本发明涉及L-脯氨酸4-羟化酶的几种突变体。
背景技术：
反式-(2S,4R)-4-羟基-L-脯氨酸(L-Hyp)存在于植物和动物中。在植物中和多糖小侧链结合形成糖蛋白。在动物中前胶原的脯氨酸残基羟化成羟脯氨酸。这些羟基化的残基之间的氢键用于稳定前胶原的三股螺旋。L-Hyp与脯氨酸一起从明胶水解物中分离出来。L-Hyp作为胶原的成分，是一种非必需氨基酸，并且在宜它霉素等次级代谢物中被发现。
L-Hyp有C-2和C-4两个手性中心，是生产多功能吡咯烷环的原料。吡咯烷环的所有位置都可以发生替代。C-3位替代可以通过氧化成4-羟基或形成烯烃完成。C-5功能化通过这个位置的氧化反应实现也有报道。C-2和C-4的转化可以轻易实现导致所有4种可能的L-Hyp异构体。L-Hyp脱羧也是形成手性4-羟基吡咯烷的简单方法。L-Hyp可以产生大量手性分子，如谷氨酸类似物、红藻氨酸、精氨酸类似物、碳青霉烯类，自然产物如网纹马勃酸、bulgecins、ecinochandins或didemnins，以及全合成的哌啶和吡咯烷，苯(并)二氮、嘌呤霉素类似物、巴氯芬、喹诺酮类、naphthyridones等(参见REMUZON P 1996.Trans-4-Hydroxy.L-ProHne,a Useful and Versatile Chiral Starting Block.TETRAHEDRON[J],52(44):13803-13835)。
技术实现要素：
L-Hyp在工业上通过水解哺乳动物胶原生产。但这种方法收率低、造成环境污染，所以需要更加绿色环保的方法。因此微生物发酵生产L-Hyp受到越来越多的关注。目前国际上通过微生物发酵生产L-Hyp的主要方法是日本协和发酵工业株式会社采用的整细胞催化方法，用表达L-脯氨酸4-羟化酶(P4H)的重组大肠杆菌整细胞催化L-脯氨酸生产羟脯氨酸，2-酮戊二酸由葡萄糖分解代谢提供，最高产量是发酵100小时产生41g/LL-Hyp(参见TAKESHI SHIBASAKI H M,AKIO OZAKI 2000.Enzymatic production of trans-4-hydroxy-L-proline by regio-and stereospecific hydroxylation of L-proline.Biosci.Biotechnol.Biochem.[J],64(4):746-750.)。
在哺乳动物中L-脯氨酸通过原胶原-脯氨酸双加氧酶(脯胺酰羟化酶)(EC1.14.11.2)形成。这个酶属于2-酮戊二酸依赖的双加氧酶，需要2-酮戊二酸和氧气作为共同底物及亚铁离子作为辅因子。但这个酶只接受肽基脯氨酸作为底物，不接受游离脯氨酸作底物。相反，L-脯氨酸4-羟化酶可以羟化游离L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸(L-Hyp)。有研究发现Streptomyces griseoviridus P-8648只有在合成宜他霉素时具有L-脯氨酸4-羟化酶活性，活性只有907pmol/min每毫克蛋白，基因没有克隆。Takeshi Shibasaki等筛选到具有L-脯氨酸4-羟化酶活性的Dactylosporangium sp.Strain RH1，活性为2.31nmol/min每毫克蛋白，并克隆到该基因(参见SHIBASAKI T,MORI H,CHIBA S,et al.1999.Microbial Proline 4-Hydroxylase Screening and Gene Cloning.Appl.Environ.Microbiol.[J],65(9):4028-4031)。
Takeshi Shibasaki将来自Dactylosporangium sp.RH1的L-脯氨酸4-羟化酶基因5’端密码子优化后构建到串联色氨酸启动子的载体中，在大肠杆菌W1485中过表达。活性为46nmol/min每毫克湿细胞(参见SHIBASAKI T,MORI H,OZAKI A 2000.Enzymatic production of trans-4-hydroxy-L-proline by regio-and stereospecific hydroxylation of L-proline.Biosci.Biotechnol.Biochem.[J],64(4):746-750)。
Francesco Falcioni等将GenBank中p4h基因(accession number D78338)经密码子优化后在pET-24a(Novagen)和大肠杆菌BL21(DE3)(pLysS)中表达，静息细胞、透性细胞和细胞提取物活性分别是12、28、205nmol/min每毫克细胞干重。L-脯氨酸4-羟化酶的产生依赖胞外脯氨酸的可利用性和密码子使用。增加胞内可溶蛋白水平不会增加静息细胞的活性，而透性化细胞活性增加高达5倍，说明是细胞的生理机能而不是胞内可溶蛋白水平决定整细胞羟化水平。另外P4H表达会诱导putA和putP转录水平下降导致脯氨酸摄取降低(参见FALCIONI F,BLANK L M,FRICK O,et al.2013.Proline Availability Regulates Proline-4-Hydroxylase Synthesis and Substrate Uptake in Proline-Hydroxylating Recombinant Escherichia coli.Appl.Environ.Microbiol.[J],79(9):3091-3100)。Yulan Yi等将来源于Dactylosporangium sp.RH1，和Bordetella bronchiseptica RB50的L-脯氨酸4-羟化酶在大肠杆菌BL21/pET-28a中表达，活性分别为60.4、22.2、50.0nmol/min每毫克湿细胞(参见YI Y,SHENG H,LI Z,et al.2014.Biosynthesis of trans-4-hydroxyproline by recombinant strains of Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli.BMC Biotechnol[J],14:44)。
L-脯氨酸4-羟化酶在大肠杆菌中表达发现形成大量无活性包涵体，给菌体生长造成负担，限制细胞催化活性。目前的研究主要集中在对密码子、表达载体和表达宿主的优化等方面，主要是为了增加目的蛋白质的表达量，但这对提高反应效率的作用非常有限。体外直接进化可以显著提高酶的稳定性、表达和活性，已成为应用最广泛和成功的提高生物催化的方法。直接进化以很低的频率随机引入广泛分布在目标基因的突变，然后筛选突变蛋白获得需要的特性。直接进化可以相对快速的对蛋白质进行改造，而不需要对结构功能关系的深入了解。直接进化的关键是开发高通量的筛选方法(参见CHICA R A,DOUCET N,PELLETIER J N 2005.Semi-rational approaches to engineering enzyme activity:combining the benefits of directed evolution and rational design.Curr Opin Biotechnol[J],16:378-384)。
本发明的发明人经过深入地研究，得到了L-脯氨酸4-羟化酶的几种突变体，其可以显著地提高发酵生产L-Hyp的能力。
本发明涉及如下内容：
1.一种L-脯氨酸4-羟化酶，其序列为在SEQ ID No.:3所示的序列中具有如下(1)～(10)突变中的一种或多种：
(1)SEQ ID No.:3中第91位氨基酸从组氨酸到谷氨酰胺的突变(H91Q)；
(2)SEQ ID No.:3中第228位氨基酸从缬氨酸到苯丙氨酸的突变(V228F)；
(3)SEQ ID No.:3中第89位氨基酸从酪氨酸到苯丙氨酸的突变(Y89F)；
(4)SEQ ID No.:3中第228位氨基酸从缬氨酸到丙氨酸的突变(V228A)；
(5)SEQ ID No.:3中第54位氨基酸从缬氨酸到丙氨酸的突变(V54A)；
(6)SEQ ID No.:3中第53位氨基酸从苏氨酸到丙氨酸的突变(T53A)；
(7)SEQ ID No.:3中第152位氨基酸从亮氨酸到谷氨酰胺的突变(L152Q)；
(8)SEQ ID No.:3中第165位氨基酸从天冬氨酸到谷氨酸的突变，以及第266位氨基酸从苯丙氨酸到亮氨酸的突变(D165E；F266L)；
(9)SEQ ID No.:3中第53位氨基酸苏氨酸到丙氨酸的突变，以及第272位氨基酸从缬氨酸到异亮氨酸的突变(T53A；V272I)；
(10)SEQ ID No.:3中第5位氨基酸苏氨酸到丝氨酸的突变，以及第171位氨基酸从亮氨酸到谷氨酰胺的突变(T5S；L171Q)。
2.一种L-脯氨酸4-羟化酶，其序列为在SEQ ID No.:3所示的序列中具有第91位氨基酸从组氨酸到谷氨酰胺的突变(H91Q)。
3.一种L-脯氨酸4-羟化酶，其序列为在SEQ ID No.:3所示的序列中具有第228位氨基酸从缬氨酸到苯丙氨酸的突变(V228F)。
4.一种L-脯氨酸4-羟化酶，其序列为在SEQ ID No.:3所示的序列中具有第89位氨基酸从酪氨酸到苯丙氨酸的突变(Y89F)。
5.一种L-脯氨酸4-羟化酶，其序列为在SEQ ID No.:3所示的序列中具有第228位氨基酸从缬氨酸到丙氨酸的突变(V228A)。
6.一种DNA，其编码项1～5中任一项所述的L-脯氨酸4-羟化酶。
7.一种重组载体，其具有项6所述的DNA。
8.一种生产反式-(2S,4R)-4-羟基-L-脯氨酸的方法，其包括，在培养基中培养具有项1～5中任一项所述的L-脯氨酸4-羟化酶的细菌。
9.一种生产反式-(2S,4R)-4-羟基-L-脯氨酸的方法，其包括：利用对于2-酮戊二酸的亲和性提高的酶来生产反式-(2S,4R)-4-羟基-L-脯氨酸。
10.根据项9所述的方法，其中，对于2-酮戊二酸的亲和性提高的酶是项1～5中任一项所述的酶。
附图说明
图1.C端融合His标签的L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体(C-HisP4H46)和C端融合His标签的L-脯氨酸4-羟化酶(C-HisP4H)的SDS-PAGE图，在图1中从左到右分别为C-HisP4H46、蛋白Maker、C-HisP4H以及蛋白Maker。
具体实施方式
以下，对本文的详细内容和实施方式进行具体说明。
如无特殊说明，本文中所用术语的含义与本领域技术人员一般理解的含义相同，但如有冲突，则以本文中的定义为准。本文中，所涉及的数值一般指重量或重量百分比，除非特殊说明。
<L-脯氨酸4-羟化酶的突变体>
来源于指孢囊菌Dactylosporangium sp.RH1的L-脯氨酸4-羟化酶是已报道的活性最高的催化L-脯氨酸(L-Pro)形成反式4-羟基-L-脯氨酸(L-Hyp)的羟化酶，其基因p4h已在NCBI上公开(GenBank：D78338.1),其碱基序列参见本发明书及其序列表SEQ ID NO.:1所示，共有819个碱基。
本发明人对来自指孢囊菌Dactylosporangium sp.RH1的L-脯氨酸4-羟化酶的DNA序列进行了密码子优化，得到了op4h基因，其序列如SEQ ID NO.:2所示，共有819个碱基。
本发明得到的L-脯氨酸4-羟化酶的突变体是基于上述op4h基因产生的突变。
本发明涉及一种L-脯氨酸4-羟化酶，其是原始L-脯氨酸4-羟化酶(其氨基酸序列参见：SEQ ID No.:3)的突变体，由于上述DNA序列的最后一个终止密码子没有翻译成相应的氨基酸，因此原始L-脯氨酸4-羟化酶共有272个氨基酸残基。
本发明涉及的L-脯氨酸4-羟化酶的突变体的序列为在SEQ ID No.:3所示的序列中具有如下(1)～(10)突变中的一种或多种：
(1)SEQ ID No.:3中第91位氨基酸从组氨酸到谷氨酰胺的突变(H91Q)；
(2)SEQ ID No.:3中第228位氨基酸从缬氨酸到苯丙氨酸的突变(V228F)；
(3)SEQ ID No.:3中第89位氨基酸从酪氨酸到苯丙氨酸的突变(Y89F)；
(4)SEQ ID No.:3中第228位氨基酸从缬氨酸到丙氨酸的突变(V228A)；
(5)SEQ ID No.:3中第54位氨基酸从缬氨酸到丙氨酸的突变(V54A)；
(6)SEQ ID No.:3中第53位氨基酸从苏氨酸到丙氨酸的突变(T53A)；
(7)SEQ ID No.:3中第152位氨基酸从亮氨酸到谷氨酰胺的突变(L152Q)；
(8)SEQ ID No.:3中第165位氨基酸从天冬氨酸到谷氨酸的突变，以及第266位氨基酸从苯丙氨酸到亮氨酸的突变(D165E；F266L)；
(9)SEQ ID No.:3中第53位氨基酸苏氨酸到丙氨酸的突变，以及第272位氨基酸从缬氨酸到异亮氨酸的突变(T53A；V272I)；
(10)SEQ ID No.:3中第5位氨基酸苏氨酸到丝氨酸的突变，以及第171位氨基酸从亮氨酸到谷氨酰胺的突变(T5S；L171Q)。
上述(1)～(10)突变可以单独存在于突变体中，突变体中也可以同时存在上述(1)～(10)突变中的多种，例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种。
在本发明的一个具体的实施方式中，涉及一种L-脯氨酸4-羟化酶，其为SEQ ID No.:3中第91位氨基酸从组氨酸到谷氨酰胺的突变(H91Q)，将表达该突变体的质粒转化到细菌中，进行培养，其发酵液上清中L-Hyp的产量是将原始来源于指孢囊菌Dactylosporangium sp.RH1的L-脯氨酸4-羟化酶利用相同的质粒和菌体培养时的3.37倍。
在本发明的一个具体的实施方式中，涉及一种L-脯氨酸4-羟化酶，其为SEQ ID No.:3中第228位氨基酸从缬氨酸到苯丙氨酸的突变(V228F)，将表达该突变体的质粒转化到细菌中，进行培养，其发酵液上清中L-Hyp的产量是将原始来源于指孢囊菌Dactylosporangium sp.RH1的L-脯氨酸4-羟化酶利用相同的质粒和菌体培养时的3.05倍。
在本发明的一个具体的实施方式中，涉及一种L-脯氨酸4-羟化酶，其为SEQ ID No.:3中第89位氨基酸从酪氨酸到苯丙氨酸的突变(Y89F)，将表达该突变体的质粒转化到细菌中，进行培养，其发酵液上清中L-Hyp的产量是将原始来源于指孢囊菌Dactylosporangium sp.RH1的L-脯氨酸4-羟化酶利用相同的质粒和菌体培养时的2.28倍。
在本发明的一个具体的实施方式中，涉及一种L-脯氨酸4-羟化酶，其为SEQ ID No.:3中第228位氨基酸从缬氨酸到丙氨酸的突变(V228A)，将表达该突变体的质粒转化到细菌中，进行培养，其发酵液上清中L-Hyp的产量是将原始来源于指孢囊菌Dactylosporangium sp.RH1的L-脯氨酸4-羟化酶利用相同的质粒和菌体培养时的2.14倍。
在本发明的一个具体的实施方式中，涉及一种L-脯氨酸4-羟化酶，其为SEQ ID No.:3中第54位氨基酸从缬氨酸到丙氨酸的突变(V54A)，将表达该突变体的质粒转化到细菌中，进行培养，其发酵液上清中L-Hyp的产量是将原始来源于指孢囊菌Dactylosporangium sp.RH1的L-脯氨酸4-羟化酶利用相同的质粒和菌体培养时的1.83倍。
在本发明的一个具体的实施方式中，涉及一种L-脯氨酸4-羟化酶，其为SEQ ID No.:3中第53位氨基酸从苏氨酸到丙氨酸的突变(T53A)，将表达该突变体的质粒转化到细菌中，进行培养，其发酵液上清中L-Hyp的产量是将原始来源于指孢囊菌Dactylosporangium sp.RH1的L-脯氨酸4-羟化酶利用相同的质粒和菌体培养时的1.78倍。
在本发明的一个具体的实施方式中，涉及一种L-脯氨酸4-羟化酶，其为SEQ ID No.:3中第152位氨基酸从亮氨酸到谷氨酰胺的突变(L152Q)，将表达该突变体的质粒转化到细菌中，进行培养，其发酵液上清中L-Hyp的产量是将原始来源于指孢囊菌Dactylosporangium sp.RH1的L-脯氨酸4-羟化酶利用相同的质粒和菌体培养时的1.46倍。
在本发明的一个具体的实施方式中，涉及一种L-脯氨酸4-羟化酶，其为SEQ ID No.:3中第165位氨基酸从天冬氨酸到谷氨酸的突变，以及第266位氨基酸从苯丙氨酸到亮氨酸的突变(D165E；F266L)，将表达该突变体的质粒转化到细菌中，进行培养，其发酵液上清中L-Hyp的产量是将原始来源于指孢囊菌Dactylosporangium sp.RH1的L-脯氨酸4-羟化酶利用相同的质粒和菌体培养时的1.4倍。
在本发明的一个具体的实施方式中，涉及一种L-脯氨酸4-羟化酶，其为SEQ ID No.:3中第53位氨基酸苏氨酸到丙氨酸的突变，以及第272位氨基酸从缬氨酸到异亮氨酸的突变(T53A；V272I)，将表达该突变体的质粒转化到细菌中，进行培养，其发酵液上清中L-Hyp的产量是将原始来源于指孢囊菌Dactylosporangium sp.RH1的L-脯氨酸4-羟化酶利用相同的质粒和菌体培养时的1.35倍。
在本发明的一个具体的实施方式中，涉及一种L-脯氨酸4-羟化酶，其为SEQ ID No.:3中第5位氨基酸苏氨酸到丝氨酸的突变，以及第171位氨基酸从亮氨酸到谷氨酰胺的突变(T5S；L171Q)，将表达该突变体的质粒转化到细菌中，进行培养，其发酵液上清中L-Hyp的产量是将原始来源于指孢囊菌Dactylosporangium sp.RH1的L-脯氨酸4-羟化酶利用相同的质粒和菌体培养时的1.33倍。
2015年Francesco Falcioni等在产L-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌中表达密码子优化的Dactylosporangium sp.RH1p4h基因，以葡萄糖为唯一碳源生产L-Hyp，摇瓶产量为0.2358g/l(参见FRANCESCO FALCIONI B B H,ANDREAS SCHMID 2015.Efficient Hydroxyproline Production From Glucose in Minimal Media by Corynebacterium glutamicum.Biotechnology and Bioengineering[J])。2014年Yulan Yi等将来源于Dactylosporangium sp.的p4h基因分别在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中表达，L-Hyp的摇瓶产量分别是0.470g/l和0.113g/l(参见YI Y,SHENG H,LI Z,et al.2014.Biosynthesis of trans-4-hydroxyproline by recombinant strains of Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli.BMC Biotechnol[J],14:44)。
表达本发明的L-脯氨酸4-羟化酶突变体的细菌的未经优化的摇瓶发酵培养液上清的L-Hyp的产量也远远大于上述文献表达的研究结果。本发明得到的表达本发明的L-脯氨酸4-羟化酶突变体的细菌的初步摇瓶发酵培养的上清液的L-Hyp的产量高达1g/L以上，并可高达将近3g/L。可见，其将文献报道的较高的产量0.470g/l提高了近2～6倍。
对本发明得到的L-脯氨酸4-羟化酶突变体进行酶动力学的研究发现，本发明得到的L-脯氨酸4-羟化酶突变体对于L-脯氨酸羟化反应的共同底物2-酮戊二酸的亲和性显著提高。2-酮戊二酸是脯氨酸羟化酶催化L-脯氨酸羟化生成L-Hyp所必需的，整细胞催化生产L-Hyp一般是利用菌体代谢葡萄糖产生的2-酮戊二酸(参见TAKESHI SHIBASAKI H M,AKIO OZAKI 2000.Enzymatic production of trans-4-hydroxy-L-proline by regio-and stereospecific hydroxylation of L-proline.Biosci.Biotechnol.Biochem.[J],64(4):746-750)。
本发明人在研究的过程中曾尝试在反应体系中外添加2-酮戊二酸来增加L-Hyp的产量，但2-酮戊二酸非常不稳定，其次是2-酮戊二酸随着浓度的升高会抑制酶活性，因此通过外加2-酮戊二酸来提高L-Hyp的产量基本上是不可行的，因此2-酮戊二酸的供给只能是依靠菌体自身代谢产生。根据文献记载的数据可以知道，大肠杆菌代谢葡萄糖时胞内2-酮戊二酸浓度为121μM(参见ZIMMERMANN M,SAUER U,ZAMBONI N 2014.Quantification and mass isotopomer profiling of alpha-keto acids in central carbon metabolism.Anal Chem[J],86:3232-3237)，因此推测胞内2-酮戊二酸很可能是羟化反应的限制底物。
在一个具体的实施方式中，L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体的P4H46酶对2-酮戊二酸的Km下降，约为突变前的P4H的1/3，而对脯氨酸的Km值约为P4H酶的16倍，可见其对于2-酮戊二酸的亲和性显著高于突变前的原始酶。推测本发明的各突变体酶由于对2-酮戊二酸的亲和性显著提高，因此可以大幅提高发酵生产L-Hyp的能力。
<L-脯氨酸4-羟化酶突变体的DNA序列>
本发明涉及一种DNA序列，其编码本发明涉及的L-脯氨酸4-羟化酶突变体的序列。
用于本说明书的术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白质产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA或重组核苷酸序列。
本发明中所述的DNA序列可以和其它调控序列结合在一起，产生重组载体，该载体可以包括一个或多个(数个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码肽段的DNA序列。备选的，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述氨基酸序列的DNA序列来表达本文的DNA序列。在制备重组载体的过程中，将编码序列导入载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。启动子、转录信号、翻译终止信号以及其它调控序列是任何本领域普通技术人员能够可以根据常规选择而确定的。
根据本发明，还提供具有本发明的DNA的重组载体。重组载体是指包含使得该DNA编码的蛋白质能够在宿主细胞内表达的表达调控区的重组载体。具体地，通常是本发明的DNA和适合宿主微生物的启动子连接而得的载体，其中本发明的DNA的编码区域的5'末端侧连接于该启动子的下游。对于载体没有特殊限制，只要能够在宿主微生物内复制增殖即可，可以列举出质粒载体、穿梭载体和噬菌体载体。
用于表达编码本发明的酶蛋白质的DNA的启动子，通常可以使用宿主微生物所带有的启动子，但不限于此，可以适用任何启动子，只要是用于引发本发明的酶蛋白质的基因的转录的碱基序列即可。具体地，可以列举出乳糖操纵子的启动子、色氨酸操纵子的启动子、λ噬菌体来源的PL启动子、色氨酸乳糖杂合(tac)启动子(H.A.Bose等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,Vol.80,p.21(1983))等。这些启动子中，出于提高表达效率的目的，也可以使用有诱导性的启动子。例如。对于上述乳糖操纵子的启动子的情况，可以通过添加乳糖或异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导基因表达。
根据本发明，还提供将本发明的DNA或重组载体导入宿主细胞而得到的转化体。对于导入本发明的DNA或重组载体的宿主没有特殊限制，可以适宜地使用埃希氏菌属(Escherichia)细菌例如大肠杆菌、放线菌属(Actinomycetes)细菌、芽孢杆菌属(Bacillus)细菌、沙雷氏菌属(Serratia)细菌、假单胞菌属(Pseudomonas)细菌、棒杆菌属(Corynebacterium)细菌、短杆菌属(Brevibacterium)细菌、红球菌属(Rhodococcus)细菌、乳杆菌属(Lactobacillus)细菌、链霉菌属(Streptomyces)细菌、栖热菌属(Thermus)细菌、链球菌属(Streptococcus)细菌、酵母菌属(Saccharomyces)酵母、毕赤酵母属(Pichia)酵母、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)酵母、假丝酵母属(Candida)酵母、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)酵母、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)酵母、耶氏酵母属(Yarrowia)酵母、隐球酵母属(Cryptococcus)酵母、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)酵母、曲霉属(Aspergillus)霉菌、被孢霉属(Mortierella)霉菌、镰刀菌属(Fusarium)霉菌、裂殖壶菌(Schizochytrium)属、破囊壶菌(Thraustochytrium)属等。优选地，宿主细胞可以是大肠杆菌、放线菌、假单胞菌属细菌、酵母菌属酵母。
作为将基因导入上述宿主微生物的方法，可以采用利用感受态细胞法[Journal of Molecular Biology,Vol.53,p.159(1970)]、乙酸锂法[Ito,H.等人，J.Bacteriol.,Vol.153,p.163(1983)]、原生质球法[Hinnen,A.,等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.75,p.1929(1978)]、电脉冲法[J.Indust.Microbiol.,Vol.5,p.159(1990)]等的转化法、使用噬菌体的转化法[E.Ohtsubo,Genetics,Vol.64,p.189(1970)]、接合转移法[J.G.C.Ottow,Ann.Rev.Microbiol.,Vol.29,p.80(1975)]、细胞融合法[M.H.Gabor,J.Bacteriol.,Vol.137,p.1346(1979)]等。从这些方法中可以适宜选择适合宿主微生物的方法。
除了使用诸如上述的表达载体的表达方法以外，还可以通过将与启动子连接后的编码本发明的酶蛋白质的DNA直接导入宿主微生物的染色体中的同源重组技术、或者使用转座子、插入序列等进行导入的技术来进行表达。因此，本发明的转化体只要表达本发明的酶蛋白质即可，对于基因导入的方法没有限制。
<生产反式-(2S,4R)-4-羟基-L-脯氨酸的方法>
本发明涉及生产反式-(2S,4R)-4-羟基-L-脯氨酸的方法，其包括，在培养基中培养具有本发明的L-脯氨酸4-羟化酶突变体的细菌。
在培养基中培养具有本发明的L-脯氨酸4-羟化酶突变体的细菌，并通过从该培养基中采集反式-(2S,4R)-4-羟基-L-脯氨酸，可以生产反式-(2S,4R)-4-羟基-L-脯氨酸(L-Hyp)。作为使用的培养基，可以列举出含有碳源、氮源、硫源、无机离子以及需要的其他有机成分的通常的培养基。
作为碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、糖蜜、淀粉水解物等糖类、富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。作为氮源，可以使用硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等无机铵盐、大豆水解物等有机氮、氨气、氨水等。作为硫源，可以列举出硫酸盐、亚硫酸盐、硫化物、连二亚硫酸盐、硫代硫酸盐等无机硫化物。作为有机微量营养源，优选适量含有维生素B1等必需物质或者酵母提取物等。除此之外，根据需要可以少量添加磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。培养在需氧的条件下进行30～90小时较好，培养温度为25℃～37℃，且优选将培养中的pH控制在5～8的范围内。此外，可以使用无机或者有机的酸性或者碱性物质，以及氨气等来调节pH值。
就培养结束后从培养基溶液中采集L-Hyp而言，在本发明中不需要特别的方法。本发明中采集出的L-Hyp除了含有作为目标的L-Hyp之外，还可以含有微生物菌体、培养基成分、水分以及微生物的代谢副产物等。可以通过组合已经公知的离子交换树脂法、膜分离法、晶析法、以及其他的方法采集L-Hyp。
本发明还涉及一种生产反式-(2S,4R)-4-羟基-L-脯氨酸的方法，其包括：利用对于2-酮戊二酸的亲和性提高的酶来生产反式-(2S,4R)-4-羟基-L-脯氨酸。
如上所述，2-酮戊二酸是L-脯氨酸羟化反应的共同底物，经过氧化性脱羧形成琥珀酸。在整细胞催化产生L-Hyp的反应中L-脯氨酸一般是外源加入，保证足量供给。2-酮戊二酸是脯氨酸羟化酶催化L-脯氨酸羟化生成L-Hyp所必需的，整细胞催化生产L-Hyp一般是利用菌体代谢葡萄糖产生的2-酮戊二酸。而2-酮戊二酸由于其不稳定的特性，无法通过外加来提高其含量，因此利用对于由细菌代谢自身产生的2-酮戊二酸成为仅有的途径，因此在本发明涉及的方法中，如果采用对于2-酮戊二酸的亲和性提高的酶来生产反式-(2S,4R)-4-羟基-L-脯氨酸，将显著提高L-Hyp的含量。
对于2-酮戊二酸的亲和性提高的酶具体来说可以列举本发明所提到的L-脯氨酸4-羟化酶突变体。
实施例
下面结合具体实施例对本文作进一步说明，但本文并不限于以下实施例。
在下述实施例中使用到的培养基、电转化以及培养方法总结如下。
LB培养基：每升含有10g NaCl、5g酵母提取物和10g胰蛋白胨。
M9*培养基：每升含有17.1g Na2HPO4·12H2O、3.0g KH2PO4、0.5g NaCl、1.0g NH4Cl、246mg MgSO4·7H2O、11.1mg无水CaCl2和27.8mg FeSO4·7H2O。在培养E.coli WD3及含有脯氨酸羟化酶表达载体的E.coli WD3时需要在上述M9*培养基中加入(每升)：27g葡萄糖和13.1g L-脯氨酸。
此外，根据需要还可能向上述两种培养基中添加终浓度0.1mM的IPTG和终浓度50mg/L的氨苄青霉素。
在实施例中如果没有额外描述通常使用如下的菌株培养方法：挑取平板上的单菌落接种到5ml含50mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜(15～16小时)，作为种子液。将种子液按2％的比例接种到配制好的M9*培养基中，于30℃，200rpm培养24-48小时(96孔板培养24h，摇瓶培养48h)。
电转感受态的制备及电转化方法：从LB平板上挑取单菌落至20mL液体LB培养基中，在37℃摇床中过夜培养。取400μL过夜培养物接种至装有20mL液体LB培养基的100mL锥形瓶中，在37℃摇床中培养至OD600在0.4～0.6之间。取10mL菌液至高压灭菌处理的15mL聚丙烯离心管中，在高速冷冻离心机4℃条件下6000rpm离心5min。用10mL无菌预冷过的水洗涤重悬，4℃条件下6000rpm离心5min，倒去上清夜。重复3次。用400μL质量分数为15％甘油溶液洗出，以每管120μL重悬菌体分装于3个1.5mL EP管中，并置于-80℃超低温冰箱冻存。
2μl质粒加入到120μl电转感受态细胞中，混匀后转入电转杯。用Electroporator 2510(Eppendorf)电转仪电击转化，工作电压为1800V。电击完成后立即向电转杯中加入800μl的LB液体培养基，混匀后将菌液转移到EP管中，37℃复苏45min。6000转离心5min，去掉700μl上清液，剩余菌液重悬后全部涂布到氨苄青霉素抗性的LB平板上。
在本发明实施例中采用的几种检测方法。
(1)氯胺T法检测反式4-羟基L-脯氨酸含量
根据国标《GB/T9695.23-2008/ISO3496：1994肉与肉制品羟脯氨酸含量测定》制定本检测方法。缓冲液(pH6.8)(每升)：26.0g一水柠檬酸、14.0g氢氧化钠、78.0g无水乙酸钠、250ml正丙醇。氯胺T溶液(每10ml)：141mg三水·N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐(氯胺T)，10ml缓冲液。显色剂(每10ml)：1.0g对二甲氨基苯甲醛、3.5ml高氯酸溶液[60％(质量分数)]、6.5ml异丙醇。将通过上述菌体培养方法培养24～48小时后获得的发酵液在12,000rpm条件下离心1min，上清用去离子水稀释相应倍数，作为样品。取稀释好的样品100μl溶液加于96孔滴定板中，加入50μl上述氯胺T溶液，混合后于室温下放置20min±1min，然后加入50ul显色剂充分混匀，置于鼓风干燥箱中60℃反应20min。反应完成后置于冰上冷却3min，室温下放置30min，用水做参比，于558nm±2nm处用酶标仪测定吸收值。扣除空白溶液的吸收，此外，标准储备液(每100ml)：50mg 4-羟基-α吡咯甲酸(羟脯氨酸)。标准工作液：用稀释得到浓度依次是0.5ug/ml、1.0ug/ml、1.5ug/ml、2.0ug/ml和2.5ug/ml的标准工作液。并根据标准曲线计算产品样中羟脯氨酸的含量。
(2)HPLC法检测反式4-羟基L-脯氨酸含量
样品的制备方法与上述方法(1)中的相同，取200μl稀释好的样品加入2.5mg/ml的FMOC-Cl 200μl，混匀后反应20min。然后加入600μl正戊烷终止反应，混匀待分层后用移液枪吸出上层正戊烷，重复洗涤一次。加入含20％(v/v)乙腈的0.25M硼酸缓冲液140μl混匀，离心后取上清用于HPLC检测。流动相A(每升)：20mM NaAc、200ul三乙胺和6ml四氢呋喃，pH5.8，流动相B(每升)：450ml甲醇、450ml乙腈和100ml水。色谱柱为Eclipse Plus C18,4.6×250mm,5μm。色谱仪为waters高效液相色谱仪(2998 photodiode Array Dectector、1525 Binary HPLC Pump和2707Auto Sampler)。检测波长为262nm，柱温40℃，流速1.0ml/min，进样量20ul，梯度洗脱程序为0-3min 90％A，8-15min 70％A，20-22min 10％A，23-28min 90％A。
标准储备液为10mM L-Hyp(每100ml含131mg羟脯氨酸)，标准工作液浓度为1mM、2mM、3mM、4mM和5mM。用标准工作液的HPLC结果绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中L-Hyp的含量。
(3)L-脯氨酸4-羟化酶活性测定
向240ul含有12mM L-脯氨酸、24mM 2-酮戊二酸、4mM硫酸亚铁和8mML-抗坏血酸的240mM的MES((2-吗啉代)乙磺酸)-Tris缓冲液(pH6.5)中添加下述实施例中获得的菌体、菌体处理物或酶等样品各10μl，在35℃反应10分钟。然后将反应液于100℃加热2min，使反应停止，用高效液相色谱(以下简称HPLC)对反应液中生成的反式-4-羟基-L-脯氨酸进行定量分析，然后利用测定的反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量来计算酶活性，其中L-脯氨酸4-羟化酶活性定义为每分钟催化产生1nmol L-Hyp的酶活力为1U。其中，针对菌体样品进行如下处理：4℃离心收集培养获得的菌体，用240mM的MES-Tris缓冲液洗涤一次，存放在-20℃保存。
其中，下表1列出了在本发明实施例中所使用的菌种、质粒与引物。
表1 本发明实施例中使用的菌种、质粒与引物
本发明中所用的引物均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成
实施例1 L-脯氨酸4-羟化酶的DNA密码子优化
来源于指孢囊菌Dactylosporangium sp.RH1的L-脯氨酸4-羟化酶是已报道的活性最高的催化L-脯氨酸(L-Pro)形成反式4-羟基-L-脯氨酸(L-Hyp)的羟化酶，其基因p4h已在NCBI上公开(GenBank：D78338.1),其碱基序列参见本发明书及其序列表SEQ ID NO.:1所示。将此p4h基因由上海生工有限公司合成。因为不同菌种的密码子偏好性不同，为了更利于在大肠杆菌中表达，由DNA2.0公司进行密码子优化并合成了基因op4h，其序列参见本发明书及序列表中的SEQ ID NO.:2。将p4h基因和op4h基因插入pTrc99A质粒，分别获得pTrc99A-p4h和pTrc99A-op4h质粒，并通过上述电转化方法转化到表1中列出的E.coli W3110电转感受态细胞中表达，按照上述的菌株培养方法进行培养，收获菌体，并对该菌体进行破碎获得了上清液，利用上述方法检测获得的上清液中的L-脯氨酸4-羟化酶活性，并利用常规的考马斯亮蓝法检测了上清液中的总蛋白质的含量，根据酶活性和总蛋白质的检测结果，计算表达p4h基因和op4h基因的菌体上清液中的活性为相当于每毫克总蛋白质分别为51.16U和94.5U，根据该检测结果可以看出经密码子优化后的op4h基因催化活性更高，后续以op4h为出发序列进行研究。
实施例2 突变库的构建和筛选
以实施例1构建的pTrc99A-op4h为模板，以表1中的EP-F和EP-R为引物，利用易错PCR扩增p4h基因；并以表1中的pTrc99a-F和pTrc99a-R为引物，利用普通PCR扩增载体部分。易错PCR按照Zhao和Arnold报道的方法进行(ZHAO H M,ARNOLD,F.H.Optimization of DNA shuffling for high fidelity recombination[J].Nucleic acids research,1997,25(6):1307-8)。载体的扩增条件为98℃变性2min，然后进入以下30个循环：98℃变性20s、55℃退火30s、72℃延伸2min，循环完毕，72℃延伸5min。
通过Gibson反应将经过上述易错PCR扩增后的op4h基因和pTrc99A载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α化学感受态细胞，将转化子收集提取质粒获得L-脯氨酸4-羟化酶的质粒突变库EP lib R1。将EP lib R1质粒转化表1中列出的E.coli WD3电转感受态细胞获得易错突变库。挑取突变库单菌落接种到含LB培养基的96孔板培养种子液，将种子液接种到含M9*培养基的96孔板发酵。通过初步研究发现L-Hyp的生产能力和菌体生长速度正相关，因此通过检测发酵液OD600初筛第一轮突变的菌株，挑选OD600显著升高的菌株，通过HPLC检测其发酵液中L-Hyp的产量，得到10株L-Hyp产量提高的突变体。第二轮突变以第一轮突变中L-Hyp产量最高的突变体作为模板，按与上述方法相同的方法，构建易错突变库EP lib R2，并通过如上所述的氯胺T法检测发酵液中L-Hyp的产量，筛选得到2株L-Hyp产量显著提高的突变体。对两轮突变得到的12株突变体进行培养并提取质粒，并得到的突变体的氨基酸序列进行检测，通过检测确认经过两轮突变一共获得了10个L-脯氨酸4-羟化酶突变体，其中未突变的原始氨基酸序列参见本发明书及序列表中的SEQ ID NO.:3。对表达这10个突变体的菌株按照上述培养方法进行培养，并利用HPLC检测其发酵液上清中的L-Hyp产量，下表2中列出了10个L-脯氨酸4-羟化酶突变体的突变信息，以及发酵液上清中的L-Hyp产量，并与表达pTrc99a-op4h的E.coli WD3(即突变前酶生产菌株)进行比较。
将本发明得到的10种突变体酶与现有技术中的L-Hyp生产菌株进行比较，其中，在2015年Francesco Falcioni等在产L-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌中表达密码子优化的Dactylosporangium sp.RH1p4h基因，以葡萄糖为唯一碳源生产L-Hyp，摇瓶产量为0.2358g/l(参见FRANCESCO FALCIONI B B H,ANDREAS SCHMID 2015.Efficient Hydroxyproline Production From Glucose in Minimal Media by Corynebacterium glutamicum.Biotechnology and Bioengineering[J])。2014年Yulan Yi等将来源于Dactylosporangium sp.的p4h基因分别在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中表达，L-Hyp的摇瓶产量分别是0.470g/l和0.113g/l(参见YI Y,SHENG H,LI Z,et al.2014.Biosynthesis of trans-4-hydroxyproline by recombinant strains of Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli.BMC Biotechnol[J],14:44)。此外，根据下表2的数据可以看出，在本发明得到的10种突变体酶的L-Hyp的生产能力均显著高于原始菌株，并且也显著高于上述文献报道的生产能力。其中，本实施例中L-Hyp产量最高的突变体R2 4/1H的摇瓶产量为2.7g/l，是原始菌的3.37倍，其显著高于目前报道的摇瓶产L-Hyp的产量。此外，突变体R1 6/1H、R1 7/3A、和R1 6/7B的摇瓶产量也显著高于现有文献报道的产量。
表2 突变体L-Hyp产量和突变位点
实施例3 C端融合His标签的L-脯氨酸4-羟化酶的构建方法以及纯化L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体
分别以pTrc99A-op4h和实施例2中的携带有L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体的质粒pTrc99A-p4h46(该质粒是从表达L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体的菌体R2 4/1H中提取的)为模板，以CH-GSF和CH-GSR为引物PCR扩增op4h-Chis基因和p4h46-Chis(表达L-脯氨酸4-羟化酶H91Q的质粒)基因。扩增条件为98℃变性2min，然后进入以下30个循环：98℃变性20s、55℃退火30s、72℃延伸40s，循环完毕，72℃延伸5min。
分别以质粒pTrc99A-op4h和pTrc99A-p4h46为模板，GSVF和GSVR为引物，PCR扩增pTrc99A载体部分。扩增条件为98℃变性2min，然后进入以下30个循环：98℃变性20s、55℃退火30s、72℃延伸2min，循环完毕，72℃延伸5min。
通过Gibson反应将op4h-Chis基因或p4h46-Chis基因和分别或的pTrc99A载体进行连接，得到C端融合His标签的L-脯氨酸4-羟化酶或L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体表达载体pTrc99A-op4hChis和pTrc-p4h46Chis。
将该表达载体pTrc99A-op4hChis和pTrc-p4h46Chis分别通过上述电转化方法转化E.coli WD3电转感受态细胞，然后按照上述培养方法培养获得菌体，得到表达带有C端融合His标签的L-脯氨酸4-羟化酶或L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体，对该菌体破碎得到其上清液用于下述蛋白纯化步骤。
蛋白纯化在4-12℃层析柜中的AKTA prime(GE Healthcare)纯化装置上进行。用5倍柱体积的结合缓冲液(20mM Na2HPO4、0.5M NaCl、30mM imidazole，pH7.4)平衡HisTrap HP色谱柱(5ml)后，将上述上清液上柱，流速为5ml·min-1，用10倍柱体积的结合缓冲液洗脱未挂柱蛋白后，用洗脱缓冲液(20mM Na2HPO4、0.5M NaCl、500mM imidazole，pH7.4)线性梯度(0-100％，25ml)进行目标蛋白洗脱，L-脯氨酸4-羟化酶在洗脱缓冲液为60％-100％时洗出，收集组分。用 Ultra-15PL-10,10,000NMWL(Milipore)超滤管进行脱盐，4℃，5,000g离心40min，更换成pH6.5的MES-Tris缓冲液4℃，5,000g离心40min，重复2次，收集滤管中的酶液，对该酶溶液进行SDS-PAGE，结果如图1所示，可以看出，通过融合His标签，得到了经纯化的L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体。
实施例4 对L-脯氨酸4-羟化酶及L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体的酶学性质进行比较
L-脯氨酸4-羟化酶及L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体的反应动力学是通过测定不同的底物浓度下C-HisP4H或C-HisP4H46催化脯氨酸转化成羟脯氨酸反应的初始速率得到。将通过预实验确定的L-脯氨酸4-羟化酶及L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体活性反应体系最适抗坏血酸、FeSO4、L-脯氨酸、2-酮戊二酸浓度和MES缓冲液用于下述动力学检测。其中，预实验测定了反应时间为1～30min内的反应速率，发现前10min反应速率基本不变，为了便于检测后续采用前10min的反应时间进行下述动力学检测。
L-脯氨酸4-羟化酶动力学参数的测定方法：在1.5mlEP管中加入111mM的MES-Tris缓冲液(pH6.5)，复温到35℃后，迅速加入60mg的L-脯氨酸4-羟化酶纯酶、1mM的抗坏血酸、1mMFeSO4。测定L-脯氨酸动力学参数时加入24mM的2-酮戊二酸，和不同浓度的L-脯氨酸(L-脯氨酸浓度分别是：0.375mM、0.75mM、1.5mM、3mM、6mM、12mM、24mM)；测定2-酮戊二酸动力学参数时加入24mM的L-Pro，和不同浓度的2-酮戊二酸(2-酮戊二酸浓度分别是：0.75mM、1.5mM、3mM、6mM、12mM)。其中L-脯氨酸最后加入起始反应，总反应体系是100μl。迅速置于Thermomixer compact(Eppendorf，Germany)中35℃、1200rpm摇动速度反应10分钟，马上放入100℃水浴加热2min使反应终止。反应液13000rpm离心5min，上清液用上述HPLC方法检测L-Hyp的含量。利用Microcal Origin软件(Microcal Software Inc.Northampton，MA)将所得的数据拟合双曲线(方程为y＝P1*x/(P2+x))，其中P1是最大反应速率Vmax，P2是米氏常数Km。催化常数Kcat的计算是基于L-脯氨酸4-羟化酶是亚基分子量为30kDa的单体蛋白所得，计算结果总结于表3中。
L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体的测定方法：与L-脯氨酸4-羟化酶测定方法不同的是加入92mg的L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体纯酶、8mM抗坏血酸、0.2mM的FeSO4。测定L-脯氨酸时加入6mM的2-酮戊二酸，和不同浓度的L-脯氨酸(L-脯氨酸浓度分别是：8mM、12mM、16mM、20mM、24mM)；测定2-酮戊二酸时加入24mML-脯氨酸，和不同浓度的2-酮戊二酸(2酮戊二酸浓度分别是：1mM、2mM、3mM、4mM、5mM)。其他检测和计算方法与L-脯氨酸4-羟化酶的相同，计算结果总结于表3中。
利用L-脯氨酸为原料在P4H催化下生产L-Hyp的反应式如下：
(其中，L-Pro表示L-脯氨酸，2OG表示2-酮戊二酸，succinate表示琥珀酸)
脯氨酸羟化酶属于依赖2-酮戊二酸的非血红素Fe(Ⅱ)依赖性双加氧酶。P4H催化L-脯氨酸反式4-位羟基化。2-酮戊二酸是L-脯氨酸羟化反应的共同底物，经过氧化性脱羧形成琥珀酸。在整细胞催化产生L-Hyp的反应中L-脯氨酸一般是外源加入，保证足量供给。2-酮戊二酸是脯氨酸羟化酶催化L-脯氨酸羟化生成L-Hyp所必需的，整细胞催化生产L-Hyp一般是利用菌体代谢葡萄糖产生的2-酮戊二酸(参见TAKESHI SHIBASAKI H M,AKIO OZAKI 2000.Enzymatic production of trans-4-hydroxy-L-proline by regio-and stereospecific hydroxylation of L-proline.Biosci.Biotechnol.Biochem.[J],64(4):746-750)。本发明人在研究的过程中曾尝试在反应体系中外添加2-酮戊二酸来增加L-Hyp的产量，但2-酮戊二酸非常不稳定，其次是2-酮戊二酸随着浓度的升高会抑制酶活性，因此通过外加2-酮戊二酸来提高L-Hyp的产量基本上是不可行的，因此2-酮戊二酸的供给只能是依靠菌体自身代谢产生。根据文献记载的数据可以知道，大肠杆菌代谢葡萄糖时胞内2-酮戊二酸浓度为121μM(参见ZIMMERMANN M,SAUER U,ZAMBONI N 2014.Quantification and mass isotopomer profiling of alpha-keto acids in central carbon metabolism.Anal Chem[J],86:3232-3237)，因此推测胞内2-酮戊二酸很可能是羟化反应的限制底物。
L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体的P4H46酶对2-酮戊二酸的Km下降，约为突变前的P4H的1/3，而对脯氨酸的Km值约为P4H酶的16倍。发酵生产L-Hyp的实验中表达P4H46的菌株的羟脯氨酸产量是表达P4H酶的菌株的3.38倍(见上表2)。这可能是因为2-酮戊二酸是大肠杆菌代谢葡萄糖产生的，如上所述根据报道大肠杆菌体内2-酮戊二酸浓度很低(约100μM)。由于脯氨酸是体外添加的(培养基中添加了100mML-Pro)，因此脯氨酸是足量的，所以2-酮戊二酸是整个反应的限制因素。L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体的P4H46对2-酮戊二酸Km下降，即亲和力升高，所以能够在对L-脯氨酸Km值升高的情况下增加L-Hyp的产量。L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体的P4H46酶对2-酮戊二酸的Km是P4H的1/3，L-Hyp产量是P4H的3.375倍，说明虽然L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体对L-脯氨酸Km升高以及体外检测的酶活性下降，但因为L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体对2酮戊二酸的Km值降低导致L-脯氨酸4-羟化酶H91Q突变体菌株整细胞催化生产L-Hyp产量显著提高。所以在P4H酶整细胞催化或发酵转化生产L-Hyp时，产量提高的关键因素首先是P4H酶对2-酮戊二酸亲和力的增加，其次才是酶活性地增加。推测本发明得到的其他突变体也可能是由于相同的原因，对2-酮戊二酸亲和力增加，从而导致L-Hyp的产量显著提高。
表3.L-脯氨酸4-羟化酶的动力学参数(n＝3)
以上全面描述了本发明的优选实施例，但是可对它们进行各种替代和修改。因此，不应参照以上描述来决定本发明的范围，而是应参照所附权利要求书及其全部等同物来决定本发明的范围。任何特征，(不论是否为优选)均可与任何其他特征(不论是否为优选)相结合。本发明的权利要求书不应被理解为具有方法+功能的限制，除非在某一权利要求中通过术语“…的方法”明确地列举出此类限制。将本文中出现的参考文献并入作为参考。
在本文中列举的数值范围应当认为是包括该数值范围的端点，以及数值范围中任意两点之间的数值范围，例如范围为1～100的情况下，还包括任何1～100中两点之间的范围，例如5～20，10～80等。
在本发明中，采用的词语“不定冠词(a)或(an)”既包括单数又包括复数。相反，任何提到复数的物品在适当的情况下应包括单数。
从前面将观察到可以完成许多修改和变化而不脱离本发明的新颖概念的真实精神和范围。应理解预期或应该推断关于所示的特定实施方式或实施例没有限制。本发明旨在由所附的权利要求覆盖落入权利要求范围内的所有这些修改。
序列表
SEQ ID No：1来源于Dactylosporangium sp.RH1的L-脯氨酸4-羟化酶基因p4h序列：
SEQ ID No:2：经密码子优化的L-脯氨酸4-羟化酶基因op4h序列：
SEQ ID No：3：来源于Dactylosporangium sp.RH1的L-脯氨酸4-羟化酶P4H原始蛋白质序列：
该蛋白质的三字母的序列如下：
序列表
<110> 清华大学
<120> L-脯氨酸4-羟化酶
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 819
<212> DNA
<213> Dactylosporangium sp.RH1(指孢囊菌RH1)
<400> 1
ATGCTGACCC CGACGGAGCT CAAGCAGTAC CGCGAGGCGG GCTATCTGCT 1
CATCGAGGAC GGCCTCGGCC CGCGGGAGGT CGACTGCCTG CGCCGGGCGG 51
CGGCGGCCCT CTACGCGCAG GACTCGCCGG ACCGCACGCT GGAGAAGGAC 101
GGCCGCACCG TGCGCGCGGT CCACGGCTGC CACCGGCGCG ACCCGGTCTG 151
CCGCGACCTG GTCCGCCACC CGCGCCTGCT GGGCCCGGCG ATGCAGATCC 201
TGTCCGGCGA CGTGTACGTC CACCAGTTCA AGATCAACGC GAAGGCCCCG 251
ATGACCGGCG ATGTCTGGCC GTGGCACCAG GACTACATCT TCTGGGCCCG 301
AGAGGACGGC ATGGACCGTC CGCACGTGGT CAACGTCGCG GTCCTGCTCG 351
ACGAGGCCAC CCACCTCAAC GGGCCGCTGT TGTTCGTGCC GGGCACCCAC 401
GAGCTGGGCC TCATCGACGT GGAGCGCCGC GCGCCGGCCG GCGACGGCGA 451
CGCGCAGTGG CTGCCGCAGC TCAGCGCCGA CCTCGACTAC GCCATCGACG 501
CCGACCTGCT GGCCCGGCTG ACGGCCGGGC GGGGCATCGA GTCGGCCACC 551
GGCCCGGCGG GCTCGATCCT GCTGTTCGAC TCCCGGATCG TGCACGGCTC 601
GGGCACGAAC ATGTCGCCGC ACCCGCGCGG CGTCGTCCTG GTCACCTACA 651
ACCGCACCGA CAACGCCCTG CCGGCGCAGG CCGCTCCGCG CCCGGAGTTC 701
CTGGCCGCCC GCGACGCCAC CCCGCTGGTG CCGCTGCCCG CGGGCTTCGC 751
GCTGGCCCAG CCCGTCTAG 801
<210> 2
<211> 819
<212> DNA
<213> Dactylosporangium sp.RH1(指孢囊菌RH1)
<400> 2
ATGCTGACCC CGACCGAACT GAAACAATAC CGCGAAGCTG GCTATCTGCT 1
GATTGAGGAC GGTCTGGGTC CTCGTGAGGT TGATTGCCTG CGTCGTGCAG 51
CGGCAGCGCT GTATGCCCAA GACAGCCCGG ACCGTACGCT GGAGAAGGAC 101
GGCCGCACTG TACGTGCGGT TCATGGCTGT CACCGTCGCG ACCCGGTGTG 151
CCGCGATTTG GTTCGCCACC CGCGCTTGCT GGGTCCAGCG ATGCAAATCC 201
TGTCCGGCGA TGTGTACGTC CATCAGTTCA AGATTAACGC GAAAGCGCCG 251
ATGACGGGTG ACGTCTGGCC GTGGCATCAG GATTACATCT TCTGGGCCCG 301
TGAAGATGGT ATGGACCGTC CGCATGTCGT GAATGTGGCA GTGCTGCTGG 351
ACGAGGCGAC CCACCTGAAC GGCCCGTTGC TGTTCGTGCC GGGTACCCAC 401
GAACTGGGCC TGATTGATGT TGAGCGCCGT GCACCGGCAG GCGATGGTGA 451
CGCCCAATGG CTGCCGCAGC TGAGCGCGGA TTTGGATTAC GCCATCGATG 501
CGGACTTGCT GGCCCGTCTG ACCGCTGGTC GTGGCATCGA GTCTGCTACG 551
GGTCCTGCGG GTAGCATTCT GCTGTTTGAT AGCCGCATCG TCCACGGTAG 601
CGGTACCAAT ATGAGCCCGC ACCCGCGTGG TGTCGTTCTG GTTACCTATA 651
ACCGTACGGA CAATGCGTTG CCGGCTCAGG CCGCACCGCG TCCGGAATTT 701
CTGGCAGCGC GTGACGCGAC CCCACTGGTG CCGCTGCCAG CGGGCTTTGC 751
ACTGGCGCAG CCGGTTTAA 801
<210> 3
<211> 272
<212> L-脯氨酸4-羟化酶P4H蛋白质
<213> Dactylosporangium sp.RH1(指孢囊菌RH1)
<400> 1
Met Leu Thr Pro Thr Glu Leu Lys Gln Tyr Arg Glu Ala Gly Tyr Leu Leu Ile Glu Asp
5 10 15 20
Gly Leu Gly Pro Arg Glu Val Asp Cys Leu Arg Arg Ala Ala Ala Ala Leu Tyr Ala Gln
25 30 35 40
Asp Ser Pro Asp Arg Thr Leu Glu Lys Asp Gly Arg Thr Val Arg Ala Val His Gly Cys
45 50 55 60
His Arg Arg Asp Pro Val Cys Arg Asp Leu Val Arg His Pro Arg Leu Leu Gly Pro Ala
65 70 75 80
Met Gln Ile Leu Ser Gly Asp Val Tyr Val His Gln Phe Lys Ile Asn Ala Lys Ala Pro
85 90 95 100
Met Thr Gly Asp Val Trp Pro Trp His Gln Asp Tyr Ile Phe Trp Ala Arg Glu Asp Gly
105 110 115 120
Met Asp Arg Pro His Val Val Asn Val Ala Val Leu Leu Asp Glu Ala Thr His Leu Asn
125 130 135 140
Gly Pro Leu Leu Phe Val Pro Gly Thr His Glu Leu Gly Leu Ile Asp Val Glu Arg Arg
145 150 155 160
Ala Pro Ala Gly Asp Gly Asp Ala Gln Trp Leu Pro Gln Leu Ser Ala Asp Leu Asp Tyr
165 170 175 180
Ala Ile Asp Ala Asp Leu Leu Ala Arg Leu Thr Ala Gly Arg Gly Ile Glu Ser Ala Thr
185 190 195 200
Gly Pro Ala Gly Ser Ile Leu Leu Phe Asp Ser Arg Ile Val His Gly Ser Gly Thr Asn
205 210 215 220
Met Ser Pro His Pro Arg Gly Val Val Leu Val Thr Tyr Asn Arg Thr Asp Asn Ala Leu
225 230 235 240
Pro Ala Gln Ala Ala Pro Arg Pro Glu Phe Leu Ala Ala Arg Asp Ala Thr Pro Leu Val
245 250 255 260
Pro Leu Pro Ala Gly Phe Ala Leu Ala Gln Pro Val
265 270