本发明涉及细胞培养基领域，具体涉及一种无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基。
背景技术：
Sf-9细胞和HighFive细胞，是杆状病毒表达系统的宿主细胞。在应用于蛋白的表达与制备纯化中，有着许多的优点，包括：表达的重组蛋白能正确折叠，并形成二硫键；翻译后可进行修饰加工如糖基化、磷酸化、酰胺化及信号肽切割等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；与其他真核表达系统相比，杆状病毒表达系统可以高效表达外源基因，表达量最高可达被感染昆虫细胞总蛋白量的50％；可以容纳大片段外源基因。
目前，国内的生产工艺多采用Grace培养基或者IPL-41培养基添加5-10％的小牛血清培养，或者用商业化无血清培养基如SF900II再添加适当血清培养。很多商品号称是无血清培养基，但是，很难做到完全脱离血清培养。另外，由于目前国内血清供应日益紧张伴随着价格不断走高，对国内生物抗体生产企业产生了明显的限制。此外，从生产的角度来讲，血清中含有大量成分复杂的蛋白质，这极不利于疫苗、类病毒颗粒、细胞因子和单克隆抗体等生物制品的下游纯化分离，同时血清所含的化学成分不确定，血清也存在批次稳定性问题，而且还容易引起细菌、真菌、病毒和支原体污染。因此，尽量不用或少用血清成为昆虫细胞培养的趋势，现有技术常通过添加牛血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素等动物源成分，来降低血清的添加量，但是动物源成分的蛋白质对生物制品(如疫苗)的安全性有很大影响，所以迫切需要一种能代替血清功能的细胞培养添加物。既能够使细胞快速生长，保持较高的活力，又减少了污染的可能，提高细胞产品的稳定性，同时减少动物来源的蛋白组分含量，利于后期纯化工艺，降低生产成本。
目前，巴斯福股份公司申请的中国专利申请(公开号CN1498267A)，其所生产的培养基为液体培养基，对于运输和放菌要求极高，并且价格昂贵，不适合我国的目前的培养基发展状况。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供了一种无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基。本发明无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基既能够使细胞快速生长，保持较高的活力，又减少了污染的可能，提高细胞产品的稳定性，同时减少动物来源的蛋白组分含量，利于后期纯化工艺，降低生产成本。
本发明无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基通过以下技术方案实现：
一种无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基，主要由以下组分及其浓度组成：基础培养基6-8g/L，葡萄糖6.5-8g/L，无机盐0.7-1.5g/L，维生素4-9g/L，L-精氨酸4-6mM，L-天冬酰胺3-5mM，L-甘氨酸7-10mM，L-组氨酸1.5-3mM，L-异亮氨酸8.5-9mM，L-亮氨酸7-9mM，L-赖氨酸4-9mM，L-蛋氨酸0.35-0.54mM，L-苏氨酸4.5-7.5mM，L-色氨酸0.69-1.2mM，L-结氨酸2.87-4.32mM，L-脯氨酸7.38-8.42mM，L-谷氨酰胺7-14.5g/L，酵母提取物10-50g/L，重组胰岛素2-25mg/L，苹果酸0.4-1.8g/L，延胡索酸0.1-0.8g/L，胆固醇1-20mg/L，亚油酸1-10mg/L，大豆磷脂0.1-20g/L，腐胺0.1-10g/L，谷胱甘肽0.3-0.6g/L，甘油0.1-1g/L和果聚糖4-7.5g/L。
优选地，所述维生素包括生物素0.15-2.75mg/L，维生素B120.3-0.42mg/L，核黄素1.5-2.3mg/L，对氨基苯甲酸0.21-0.42mg/L，泛酸7-8mg/L，维生素B10.69-0.74mg/L，叶酸0.2-0.3mg/L和氯化胆碱16-18mg/L。
优选地，所述无机盐由：氯化钠20-23mM，磷酸二氢钠10-12mM，柠檬酸钠5-7mM，亚硒酸钠12-15mM，氯化钾5-8mM，硫酸钾4-6mM，氯化铝1-3.5mM，硫酸锌10-20mM，四水氯化锰1-5mM，钼酸铵0.3-0.7mM组成。
优选地，所述无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：基础培养基7.5g/L，葡萄糖7.2g/L，氯化钠21.5mM，磷酸二氢钠11mM，柠檬酸钠5.5mM，亚硒酸钠13.5mM，氯化钾6mM，硫酸钾5.23mM，氯化铝2.75mM，硫酸锌14.5mM，四水氯化锰3.2mM，钼酸铵0.67mM，生物素1.75mg/L、维生素B120.38mg/L，核黄素1.82mg/L，对氨基苯甲酸0.35mg/L，泛酸7.6mg/L，维生素B10.71mg/L，叶酸0.27mg/L，氯化胆碱17mg/L，L-精氨酸5.6mM，L-天冬酰胺4.75mM，L-甘氨酸8.2mM，L-组氨酸2.45mM，L-异亮氨酸8.65mM，L-亮氨酸7.68mM，L-赖氨酸8.15mM，L-蛋氨酸0.49mM，L-苏氨酸7.2mM，L-色氨酸1.14mM，L-结氨酸3.32mM，L-脯氨酸8.12mM，L-谷氨酰胺13.75g/L，酵母提取物45g/L，重组胰岛素16mg/L，胆固醇8.5mg/L，亚油酸7.5mg/L，大豆磷脂11g/L，腐胺7.3g/L，谷胱甘肽0.45g/L，甘油0.79g/L和果聚糖5.45g/L。
优选地，所述培养基中基础培养为Grace或IPL-41培养基。
糖类是大部分昆虫细胞首要的能源和碳源，葡萄糖是昆虫细胞的主要代谢能源；果聚糖(fructan)是果糖基转移酶催化的由蔗糖与一个或多个果糖分子连接而成的水溶性和黏性的高分子多糖，具有多种生理功能和生物活性。本发明将果聚糖用于昆虫细胞培养基中，可以起到维持昆虫细胞渗透压的作用。
氨基酸是细胞生长所需的另一类重要物质，其中有14种必需氨基酸，细胞本身不能合成，必须由培养基提供。非必需氨基酸有谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等，其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质的重要材料，缺少谷氨酰胺会影响到细胞的生长速度，几乎所有的昆虫细胞对谷氨酰胺都有较高的要求。本发明根据昆虫细胞生长的特性，筛选了上述氨基酸种类，并且在限定的氨基酸范围内更有利于昆虫细胞的生长。
昆虫细胞要在较高的渗透压中生长，一般为340mOsm/kg～390mOsm/kg，因而昆虫细胞培养基中无机盐浓度略高，并且各无机盐离子之间需要平衡，其中Na+/K+比例在某些细胞系中有严格的要求。本发明培养基中钠离子浓度为79mM-100mM，钾离子浓度为13mM-20mM，为昆虫细胞提供了适宜的渗透压，并且本发明技术人员意外地发现，重组蛋白在此浓度范围内能够大量表达。
在有机酸中，苹果酸、延胡索酸的联合使用，能够促进昆虫细胞的生长和重组蛋白的表达。
维生素是维持细胞生长的一种重要生物活性物质，在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对促进昆虫细胞生长、促进细胞贴附有积极作用。
与现有技术相比，本发明至少具有如下优点：该昆虫细胞无血清无蛋白添加培养基能促进细胞快速生长，增加细胞密度，缩短倍增时间，提高细胞活力；并且本发明培养基组分简单明确，易于制备，成本低廉，适用于昆虫细胞的大规模培养和重组蛋白的表达。
附图说明
图1不同培养基中重组蛋白含量。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
Grace培养基购于Gibco，IPL-41购于Hyclone；酵母提取物CAS号：8013-01-2，购于上海甘源实业有限公司。
实施例1一种无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基
一种无血清无动物源添加物的昆虫培养基，由以下成分及其浓度组成：Grace培养基7.5g/L，葡萄糖7.2g/L，氯化钠21.5mM，磷酸二氢钠11mM，柠檬酸钠5.5mM，亚硒酸钠13.5mM，氯化钾6mM，硫酸钾5.23mM，氯化铝2.75mM，硫酸锌14.5mM，四水氯化锰3.2mM，钼酸铵0.67mM，生物素1.75mg/L、维生素B120.38mg/L，核黄素1.82mg/L，对氨基苯甲酸0.35mg/L，泛酸7.6mg/L，维生素B10.71mg/L，叶酸0.27mg/L，氯化胆碱17mg/L，L-精氨酸5.6mM，L-天冬酰胺4.75mM，L-甘氨酸8.2mM，L-组氨酸2.45mM，L-异亮氨酸8.65mM，L-亮氨酸7.68mM，L-赖氨酸8.15mM，L-蛋氨酸0.49mM，L-苏氨酸7.2mM，L-色氨酸1.14mM，L-结氨酸3.32mM，L-脯氨酸8.12mM，L-谷氨酰胺13.75g/L，酵母提取物45g/L，重组胰岛素16mg/L，胆固醇8.5mg/L，亚油酸7.5mg/L，大豆磷脂11g/L，腐胺7.3g/L，谷胱甘肽0.45g/L，甘油0.79g/L和果聚糖5.45g/L，。
一种无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基制备方法：
(1)将Grace培养基用900mL超纯水轻微搅拌溶解，得溶液I；
(2)将上述组分依次加入到溶液I中，轻微搅拌溶解，并用超纯水定容至1L，得溶液II；
(3)将溶液II用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至6.3，得溶液III；
(4)将溶液III用0.2μm滤膜正压过滤除菌，即得。
实施例2一种无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基
一种无血清无动物源添加物的昆虫培养基，由以下组分及其浓度组成：基础培养基6g/L，葡萄糖6.5g/L，氯化钠20mM，磷酸二氢钠10mM，柠檬酸钠5mM，亚硒酸钠12mM，氯化钾5mM，硫酸钾4mM，氯化铝1mM，硫酸锌10mM，四水氯化锰1mM，钼酸铵0.3mM，苹果酸0.4g/L，延胡索酸0.1g/L，生物素0.15mg/L，维生素B120.3mg/L，核黄素1.5mg/L，对氨基苯甲酸0.21mg/L，泛酸7mg/L，维生素B10.69mg/L，叶酸0.2mg/L，氯化胆碱16mg/L，L-精氨酸4mM，L-天冬酰胺3mM，L-甘氨酸7mM，L-组氨酸1.5mM，L-异亮氨酸8.5mM，L-亮氨酸7mM，L-赖氨酸4mM，L-蛋氨酸0.35mM，L-苏氨酸4.5mM，L-色氨酸0.69mM，L-结氨酸2.87mM，L-脯氨酸7.38mM，L-谷氨酰胺7g/L，酵母提取物10g/L，重组胰岛素2mg/L，胆固醇1mg/L，亚油酸1mg/L，大豆磷脂0.1g/L，腐胺0.1g/L，谷胱甘肽0.3g/L，甘油0.1g/L和果聚糖4g/L。
制备方法与实施例1类似。
实施例3一种无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基
一种无血清无动物源添加物的昆虫培养基，由以下组分及其浓度组成：基础培养基8g/L，葡萄糖8g/L，氯化钠23mM，磷酸二氢钠12mM，柠檬酸钠7mM，亚硒酸钠15mM，氯化钾8mM，硫酸钾6mM，氯化铝3.5mM，硫酸锌20mM，四水氯化锰5mM，钼酸铵0.7mM，苹果酸1.8g/L，延胡索酸0.8g/L，生物素2.75mg/L，维生素B120.42mg/L，核黄素2.3mg/L，对氨基苯甲酸0.42mg/L，泛酸8mg/L，维生素B10.74mg/L，叶酸0.3mg/L，氯化胆碱18mg/L，L-精氨酸6mM，L-天冬酰胺5mM，L-甘氨酸10mM，L-组氨酸3mM，L-异亮氨酸9mM，L-亮氨酸9mM，L-赖氨酸9mM，L-蛋氨酸0.54mM，L-苏氨酸7.5mM，L-色氨酸1.2mM，L-结氨酸4.32mM，L-脯氨酸8.42mM，L-谷氨酰胺14.5g/L，酵母提取物50g/L，重组胰岛素25mg/L，水解乳蛋白10g/L，胆固醇20ml/L，亚油酸10ml/L，大豆磷脂20g/L，腐胺10g/L，谷胱甘肽0.6g/L，甘油1g/L和果聚糖7.5g/L。
制备方法与实施例1类似。
对比例1一种无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基
一种无血清无动物源添加物的昆虫培养基，由以下成分及其浓度组成：基础培养基7.5g/L，葡萄糖7.2g/L，氯化钠21.5mM，磷酸二氢钠11mM，柠檬酸钠5.5mM，亚硒酸钠13.5mM，氯化钾6mM，硫酸钾5.23mM，氯化铝2.75mM，硫酸锌14.5mM，四水氯化锰3.2mM，钼酸铵0.67mM，生物素1.75mg/L、维生素B120.38mg/L，核黄素1.82mg/L，对氨基苯甲酸0.35mg/L，泛酸7.6mg/L，维生素B10.71mg/L，叶酸0.27mg/L，氯化胆碱17mg/L，L-精氨酸5.6mM，L-天冬酰胺4.75mM，L-甘氨酸8.2mM，L-组氨酸2.45mM，L-异亮氨酸8.65mM，L-亮氨酸7.68mM，L-赖氨酸8.15mM，L-蛋氨酸0.49mM，L-苏氨酸7.2mM，L-色氨酸1.14mM，L-结氨酸3.32mM，L-脯氨酸8.12mM，L-谷氨酰胺13.75g/L，酵母提取物45g/L，重组胰岛素16mg/L，胆固醇8.5mg/L，亚油酸7.5mg/L，大豆磷脂11g/L，腐胺7.3g/L，谷胱甘肽0.45g/L，甘油0.79g/L和果聚糖10g/L。
制备方法与实施例1类似。
与实施例1的区别在于，加入果聚糖的浓度增加。
对比例2一种无血清无动物源添加的昆虫细胞培养基
一种无血清无动物源添加物的昆虫培养基，由以下成分及其浓度组成：基础培养基7.5g/L，葡萄糖7.2g/L，磷酸二氢钠11mM，柠檬酸钠5.5mM，亚硒酸钠13.5mM，氯化钾27.5mM，硫酸钾5.23mM，氯化铝2.75mM，硫酸锌14.5mM，四水氯化锰3.2mM，钼酸铵0.67mM，生物素1.75mg/L、维生素B120.38mg/L，核黄素1.82mg/L，对氨基苯甲酸0.35mg/L，泛酸7.6mg/L，维生素B10.71mg/L，叶酸0.27mg/L，氯化胆碱17mg/L，L-精氨酸5.6mM，L-天冬酰胺4.75mM，L-甘氨酸8.2mM，L-组氨酸2.45mM，L-异亮氨酸8.65mM，L-亮氨酸7.68mM，L-赖氨酸8.15mM，L-蛋氨酸0.49mM，L-苏氨酸7.2mM，L-色氨酸1.14mM，L-结氨酸3.32mM，L-脯氨酸8.12mM，L-谷氨酰胺13.75g/L，酵母提取物45g/L，重组胰岛素16mg/L，胆固醇8.5mg/L，亚油酸7.5mg/L，大豆磷脂11g/L，腐胺7.3g/L，谷胱甘肽0.45g/L，甘油0.79g/L和果聚糖5.45g/L。
制备方法与实施例1类似。
与实施例1的区别在于，加入氯化钾代替氯化钠。
试验例一 昆虫细胞生长状况测定
1.试验对象：实施例1-3和对比例1制备得到的培养基
2.试验方法：
将High Five细胞均培养于27℃生化培养箱中，细胞分为五组，分别对应实施例1、2、3及对比例1、2制得的培养基。利MTT法测定细胞生长曲线：
(1)制备1mL细胞悬液。空白对照以1mL培养基代替细胞悬液。加入0.1mLMTT于37℃孵育4h，使MTT还原为蓝紫色甲月赞结晶。
(2)加1mL DTW脱色液，37℃至少静置30min(甚至过液)，使甲质颗粒充分溶解。
(3)吸取200μL该溶解液至96孔板孔中，在酶标仪上读取OD值，检测波长570nm，参考波长630nm。
(4)每隔24h测量一个点，每个点为3个平行样品的平均值。
3.试验结果：结果如表1所示，High Five细胞在实施例1培养基中，细胞倍增时间短，且细胞活力明显优于对比例培养基。
表1不同培养基培养的High Five细胞的细胞密度和细胞活力
以上结果表明，本发明培养基能促进细胞快速生长，增加细胞密度，缩短倍增时间，提高细胞活力。
实施例二 重组蛋白在不同培养基中昆虫细胞中的表达
分别取实施例1-3、对比例1-2制备得到的培养基置入1L摇瓶中悬浮培养Sf9细胞，并在细胞密度达到1.5×106细胞/毫升时接种病毒(重组病毒，表达相应外源蛋白)，培养72h，取细胞悬液进行ELISA蛋白定量检测，其结果如图1所示，实施例培养基蛋白表达量明显高于对比例，其中实施例1中重组蛋白表达量是对比例2的4倍。由此可知，本发明培养基能够促进重组蛋白的表达。