物。其中，用于扩增体系1和体系3的内引物组为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:14；用于扩增体系2和体系4的内引物组为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22；
第二次扩增完成后，经Page胶电泳检测，两个样本的第二扩增产物中均含有目标分子，且电泳图显示无杂带，条带单一；说明第二次扩增成功获得了所需的扩增产物。
B1、针对扩增体系1-4中获得的第二扩增产物，分别配制切割-连接反应体系1-4：第二扩增产物20μL，T4连接酶缓冲液8μL，T4 DNA连接酶 2μL，1U/μL的USER酶 10μL，10μM的接头 2μL；加去离子水至40μL；25℃反应20分钟，得连接产物，即待测序文库分子；
B2、将文库分子分别与带有亲和素修饰的磁珠结合，使得文库分子被固定在磁珠表面。将上述产物点样至异硫氰基修饰的载样片（玻片），于37℃固定1h，即完成固定在磁珠上的待测序文库分子的可寻址固定；
其中缓冲液为含400mM Tris、100mM MgCl2、100mM DTT、5mM ATP，pH值7.8的溶液；
接头由SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30组成。切割-连接反应体系1中使用的接头的标签序列为AGTC；切割-连接反应体系2中使用的接头的标签序列为ACAC；切割-连接反应体系3中使用的接头的标签序列为CAGT；切割-连接反应体系4中使用的接头的标签序列为GCCG。
C、在本具体实施例中采用深圳华因康基因科技有限公司的高通量基因测序仪Pstar II A测序仪，并采用连接测序法进行测序。测序过程中，针对rs429358位点，所使用的测序引物为SEQ ID NO:29；针对rs7412位点，所使用的测序引物为SEQ ID NO:36。测序结果表明，样本一的rs429358位点的基因型为野生型纯合子TT，样本一的rs7412位点的基因型为突变型纯合子TT，样本二的rs429358位点的基因型为突变型杂合子TC；样本二的基因型为野生型纯合子CC。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州康昕瑞基因健康科技有限公司
<120> ApoE基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法
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<170> PatentIn version 3.3
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