一种用于诊断FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR检测试剂盒的制作方法

本发明属于动物医学动物疫病分子生物学诊断技术领域，主要涉及一种用于诊断FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR检测试剂盒，主要用于鉴别Ⅰ群禽腺病毒、马立克氏病病毒、鸡淋巴细胞白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒4重聚合酶链式反应。

背景技术：

自2015年下半年以来，在我国部分省份如河南、安徽、辽宁、河北、北京、山东、山西、江苏、广东等地鸡场中出现了一种新发疾病，该病以心包积液和肝脏肿大为特征，被称为“心包积液-肝炎综合征”，目前认为其病原为Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)。FAdV粒子直径为70-90nm，无囊膜，呈正二十面体对称结构，核酸为双股DNA。Ⅰ群禽腺病毒分为A、B、C、D、E共5个禽腺病毒种，每个种内的病毒主要根据交叉中和试验结果进一步分为不同的血清型。本病既能水平传播，又能垂直传播，种鸡群感染会造成商品鸡群质量严重下降，死淘率上升，经济损失巨大。

马立克病(Marek′s disease,MD)是由马立克病病毒(Marek′s disease virus,MDV)引起鸡的一种高度接触传染性淋巴组织增生性肿瘤性疾病，以内脏器官、外周神经、性腺、虹膜、肌肉和皮肤单独或多发的淋巴样细胞浸润为特征。MD存在于世界上所有的养禽国家和地区，对养禽业造成严重的经济损失，在使用疫苗免疫以前，产蛋鸡死亡率可高达60％，而肉鸡的的淘汰率高达10％。马立克病在养禽业中仍需得到高度的重视，主要源于疾病爆发的不可预测性、疫苗免疫的失败以及马立克病毒毒力的不断增强，以此，世界各国均把马立克病视为养禽业重要的传染病之一。近年来，世界各地相继报道马立克病毒出现新变异，毒力进一步增强，出现特超强毒株，给本病的预防和控制带来了新的问题。

鸡白血病(Avian Leukosis)是由禽白血病肉瘤病毒群中的病毒引起的鸡多种肿瘤性疾病的统称。以在成年鸡中产生淋巴样肿瘤和产蛋量下降为特征。临诊上有多种表现形式，主要是淋巴细胞白血病。禽白血病病毒(ALV)属反转录病毒科，C型肿瘤病毒属禽白血病/肉瘤病毒群。并分为A、B、C、D和E5个亚群。A亚群是最常见的，并且与淋巴白血病最密切相关。自1868年首次报道淋巴白血病以来，一直被认为是严重危害养禽业的最重要的禽病之一。该病几乎波及所有商品鸡群。尽管该病呈渐进性发生和持续的低死亡率，但由于它以垂直传播为主，使该病难以控制，使鸡群在增重和产蛋方面受严重影响。尤其是患鸡抵抗力下降，容易感染多种疾病，给鸡群的饲养管理带来极大困难。鸡白血病是一种世界性分布的疾病，我国也普遍存在，给我国养鸡业造成的损失是巨大的。因此，控制和消灭鸡白血病是我国当前非常重要和十分迫切的问题。

禽网状内皮组织增生症(Reticuloendotheliosis,RE)是由网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)引起鸡、鸭、鹅、火鸡及其他禽类，以急性网状细胞肿瘤形成、矮小综合征、淋巴组织和其他组织的慢性肿瘤形成为特征的一群病理综合征。REV感染不仅能引起肿瘤，还可引起感染鸡胸腺、法氏囊等免疫器官萎缩，使鸡的免疫功能下降、甚至丧失，导致免疫抑制，使感染鸡极易继发感染其他病毒病和细菌病。在我国，REV感染及在鸡群中造成的危害已相当普遍并且愈发严重。

目前，对以上4种传染病的检测诊断手段主要有病毒分离鉴定，血清学技术如琼脂扩散试验、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、间接免疫荧光，聚合酶链反应(PCR)技术等，其中以PCR技术最为灵敏和快速。现在对Ⅰ群禽腺病毒、马立克氏病病毒、鸡淋巴细胞白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒均有建立相应PCR检测方法的报道，翟新验等利用双重PCR技术对REV和MDV感染细胞以及临床样品进行检测，认为所建立的方法是常规血清学、病理组织学方法所不能比拟的，可用于REV和MDV鉴别诊断。何秀苗等研制出了三重PCR方法，用以区别鉴定MDV、ALV和REV，方便和简化了肿瘤病料的实验室检测。

但目前为止，通过一次PCR检测就能直接诊断Ⅰ群禽腺病毒、马立克氏病病毒、鸡淋巴细胞白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒感染的技术仍未见报道。针对以上4种病毒性传染病在临床上均引起肝脾肿大的病理特征，能引起严重的免疫抑制，有一定的相似性，因此发明一种一次检测就能诊断清楚这一类疾病的诊断试剂盒，显得十分必要。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于诊断FAdV/MDV/ALV/REV 4重PCR检测试剂盒，主要用于鉴别Ⅰ群禽腺病毒、马立克氏病病毒、鸡淋巴细胞白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒4重聚合酶链式反应，可一次检测就能诊断出是否为Ⅰ群禽腺病毒、马立克氏病病毒、鸡淋巴细胞白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒感染。该试剂盒具有操作简便、结果直观、灵敏度高、特异性好、大幅缩短检测时间，能直接用于临床样品检测的特点。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

一种用于诊断FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR检测试剂盒，用于鉴别Ⅰ群禽腺病毒、马立克氏病病毒、鸡淋巴细胞白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒4重聚合酶链式反应，其特征在于，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照物和阳性对照物。

所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液的原料成分包含灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1FADV-F上游引物、25μmol·L^-1FADV-R下游引物、25μmol·L^-1MDV-F上游引物、25μmol·L^-1MDV-R下游引物、25μmol·L^-1ALV-F上游引物、25μmol·L^-1ALV-R下游引物、25μmol·L^-1REV-F上游引物、25μmol·L^-1REV-R下游引物、5U/μL rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照物为灭菌三蒸水；所述阳性对照物为Ⅰ群禽腺病毒、马立克氏病病毒、鸡淋巴细胞白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒的阳性质粒混合物。

所述FADV-F上游引物的序列为：5’-ATGACTGCGCTTACTCCCGA-3’；

所述FADV-R下游引物的序列为：5’-ACCCAGATAGTTGGTACC-3’；

所述MDV-F上游引物的序列为：5’-CAGCTGCGTATTTTCCCCG-3’；

所述MDV-R下游引物的序列为：5’-AATTACTTGGTCTTTAACC-3’；

所述ALV-F上游引物的序列为：5’-TGTAGTGTTATGCAATACTC-3’；

所述ALV-R下游引物的序列为：5’-GGGTATGTTGGCTCCCTGCA-3’；

所述REV-F上游引物的序列为：5’-AATGTGGGAGGGAGCTCCGG-3’；

所述REV-R下游引物的序列为：5’-ACATTTTCCCTCATTGGA-3’。

优选地，所述扩增反应混合液中的各原料成分的体积比为14.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5。

上述用于鉴别4重聚合酶链式反应诊断试剂盒对Ⅰ群禽腺病毒、马立克氏病病毒、鸡淋巴细胞白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒4重聚合酶链式反应的检测方法，包括以下步骤：

1)吸取100μL疑似病例样品置入1.5mL无菌EP管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL的-20℃的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用体积分数为75％的乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，再用40μL的8mmol·L^-1NaOH溶液溶解，得到疑似病例样品的DNA溶液，备用；

2)吸取100μL阴性对照物置入1.5mL无菌EP管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL的-20℃的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用体积分数为75％的乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，再用40μL的8mmol·L^-1NaOH溶液溶解，得到阴性对照样品溶液，备用；

3)取扩增反应混合液23μL，加入疑似病例样品的DNA溶液2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为：依次在95℃条件下预变性5min、94℃条件下预变性50s、55℃条件下预变性60s、72℃条件下预变性60s，依次进行35个循环，最后在72℃条件下延伸10min，得到疑似病例样品扩增反应产物，备用；

4)取扩增反应混合液23μL，加入阴性对照样品溶液2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为：依次在95℃条件下预变性5min、94℃条件下预变性50s、55℃条件下预变性60s、72℃条件下预变性60s，依次进行35个循环，最后在72℃条件下延伸10min，得到阴性对照样品扩增反应产物，备用；

5)取扩增反应混合液23μL，加入阳性对照物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为：依次在95℃条件下预变性5min、94℃条件下预变性50s、55℃条件下预变性60s、72℃条件下预变性60s，依次进行35个循环，最后在72℃条件下延伸10min，得到阳性对照物扩增反应产物，备用；

6)分别将疑似病例样品扩增反应产物、阴性对照样品扩增反应产物和阳性对照物扩增反应产物在10g·L^-1琼脂糖凝胶中电泳。

电泳结果为阴性对照不出条带，阳性对照出1085bp、750bp、508bp、312bp共4个条带，说明所述4重聚合酶链式反应诊断试剂盒有效；如果样品中出现1085bp一个条带，即为单一马立克氏病病毒感染；样品出现750bp一个条带，即为单一Ⅰ群禽腺病毒感染；样品出现508bp一个条带，即为单一禽网状内皮组织增生症病毒感染；样品出现312bp一个条带，即为单一鸡淋巴细胞白血病病毒感染。如果出现2条、3条或4条特异性条带，即为相应病毒的2重、3重或4重混合感染。

本发明的用于鉴别诊断FAdV/MDV/ALV/REV 4重聚合酶链式反应诊断试剂盒的验证性试验，包括特异性试验、灵敏度试验、稳定性试验以及田间试验，具体试验如下：

①特异性试验

使用本发明的用于诊断FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR检测试剂盒，按照以上说明，提取Ⅰ群禽腺病毒、马立克氏病病毒、鸡淋巴细胞白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒等DNA病毒的DNA作为模板，同时将这4种病毒混合作为1个样品提取DNA作为模板，用扩增混合液进行多重PCR，扩增完毕后电泳观察。按照RNAiso Reagent试剂说明提取新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、H9禽流感病毒、传染性法氏囊炎病毒总RNA，反转录获得第一链cDNA，用本发明的用于鉴别4重聚合酶链式反应诊断试剂盒的扩增混合液进行多重PCR，扩增完毕后电泳观察。

结果显示：马立克氏病病毒出现1085bp一个条带，Ⅰ群禽腺病毒出现750bp一个条带，禽网状内皮组织增生症病毒出现508bp一个条带，鸡淋巴细胞白血病病毒出现312bp一个条带，以上4种病毒混合样品出现1085bp、750bp、508bp、312bp共4个条带，新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、H9禽流感病毒、传染性法氏囊炎病毒均没有出现条带(见图1)。回收各阳性样本的条带，纯化后连接pMD18-T载体，转化DH5ɑ感受态细胞，取PCR鉴定为阳性得菌液，提取质粒进行测序，将测得的序列与所用毒株基因序列进行比较，发现序列完全一致。

结果证实本发明的一种用于诊断FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR检测试剂盒及检测方法具有很高的特异性，能准确扩增Ⅰ群禽腺病毒、马立克氏病病毒、鸡淋巴细胞白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒基因片段，并能直观区分这4种病毒的感染情况。

②灵敏度试验

使用本发明提供的用于诊断FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR检测试剂盒，提取Ⅰ群禽腺病毒、马立克氏病病毒、鸡淋巴细胞白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒DNA，紫外分光光度计测定浓度后稀释调整各病毒DNA浓度为200pg·L^-1，混合4种病毒DNA作为模板，按照10倍浓度梯度稀释至10^-9，用本发明的用于鉴别4重聚合酶链式反应诊断试剂盒提供的扩增混合液进行多重PCR，扩增完毕后电泳观察。结果显示，本发明的用于鉴别4重聚合酶链式反应诊断试剂盒能检测的极限为2.0×10^-5pg·L^-1，提示本方法灵敏度高(见图2)。

③稳定性试验

本发明提供的用于诊断FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR检测试剂盒保存条件为-20℃，每月1次用Ⅰ群禽腺病毒、马立克氏病病毒、鸡淋巴细胞白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒及对照进行检测试验，连续检测6个月，检测试剂盒存放的稳定性。

结果显示，6个月内试剂盒检测结果完全一致，说明本发明提供的用于鉴别4重聚合酶链式反应诊断试剂盒有良好的稳定性。

④田间试验

采集了陕西省鸡场临床肝脾肿大的组织病料和血清共50份，用本发明的用于诊断FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR检测试剂盒及检测方法进行诊断，发现临床存在多种感染现象，有单一的Ⅰ群禽腺病毒感染，有马立克氏病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒双重混合感染，有Ⅰ群禽腺病毒与禽网状内皮组织增生症病毒双重混合感染，有马立克氏病病毒、鸡淋巴细胞白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒3重混合感染现象(见图3)。

田间试验证明本发明提供的用于诊断FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR检测试剂盒的实用性和适用性良好。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用多重PCR扩增，4种病变相似且同为DNA病毒的病毒病一次检测，检测总时间控制在3小时左右，达到了易于操作、方便快捷、快速检测的目的。本发明能彻底解决这4种病变相似且同为DNA病毒的病毒病诊断问题，快速、灵敏，特异性好，能在3小时诊断清楚4种病毒病，非常适合大面积快速检测普查，适用于各实验室、动物疫病预防控制中心以及条件具备的大中型养殖场。

附图说明

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

图1为本发明的用于诊断FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR检测试剂盒及检测方法的特异性试验电泳图；

图中M为DL2000 DNA分子质量标准，1为马立克氏病病毒，2为Ⅰ群禽腺病毒，3为禽网状内皮组织增生症病毒，4为鸡淋巴细胞白血病病毒，5为以上4种病毒混合液，6为新城疫病毒，7为传染性支气管炎病毒，8为H9禽流感病毒，9为传染性法氏囊炎病毒；

图2为本发明的用于诊断FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR检测试剂盒及检测方法的灵敏度试验电泳图；

图中M为DL2000 DNA分子质量标准，1～9为马立克氏病病毒、Ⅰ群禽腺病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和鸡淋巴细胞白血病病毒DNA梯度稀释，浓度范围为200×10^-1pg·L^-1～200×10^-9pg·L^-1；

图3为本发明的用于诊断FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR检测试剂盒对部分临床样品的检测结果图；

图中M为DL2000 DNA分子质量标准，1-16为部分组织病料检测结果。其中1为马立克氏病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒双阳性结果；2、7、8、13分别为马立克氏病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和鸡淋巴细胞白血病病毒三阳性结果；5为Ⅰ群禽腺病毒阳性结果；10为禽网状内皮组织增生症病毒和鸡淋巴细胞白血病病毒双阳性结果；3、4、6、9、11、12、14、15、16为阴性结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

实施例1

(1)引物的设计与制备

参考GenBank上公布的Ⅰ群禽腺病毒、马立克氏病病毒、鸡淋巴细胞白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒基因组序列，结合本课题组数年研究测定的相关病毒基因序列，用DNAStar生物软件综合分析比对，针对以上4种病毒基因设计了8条引物，引物的序列如下：

FADV-F上游引物：5’-ATGACTGCGCTTACTCCCGA-3’；

FADV-R下游引物：5’-ACCCAGATAGTTGGTACC-3’；

MDV-F上游引物：5’-CAGCTGCGTATTTTCCCCG-3’；

MDV-R下游引物：5’-AATTACTTGGTCTTTAACC-3’；

ALV-F上游引物：5’-TGTAGTGTTATGCAATACTC-3’；

ALV-R下游引物：5’-GGGTATGTTGGCTCCCTGCA-3’；

REV-F上游引物：5’-AATGTGGGAGGGAGCTCCGG-3’；

REV-R下游引物：5’-ACATTTTCCCTCATTGGA-3’。

(2)阴性对照物和阳性对照物的制备

阴性对照物为灭菌三蒸水，阳性对照物为Ⅰ群禽腺病毒、马立克氏病病毒、鸡淋巴细胞白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒的阳性质粒混合物。

(3)用于诊断FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR检测试剂盒的制备

本实施例的用于鉴别4重聚合酶链式反应诊断试剂盒由以下组分组成：

1)裂解液：成分为DNAiso Reagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；

2)扩增反应混合液：由灭菌三蒸水、10倍稀释的(10×)PCR Buffer、2.5mmol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1FADV-F上游引物、25μmol·L^-1FADV-R下游引物、25μmol·L^-1MDV-F上游引物、25μmol·L^-1MDV-R下游引物、25μmol·L^-1ALV-F上游引物、25μmol·L^-1ALV-R下游引物、25μmol·L^-1REV-F上游引物、25μmol·L^-1REV-R下游引物、5U/μL rTaq DNA聚合酶组成，每个反应的体积比为14.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；

3)阴性对照物为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；阳性对照物为Ⅰ群禽腺病毒、马立克氏病病毒、鸡淋巴细胞白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒阳性质粒混合物，20个反应共计40.0μL，装成1管；

本发明试剂盒裂解液保存条件为常温，扩增反应混合液、阴性对照物和阳性对照物的保存条件为-20℃。

实施例2

(1)引物的设计与制备

同实施例1。

(2)组织病料样品的处理与DNA溶液的提取

1)取疑似病例组织病料如肿大的肝脏、脾脏3～5g，剪碎成糊状，加5倍无菌PBS，用组织研磨器充分研磨，收集悬液，4℃、12 000r/min离心10min，吸取上清液，备用。

2)吸取100μL疑似病例组织病料的上清液置入1.5mL无菌EP管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液，用体积分数为75％的乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管空气中自然干燥，用40μL的8mmol·L^-1NaOH溶液溶解，得疑似病例组织病料的DNA溶液，备用。

3)同时进行阴性对照样品溶液的处理：吸取100μL阴性对照物灭菌三蒸水置入1.5mL无菌EP管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL的-20℃的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用体积分数为75％的乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，再用40μL的8mmol·L^-1NaOH溶液溶解，得到阴性对照样品溶液，备用。

(3)用本发明的用于诊断FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR检测试剂盒检测MDV、FAdV、REV和ALV

4)取扩增反应混合液23μL，加入疑似病例组织病料的DNA溶液2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为：依次进行95℃预变性5min、94℃50s、55℃60s、72℃60s，并依此进行35个循环，最后72℃延伸10min，得到疑似病例组织病料扩增反应产物，备用。

5)取扩增反应混合液23μL，加入阴性对照样品溶液2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为：依次在95℃条件下预变性5min、94℃条件下预变性50s、55℃条件下预变性60s、72℃条件下预变性60s，依次进行35个循环，最后在72℃条件下延伸10min，得到阴性对照样品扩增反应产物，备用。

6)取扩增反应混合液23μL，加入阳性对照物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为：依次在95℃条件下预变性5min、94℃条件下预变性50s、55℃条件下预变性60s、72℃条件下预变性60s，依次进行35个循环，最后在72℃条件下延伸10min，得到阳性对照物扩增反应产物。

实施例3

(1)引物的设计与制备

同实施例1。

(2)血清样品的处理与DNA溶液的提取

1)对疑似病例鸡进行翅静脉采血，自然凝固，待血清析出后分离血清，备用。

2)吸取100μL待检分离血清置入1.5mL无菌EP管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管空气中自然干燥，用40μL的8mmol·L^-1NaOH溶液溶解，得到待检分离血清的DNA溶液，备用。

3)同时进行阴性对照样品溶液的处理：吸取100μL阴性对照物灭菌三蒸水置入1.5mL无菌EP管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL的-20℃的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用体积分数为75％的乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，再用40μL的8mmol·L^-1NaOH溶液溶解，得到阴性对照样品溶液，备用。

(3)用本发明的用于诊断FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR检测试剂盒检测MDV、FAdV、REV和ALV

4)取扩增反应混合液23μL，加入待检分离血清的DNA溶液2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为：依次进行95℃预变性5min、94℃50s、55℃60s、72℃60s，并依此进行35个循环，最后72℃延伸10min，得到待检分离血清扩增反应产物，备用。

5)取扩增反应混合液23μL，加入阴性对照样品溶液2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为：依次在95℃条件下预变性5min、94℃条件下预变性50s、55℃条件下预变性60s、72℃条件下预变性60s，依次进行35个循环，最后在72℃条件下延伸10min，得到阴性对照样品扩增反应产物，备用。

6)取扩增反应混合液23μL，加入阳性对照物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为：依次在95℃条件下预变性5min、94℃条件下预变性50s、55℃条件下预变性60s、72℃条件下预变性60s，依次进行35个循环，最后在72℃条件下延伸10min，得到阳性对照物扩增反应产物。

实施例4

(1)引物的设计与制备

同实施例1。

(2)全血样品的处理与DNA提取

1)注射器中加入肝素钠抗凝剂，对疑似病例鸡进行翅静脉采血，混匀后即得抗凝血，备用。

2)吸取100μL待检抗凝血置入1.5mL无菌EP管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管空气中自然干燥，用40μL的8mmol·L^-1NaOH溶液溶解，得待检抗凝血的DNA溶液，备用。

3)同时进行阴性对照样品溶液的处理：吸取100μL阴性对照物灭菌三蒸水置入1.5mL无菌EP管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL的-20℃的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用体积分数为75％的乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，再用40μL的8mmol·L^-1NaOH溶液溶解，得到阴性对照样品溶液，备用。

(3)用本发明的用于诊断FAdV/MDV/ALV/REV4重PCR检测试剂盒检测MDV、FAdV、REV和ALV

4)取扩增反应混合液23μL，加入待检抗凝血的DNA溶液2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为：依次进行95℃预变性5min、94℃50s、55℃60s、72℃60s，并依此进行35个循环，最后72℃延伸10min，得到待检抗凝血的扩增反应产物，备用。

5)取扩增反应混合液23μL，加入阴性对照样品溶液2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为：依次在95℃条件下预变性5min、94℃条件下预变性50s、55℃条件下预变性60s、72℃条件下预变性60s，依次进行35个循环，最后在72℃条件下延伸10min，得到阴性对照样品扩增反应产物，备用。

6)取扩增反应混合液23μL，加入阳性对照物2μL，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为：依次在95℃条件下预变性5min、94℃条件下预变性50s、55℃条件下预变性60s、72℃条件下预变性60s，依次进行35个循环，最后在72℃条件下延伸10min，得到阳性对照物扩增反应产物。

结果判定

(1)称取1.0g琼脂糖，加入100mL 1×TAE缓冲液中，微波炉中加热融化，加入5μL(100mg/mL)溴化乙锭，混匀，倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度为5mm，待冷却凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入1×TAE缓冲液淹没胶面；

(2)分别取5μL上述实施例2～4所得的各个扩增产物和上样缓冲液混匀，加入加样孔中，同时加5μL DL2000 DNA分子量标准；

(3)电压80V～100V，或电流40mA～50mA，电泳30min；

(4)取出凝胶，置入紫外分析仪中观察，或置入凝胶成像系统中观察照相；

(5)以DL2000 DNA分子质量标准作为参照，阴性对照不出条带，阳性对照出1085bp、750bp、508bp、312bp共4个条带，说明对照成立。样品中出现1085bp一个条带，即为单一马立克氏病病毒感染；样品出现750bp一个条带，即为单一Ⅰ群禽腺病毒感染；样品出现508bp一个条带，即为单一禽网状内皮组织增生症病毒感染；样品出现312bp一个条带，即为单一鸡淋巴细胞白血病病毒感染。如果出现2条、3条或4条特异性条带，即为相应病毒的2重、3重或4重混合感染。

虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。