本发明属于工程菌领域，涉及污水治理方法，具体涉及一种用于降解污水中蛋白质和脂肪的混合菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
随着人口的增长、城镇化水平的迅速提升及人民生活生产方式的转变，生活污水的量不断增加，但公共环保设施严重滞后，造成大量的生活污水未经处理直接排入城市河流，严重污染了河流水体，造成河水有机污染不断加剧。城市生活污水的有机物主要有腐殖酸、蛋白质、脂类、糖类、氨基酸等，这些物质以悬浮或溶解状态存在于废水中，在微生物的作用下可以分解为简单的CO2等有机物，这些有机物在天然水体中分解时需要消耗水中的溶解氧，因而称为耗氧有机物。含有这些物质的废水一旦进入水体会引起溶解氧含量降低，进而导致水体发黑发臭。
在人口密集的商丘市，由于生活污水直排等原因，造成万堤沟和包河等河段经常发黑发臭，群众反响很大。目前，城市生活污水的污染控制和管理措施主要有物理、化学和生物生态方法。与常规物理化学方法相比，生物方法具有成本低、操作简便、技术清洁、无二次污染等优点，越来越成为治理污水的主力军。通常的水是由10个以上的水分子组成一个水分子团，叫大分子团水，例如雨水、湖水、自来水、纯净水、蒸馏水。小分子团水由5-8个水分子组成，在非常罕有的自然条件下形成，产地极少，目前仅冰川水符合小分子团水特性。冰川融水氘的含量低，而且经过岩层深层过滤，富含多种矿物质和微量元素、比例适中。这些小分子团水和低氘水的特性，使得冰川融水对生命体的各种营养生理功能很强，对新陈代谢、细胞繁衍有积极的作用。玉龙雪山是全球最优质的水源地。本发明选用该地的冰川融水。
技术实现要素：
本发明为解决污水治理过程中蛋白质和脂肪难降解的技术难题，公开了一种用于降解污水中蛋白质和脂肪的混合菌剂。
为解决上述技术难题，本发明采用以下技术方案：
一种用于降解污水中蛋白质和脂肪的混合菌剂，所述混合菌剂含有嗜冷芽孢杆菌、解脂假丝酵母、近平滑假丝酵母、淀粉芽孢杆菌及恶臭假单胞菌，其中淀粉芽孢杆菌：嗜冷芽孢杆菌：恶臭假单胞菌：解脂假丝酵母：近平滑假丝酵母的活菌数添加比例为2:2:2:（2-4.5）:（2-4.5）。
所述混合菌剂中，淀粉芽孢杆菌：嗜冷芽孢杆菌：恶臭假单胞菌：解脂假丝酵母：近平滑假丝酵母的活菌数添加比例为2:2:2:3:3或2:2:2:4.5:4.5。
用于降解污水中蛋白质和脂肪的混合菌剂的制备方法，步骤如下：
a. 菌株的活化：在活化培养基上，分别接种保存的解脂假丝酵母、近平滑假丝酵母、淀粉芽孢杆菌及恶臭假单胞菌菌株，在25 ℃条件下培养2-3天，使菌株活化；在活化培养基上接种嗜冷芽孢杆菌在15 ℃条件下培养2-3天，使菌株活化；
b. 菌株的富集培养：将活化后的解脂假丝酵母、近平滑假丝酵母、淀粉芽孢杆菌及恶臭假单胞菌菌株，分别接种在富集培养基上，于25-30℃，150r/min的条件下振荡培养24 h，将活化后的嗜冷芽孢杆菌接种在富集培养基上，于10-20℃，150r/min的条件下振荡培养24 h，当五种菌液的OD值达到0.5-0.8，且五种菌株之间的OD值相差小于0.02时，停止振荡，完成菌株的富集培养；
c. 菌株的同步生长：取出五种菌株的富集培养基，置于4℃冰箱内过夜，使五种菌株达到同步生长；
d. 菌株的混合：将嗜冷芽孢杆菌、淀粉芽孢杆菌、恶臭假单胞菌的三株细菌菌液按比例混合，将解脂假丝酵母和近平滑假丝酵母两株酵母菌的菌液按比例混合，然后再将细菌混合菌液与酵母菌混合菌液按比例混合。
所述步骤a中活化培养基的配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂15-20 g/L，pH值为7.4。
所述步骤b中富集培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH值为7.4。
用于降解污水中蛋白质和脂肪的混合菌剂，作为治理污水污染的应用。
所述应用包括以下步骤：
a. 先把一定体积的污水分装到烧杯中，在紫外灯下照射0.5-1个小时；
b. 将混合菌剂与玉龙雪山冰川表层雪样的溶液按1:1的体积比混合，在25 ℃，150 r/min的摇床中振荡培养12-24h，完成降解污水中蛋白质和脂肪的应用。
所述步骤b中，污水：混合菌剂：玉龙雪山冰川融水的体积比为8:1:1。
本发明的有益效果在于：
1．本发明采用嗜冷芽孢杆菌、解脂假丝酵母、近平滑假丝酵母、恶臭假单胞菌和淀粉芽孢杆菌，将五株菌混合成高效菌群后，该系统中的混合菌群之间可以互利共存，相互促进，通过协同作用可以扩大微生物的功能广谱性。
2．玉龙雪山水资源丰富，具有小分子团水和低氘水的特性，富含多种比例适中的矿物质和微量元素，能激活生物体内各种酶活，增强微生物新陈代谢和细胞繁衍。从而有利于细菌更好地适应自然的水环境。而不至于在进入污染的水体后，因不适应导致无法存活。
3．通过优化它们的配比和投放量使混合菌群更具有功能多样和高效的独特优势，从而达到净化水质的目的。
具体实施方式
一种用于降解污水中蛋白质和脂肪的混合菌剂，所述混合菌剂含有嗜冷芽孢杆菌、解脂假丝酵母、近平滑假丝酵母、淀粉芽孢杆菌及恶臭假单胞菌，其中淀粉芽孢杆菌：嗜冷芽孢杆菌：恶臭假单胞菌：解脂假丝酵母：近平滑假丝酵母的活菌数添加比例为2:2:2:（2-4.5）:（2-4.5）。
所述混合菌剂中，淀粉芽孢杆菌：嗜冷芽孢杆菌：恶臭假单胞菌：解脂假丝酵母：近平滑假丝酵母的活菌数添加比例为2:2:2:3:3或2:2:2:4.5:4.5。
用于降解污水中蛋白质和脂肪的混合菌剂的制备方法，步骤如下：
a. 菌株的活化：在活化培养基上，分别接种保存的解脂假丝酵母、近平滑假丝酵母、淀粉芽孢杆菌及恶臭假单胞菌菌株，在25 ℃条件下培养2-3天，使菌株活化；在活化培养基上接种嗜冷芽孢杆菌在15 ℃条件下培养2-3天，使菌株活化；
b. 菌株的富集培养：将活化后的解脂假丝酵母、近平滑假丝酵母、淀粉芽孢杆菌及恶臭假单胞菌菌株，分别接种在富集培养基上，于25-30℃，150r/min的条件下振荡培养24 h，将活化后的嗜冷芽孢杆菌接种在富集培养基上，于10-20℃，150r/min的条件下振荡培养24 h，当五种菌液的OD值达到0.5-0.8，且五种菌株之间的OD值相差小于0.02时，停止振荡，完成菌株的富集培养；
c. 菌株的同步生长：取出五种菌株的富集培养基，置于4℃冰箱内过夜，使五种菌株达到同步生长；
d. 菌株的混合：将嗜冷芽孢杆菌、淀粉芽孢杆菌、恶臭假单胞菌的三株细菌菌液按比例混合，将解脂假丝酵母和近平滑假丝酵母两株酵母菌的菌液按比例混合，然后再将细菌混合菌液与酵母菌混合菌液按比例混合。
所述步骤a中活化培养基的配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂15-20 g/L，pH值为7.4。
所述步骤b中富集培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH值为7.4。
用于降解污水中蛋白质和脂肪的混合菌剂，作为治理污水污染的应用。
所述应用包括以下步骤：
a. 先把一定体积的污水分装到烧杯中，在紫外灯下照射0.5-1个小时；
b. 将混合菌剂与玉龙雪山冰川表层雪样的溶液按1:1的体积比混合，在25 ℃，150 r/min的摇床中振荡培养12-24h，完成降解污水中蛋白质和脂肪的应用。
所述步骤b中，污水：混合菌剂：玉龙雪山冰川融水的体积比为8:1:1。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述：
1 材料和方法
1.1 菌种
淀粉芽孢杆菌（GIM1.403）：产α-淀粉酶、蛋白酶；
嗜冷芽孢杆菌（GIM 1.494）：产冷激蛋白；
解脂假丝酵母（GIM2.187）：产脂肪酶；
近平滑假丝酵母（GIM2.190）：产脂肪酶；
恶臭假单胞菌（GIM1.445）：能降解多环芳烃的有机物。
上述菌株均购自广东省微生物研究所。
1.2 培养基
在最适培养基的选择上，本实验主要从三种培养基中进行筛选，通过培养24 h以后在600 nm下测定菌株的长势来确定最适培养基。三种培养基分别是PDA培养基（马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH），改良的LB培养基（胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl10 g/L pH7.4）和细菌基本培养基（牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L pH 7.2-7.4）。
原来的LB培养基的成分是胰蛋白胨10 g/L，酵母膏10 g/L，NaCl 5 g/L。在相同的条件下，把这几种菌在这两种LB培养基中培养，在原来的LB培养基中，经过2-3天才有少部分菌株长出。在改良的LB培养基中，隔一天就有大量的菌株长出。经过预实验，排除了原来的LB培养基。最适培养基从上述的三种培养基中选择。在相同条件下，把这几种菌在以上三种培养基中培养，24 h之后，以改良的LB培养基为对照，测定这五种菌液在600 nm下的吸光值。
表1 五种菌在三种培养基中生长24h之后在600nm下测定的OD值
由表中可以看出这五种菌在改良的LB培养基中长势最好，为了实验的准确性和可操作性，本实验最终采用改良的LB培养基作为统一的培养基。
1.2.1固体LB活化培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂15-20 g/L，pH值为7.4。
1.2.2液体LB富集培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH值为7.4。
1.3污水
取自商丘市金桥路、胜利路、民主路、文化路、青年路、南京路路段的生活污水，取样时间是2011年4月28日。
1.4 方法
1.4.1 菌株的活化
配制斜面培养基接种在安培管保存的菌株，在25℃下培养解脂假丝酵母、近平滑假丝酵母、淀粉芽孢杆菌及恶臭假单胞菌2-3天，15℃下培养嗜冷芽孢杆菌5-7天，使菌株恢复活性。
1.4.2 菌株的富集培养及混合
将活化后的菌株，分别接种在富集培养基上，于25-30℃，150r/min的条件下振荡培养24 h，将活化后的嗜冷芽孢杆菌接种在富集培养基上，于10-20℃，150r/min的条件下振荡培养24 h，当五种菌液的OD值达到0.5-0.8，且五种菌株之间的OD值相差小于0.02时，停止振荡，完成菌株的富集培养；
取出五种菌株的富集培养基，置于4℃冰箱内过夜，使五种菌株达到同步生长；将嗜冷芽孢杆菌、淀粉芽孢杆菌、恶臭假单胞菌的三株细菌菌液等体积混合，将解脂假丝酵母和近平滑假丝酵母两株酵母菌的菌液等体积混合，然后再将细菌混合菌液与酵母菌混合菌液按1：1或2：3的比例混合。
1.4.3 各种水质检测方法
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量:考马斯亮蓝G-250是蛋白质染料，在酸性溶液中为褐色，当它与蛋白质通过范德华力结合后，变为蓝色，且在一定的蛋白质浓度范围内混合比尔定律，在595 nm波长处有最大吸收峰，可用于蛋白质的定量测定。此法不受酚类、游离氨基酸和小分子肽的影响。在0.01-0.1mg/mL蛋白质含量范围内均可使用。
测定方法
取3mL污水于离心管中，4000r/min，离心10 min后，取其中1.5 mL水样于试管中，加9 mL考马斯亮蓝G-250配制的考马斯亮蓝染液，摇匀，静置反应15 min，在595 nm下测定其吸光值。
紫外分光光度法测定生活污水中油类化合物：生活污水中含有大量油类化合物，主要成分是动、植物油。采用批样石油醚萃取制备油种，可准确测定生活污水中油类化合物。
测定方法:
取10 mL水样于离心管中，4000r/min，离心10min，将离心后的污水倒入250mL分液漏斗中，加0.2g NaCl，50 uL1+1（蒸馏水与纯硫酸的体积比为1:1）硫酸，10mL石油醚，摇匀3min，静置萃取油脂。待分层后，将水层移回试管，上层石油醚收集入50mL容量瓶中。再将回收的水层倒入分液漏斗中，加10mL石油醚再萃取一次，弃水层，回收石油醚层于50mL容量瓶中，用石油醚定容至50 mL标线，以石油醚作对照，测萃取过污水的石油醚在225nm处的吸光值，定量测定污水中的油脂。
1.4.4废水处理
投菌量为10%，考虑到通气的问题，本实验选取污水为240 mL装在500 mL的三角瓶里，混合菌液为30 mL。在投菌之前，先把污水分装到烧杯中，每个烧杯中240 mL，在紫外灯下照射半个小时杀死污水中的大量杂菌。这样有利于投入菌的成活。之后投混合菌剂及等体积的玉龙雪山冰川表层雪样的溶液各30 mL，并在25 ℃，150 r/min的摇床中振荡培养。每隔12 h测定一次污水中蛋白质的含量，每隔24 h测定一次污水中油脂的含量。
2 结果与分析
2.1混合菌群对污水中蛋白质的影响
表2 各路段水样中蛋白质处理结果
从上表可以看出：细菌混合菌与酵母混合菌的比例为1:1时，对胜利路、金桥路、南京路、民主路的蛋白质降解率低，而对青年路和文化路的蛋白质降解率高。但从最终的蛋白质浓度来看，还是当细菌混合菌与酵母混合菌的比例为1:1的处理效果好。
2.2混合菌群对污水中油脂的影响
由于金桥路、南京路和民主路未测出油脂含量，所以这部分内容只有胜利路、青年路和文化路三个位点的。
表3三个路段水样中油脂处理结果
从上表可以看出，两个比例混合菌对污水中油脂的降解效果普遍比较好，但是比例是2:3的对油脂的降解效果更好。文化路水样中油脂的降解率甚至达到了100%。一方面是因为污水中的油脂大多是植物或是动物的5-10个碳的轻质油，便于微生物降解；另一方面，在细菌混合菌与酵母菌混合菌的比例为2:3这个比例里，能分解油脂的酵母菌含量相对较多，分泌的脂肪酶也相对较多，对油脂的降解效果就比较好。
3 讨论与结论
本实验采用的菌株淀粉芽孢杆菌、嗜冷芽孢杆菌能产蛋白酶，解脂假丝酵母、近平滑假丝酵母能产脂肪酶，恶臭假单胞菌能降解多环芳香烃的有机物。将这五种菌按比例混合，通过菌群之间的相互协调作用，互利共生，成为能降解多种有机污染物的高效菌群，扩大了菌群的广谱性。而玉龙雪山的冰川水属于小分子团水和低氘水，又富含多种比例适中的矿物质和微量元素。对生命体的各种营养生理功能很强，从而促进微生物体内各种酶的活性，增强新陈代谢。这些特性有助于增加混合菌的适应能力，而不至于在进入污染的水体后，因不适应导致无法存活。将这混合菌群投入污水中可以降解水中的蛋白质和油脂。
本实验结果表明：配比为1:1的混合菌群对污水中的蛋白质处理效果最佳，但是配比为2:3的混合菌对污水中的油脂处理效果最好。南京路水样中蛋白质降解率最高，金桥路水样中蛋白质降解率最低，根据相关文献球蛋白酸性亚基的多肽链最容易被降解，所有的蛋白酶对其均有作用，而碱性亚基最难被水解。