本发明涉及一种富含虾青素及其酯的南极磷虾油脂的提取方法，属于食品和化工
技术领域：
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背景技术：
：南极磷虾(Euphausiasuperba)又名大磷虾或南极大磷虾，隶属节肢动物门、甲壳纲、磷虾目，是南大洋生态系统食物链中的关键物种，是地球上数量最大、繁衍最成功的单种生物资源之一。南极磷虾生物蕴藏量最新估计为3.42～5.36亿吨，年可持续捕捞量将近1亿吨，相当于目前全世界鱼类和其他水产捕获量的总和，世界各国都将南极磷虾作为重要的战略生物资源。南极磷虾油脂是大自然馈赠给人类的天然健康食品，含有其他食品不能替代的功效。临床证实，南极磷虾油脂具有降血脂、降血糖、降血压、穿越血脑屏障营养及活化脑部细胞和神经的作用，能够预防和治疗脑血管疾病，还可以起到抗菌消炎，预防癌症的发生发展，延缓衰老，调节内分泌等多重功效，因此，南极磷虾油脂在保健品和化妆品制造业都具有广阔的开发与利用前景。目前对于南极磷虾油脂提取的研究报道主要有：中国专利“从南极磷虾中提取高磷脂含量的南极磷虾油的方法”(CN102041166B)，其公开的提取方法为：先将南极磷虾在55～75℃条件下干燥制成含水8～10％的干虾，然后在25～55℃条件下用非极性有机溶剂反复萃取干虾中的油脂。但该提取方法需要在提取油脂前对南极磷虾进行干燥除水，不仅消耗大量的能量，而且加热过程中容易引起磷虾自溶，降低了油脂质量。中国专利“提取南极磷虾油脂及分离生物活性物质的方法”(CN102676291A)对于南极磷虾油脂的提取采用的是低温混合溶剂提取，将疏水性有机溶剂和亲水性有机溶剂按比例混合后直接加入到南极磷虾中进行搅拌提取。该方法的油脂得率和提取率比较高，但是，大量的(超过40％)虾青素仍存留在提取南极磷虾油脂的残渣中，需要再通过多相盐析萃取对留存的虾青素进行进一步的提取分离。技术实现要素：针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种富含虾青素及其酯的南极磷虾油脂的提取方法。本发明采用不同极性的混合有机溶剂从南极磷虾中提取得到油脂，油脂的提取率高，油脂中虾青素及其酯的含量也得到极大的提高。为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：本发明第一方面，提供一种富含虾青素及其酯的南极磷虾油脂的提取方法，步骤如下：取南极磷虾，将组织捣碎，加入乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂，搅拌提取，得提取液；过滤，收集滤液，浓缩，即得富含虾青素及其酯的南极磷虾油脂。上述提取方法中，所用到的南极磷虾为新捕捞的南极磷虾或经冷冻处理的南极磷虾。所述冷冻处理的温度为-45℃～-80℃；将南极磷虾在-45℃～-80℃条件下冷冻处理可以极大的减少南极磷虾虾青素被氧化的速度，进而提高提取得到的南极磷虾油脂中虾青素及其酯的含量。上述提取方法中，南极磷虾的组织捣碎处理，一方面可以增加样品的比表面积；另一方面有助于组织在搅拌下运动，增加溶剂与物料的接触机会，使样品与溶液充分混匀、充分提取。上述提取方法中，所述混合溶剂中，乙酸乙酯和甲醇的体积比为(0.8-1.2)：(1.8-2.2)。优选的，混合溶液中，乙酸乙酯和甲醇的体积比为1:2。上述提取方法中，混合溶剂与南极磷虾加入量的比为(8-12)ml：1g；优选为：10ml：1g。混合溶剂的加入量会直接影响南极磷虾油脂的提取效果，若混合溶剂的加入量过少，则会导致油脂溶解不完全，降低了南极磷虾油脂的提取率；若混合溶剂的加入量过多，则会造成提取溶剂的浪费，以及增加后续浓缩处理的时间，进而增加了南极磷虾油脂提取的成本。上述提取方法中，搅拌提取的温度为20-30℃，每次搅拌提取的时间为1-2h，重复提取2-4次；优选的，每次搅拌提取的时间为1h，重复提取2-3次。本发明对搅拌提取的次数和搅拌提取时混合溶剂的加入量进行了优化考察，结果发现，采用本发明的搅拌提取条件可以将南极磷虾中的油脂最大限度的提取出来，同时提取溶剂的使用量得到控制，降低了处理成本。上述提取方法中，浓缩处理的条件为：40-50℃下旋转蒸发至干。本发明第二方面，提供从上述南极磷虾油脂中分离制备虾青素一酯和虾青素二酯标准品的方法，其中，虾青素一酯标准品的制备步骤如下：(1)按上述方法提取南极磷虾油脂；(2)向南极磷虾油脂中加入丙酮，搅拌提取至滤渣无色，收集滤液合并，将溶液进行浓缩，得到深红色虾油；(3)将步骤(2)得到的虾油采用硅胶柱层析进行分离纯化，先用石油醚淋洗，然后改用乙酸乙酯-石油醚进行洗脱，逐渐从乙酸乙酯:石油醚＝10:1，9:1，8:1，7:1……，顺梯度淋洗直到1:1；将1:1梯度时接下来的粉红色条带进行浓缩，即得到虾青素一酯的标准品。虾青素二酯标准品的制备步骤如下：(a)按上述方法提取南极磷虾油脂；(b)向南极磷虾油脂中加入无水乙醇，搅拌提取至滤渣无色，收集滤液合并，将溶液进行浓缩，得到深红色虾油；(c)将步骤(b)得到的虾油采用硅胶柱层析进行分离纯化，先用石油醚淋洗，然后改用乙酸乙酯-石油醚进行洗脱，逐渐从乙酸乙酯:石油醚＝1:10，9:1，顺梯度淋洗直到1:1；将7:1梯度时接下来的深红色条带进行浓缩，即得到虾青素二酯的标准品。步骤(2)中，南极磷虾油脂与丙酮加入量的比为1g：4-6ml；优选为1g：5ml。步骤(3)中，淋洗用石油醚的量与虾油的体积比为120-180：1；步骤(3)中，每个梯度的乙酸乙酯-石油醚淋洗液的用量与虾油的体积比为480-520：1；优选为500：1。洗脱流速为1.2-1.4ml/min，优选为1.3ml/min。步骤(b)中，南极磷虾油脂与无水乙醇加入量的比为1g：7-9ml；优选为1g：8ml。步骤(c)中，淋洗用石油醚的量与虾油的体积比为120-180：1；每个梯度的乙酸乙酯-石油醚淋洗液的用量与虾油的体积比为480-520：1；优选为500：1。洗脱流速为1.2-1.4ml/min，优选为1.3ml/min。本发明第三方面，提供上述南极磷虾油脂中虾青素及其酯的检测方法，步骤如下：(1)按上述方法提取南极磷虾油脂；(2)将南极磷虾油脂用三氯甲烷溶解，制成样品溶液，将虾青素标准品和虾青素酯(虾青素一酯和虾青素二酯)标准品用三氯甲烷溶解，制成标准品溶液，以体积比为7：3的正己烷-丙酮混合溶液作为展开剂，进行高效薄层层析，并薄层扫描计算南极磷虾油脂中虾青素及其至酯的含量。步骤(2)中，薄层扫描的条件为：D2&W下扫描波长476nm，扫描狭缝6.00*0.90nm2,扫描速度40mm·s-1，分辨率100μm·step-1。本发明的有益效果：(1)本发明的提取对象为南极磷虾鲜虾(即新捕捞的南极磷虾)或经冷冻处理的南极磷虾，未经干燥处理，样品中含水量较多，若单采用疏水性溶剂或整体极性偏小的混合溶剂进行油脂提取时，容易出现乳化现象；若为避免出现乳化现象，而简单的增加混合溶剂中亲水性溶剂的比例，则可能会引入大量的水溶性杂质。因此，由于提取对象的特殊性，直接从南极磷虾鲜虾或经冷冻处理的南极磷虾中提取高虾青素及其酯含量的油脂，其对提取溶剂的要求更为严苛。本发明综合考虑虾青素及其酯的理化性能和结构特点，设计了多组不同溶剂组成的混合提取溶剂，结果发现不同组成的提取溶剂其提取效果差别较大，采用本发明的乙酸乙酯和甲醇混合溶剂进行提取，混合溶剂中乙酸乙酯和甲醇的体积比为(0.8-1.2):(1.8-2.2)，该体积比的混合溶剂从含水量较高的南极磷虾样品中将虾青素及其酯很好的溶解出来，不会出现乳化现象，而且溶解的杂质较少；与其他组成的提取溶剂相比，显著提高了南极磷虾油脂的得率，而且提取得到的南极磷虾油脂的虾青素及其酯的含量得到了极大的提升。(2)采用本发明的南极磷虾油脂提取工艺，其油脂得率高，油脂得率最高可达南极磷虾干重的23.2％；提取得到的南极磷虾油脂中，虾青素及其酯的含量得到了显著的提高。(3)本发明的南极磷虾油脂的提取工艺步骤简单，易于实现工业化生产，可以在工业化生产中可以将虾青素及其酯的提取效率发挥到更大程度。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述实施例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。下述实施例和对比例中所用到的南极磷虾均为在同一季节、同一海域捕获的南极磷虾，南极磷虾中的虾青素及其酯的含量无显著的差异，具有可比性。实施例1：南极磷虾油脂的提取具体步骤如下：(1)取少量-45℃冷冻保存的南极磷虾放在5％(质量分数)的盐水中解冻，解冻完全后取50g南极磷虾(干重为10g)，将组织捣碎；(2)按溶液与南极磷虾加入量的比为8：1(w：v，g:ml)向烧杯中加入乙酸乙酯和甲醇0.8：1.8(v：v)的混合溶液，搅拌提取1小时，并过滤，以同样的方法再将滤渣提取过滤1次，收集滤液，将2份滤液合并；(3)将收集的溶液，在40℃温度下旋转蒸发至干，得到南极磷虾油脂2.3112g，将其4℃遮光保存。实施例2：南极磷虾油脂的提取具体步骤如下：(1)取少量-80℃冷冻保存的南极磷虾放在5％(质量分数)的盐水中解冻，解冻完全后取50g南极磷虾(干重10g)，将组织捣碎；(2)按溶液与南极磷虾加入量的比为10：1(w：v，g:ml)向烧杯中加入乙酸乙酯和甲醇1.2:2.2(v：v)的混合溶液，搅拌提取1小时，并过滤，以同样的方法再将滤渣提取过滤2次，收集滤液，将3份滤液合并；(3)将收集的滤液，在40℃温度下旋转蒸发至干，得到南极磷虾油脂2.3104g，将其4℃遮光保存。实施例3：南极磷虾油脂的提取具体步骤如下：(1)取少量-80℃冷冻保存的南极磷虾放在5％(质量分数)的盐水中解冻，解冻完全后取50g南极磷虾(干重10g)，将组织捣碎；(2)按溶液与南极磷虾加入量的比为12：1(w：v)向烧杯中加入乙酸乙酯和甲醇1.2:2.2(v：v)的混合溶液，搅拌提取2小时，并过滤，以同样的方法再将滤渣提取过滤4次，收集滤液，将5份滤液合并；(3)收集下层清夜，在40℃温度下旋转蒸发至干，得到南极磷虾油脂2.3201g，将其4℃遮光保存。实施例4：虾青素一酯标准品和虾青素二酯标准品的制备1.虾青素一酯标准品的制备：(1)以料液比为1g：5ml向实施例1制备的南极磷虾油脂中加入丙酮，35℃下搅拌提取至滤渣无色，收集滤液合并，将溶液在35℃下进行旋蒸蒸发至干，得到深红色虾油；(2)将石油醚和活化后的柱层析硅胶(200-300目的GF254柱层析硅胶，活化条件为：110℃活化12h)混合，缓慢倒入清洗干净的3cm×30cm的玻璃硅胶柱，用石油醚淋洗，大约5h后，柱子中硅胶高度基本保持不变后待上样；(3)向硅胶柱中加入1ml步骤(1)制备的深红色虾油，上样过程要连续，切不可停顿，且上样时需将硅胶柱下口关闭，防止因淋洗液持续流出而导致样品在柱子顶端出现分层现象；样品加完后，开启硅胶柱下口的旋钮，继续用150ml的石油醚淋洗，而后逐渐从乙酸乙酯:石油醚＝10:1，9:1，8:1，7:1顺梯度淋洗直到1:1；每个梯度分别使用400ml淋洗液，流速约为1.3ml/min。将1:1梯度时接下来的粉红色条带在35℃下旋转蒸发至干，即得到虾青素一酯的标准品。经高效薄层层析检测，本实施例制备的虾青素一酯标准品的纯度达98.9％。2.虾青素二酯标准品的制备：(1)以料液比为1g：8ml向实施例1制备的南极磷虾油脂中加入无水乙醇，35℃下搅拌提取至滤渣无色，收集滤液合并，将溶液在35℃下进行旋蒸蒸发至干，得到深红色虾油；(2)将石油醚和活化后的柱层析硅胶(200-300目的GF254柱层析硅胶，活化条件为：110℃活化12h)混合，缓慢倒入清洗干净的3cm×30cm的玻璃硅胶柱，用石油醚淋洗，大约5h后，柱子中硅胶高度基本保持不变后待上样；(3)向硅胶柱中加入1ml步骤(1)制备的深红色虾油，上样过程要连续，切不可停顿，且上样时需将硅胶柱下口关闭，防止因淋洗液持续流出而导致样品在柱子顶端出现分层现象；样品加完后，开启硅胶柱下口的旋钮，继续用150ml的石油醚淋洗，而后逐渐从乙酸乙酯:石油醚＝10:1，9:1，8:1，7:1顺梯度淋洗直到1:1；每个梯度分别使用400ml淋洗液，流速约为1.3ml/min。将7:1梯度时接下来的粉红色条带在35℃下旋转蒸发至干，即得到虾青素二酯的标准品。经高效薄层层析检测，本实施例制备的虾青素二酯标准品的纯度达99.1％。实施例5：南极磷虾油脂中虾青素及其酯的检测：具体步骤如下：(1)准确称量实施例1-实施例3制备的南极磷虾油脂78.63mg溶于三氯甲烷中配成7.863mg/ml的溶液，混合均匀为待测样品溶液；准确称量虾青素标准品(德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度≥95％)1.29mg溶于三氯甲烷中配成0.03225mg/ml的标准溶液；准确称量虾青素一酯标准品溶于三氯甲烷配成0.03196mg/ml的标准溶液；准确称量虾青素二酯标准品溶于三氯甲烷配成0.03182mg/ml的标准溶液。虾青素一酯和虾青素二酯标准品为本发明实施例4制备。(2)精密吸取0.5μL、1μL、2μL、2.5μL、3μL、4μL、5μL标准溶液及10μL的待测样品溶液，点于同一块高效薄层硅胶板GF254(10cm*10cm)上，将展开剂正己烷和丙酮7:3(v：v)的混合溶液倒入双相玻璃展开缸预饱和30分钟，将高效薄层硅胶板上行8cm，取出板自然晾干，使用CAMAGTLCSCANNER3搭载软件为WINCATS1.4.1版本在波长476nm、扫描狭缝规格6.00*0.90nm2、扫描速度为40mm·s-1，数据分辨率100μm·step-1条件下进行薄层扫描峰面积积分值，分别以虾青素、虾青素一酯、虾青素二酯标准品的质量(ng)为横坐标(X)，峰面积积分值(AU)为纵坐标(Y)，得到回归方程；(3)根据回归方程计算实施例1-3制备的南极磷虾油脂中虾青素及其酯的含量，结果见表1。表1：不同实施例提取的南极磷虾油脂中游离虾青素、虾青素一酯和虾青素二酯的含量样品游离虾青素虾青素一酯虾青素二酯虾青素及其酯的总量实施例1274.8μg/g641.5μg/g1601.3μg/g5.819mg实施例2272.5μg/g640.8μg/g1603.4μg/g5.815mg实施例3273.9μg/g637.5μg/g1602.8μg/g5.833mg对比例1：在南极磷虾油脂提取的步骤(2)中，将乙酸乙酯和甲醇混合溶液替换为三氯甲烷和甲醇混合溶液(混合溶液中，三氯甲烷和甲醇的体积比为1:1)，其余操作同实施例1，经检测，提取得到的南极磷虾油脂为1.1286g。采用实施例5的方法对南极磷虾油脂中的虾青素及其酯(虾青素一酯和虾青素二酯)进行检测，结果为：提取得到的南极磷虾油脂中虾青素及其酯的总量为1.954mg。对比例2：在南极磷虾油脂提取的步骤(2)中，将乙酸乙酯和甲醇混合溶液替换为正己烷，其余操作同实施例1，经检测，提取得到的南极磷虾油脂为1.1984g。采用实施例5的方法对南极磷虾油脂中的虾青素及其酯(虾青素一酯和虾青素二酯)进行检测，结果为：提取得到的南极磷虾油脂中虾青素及其酯的总量为0.412mg。对比例3：在南极磷虾油脂提取的步骤(2)中，将乙酸乙酯和甲醇混合溶液替换为二氯甲烷和甲醇混合溶液(混合溶液中，二氯甲烷和甲醇的体积比为2:1)，其余操作同实施例1，经检测，提取得到的南极磷虾油脂为1.1389g。采用实施例5的方法对南极磷虾油脂中的虾青素及其酯(虾青素一酯和虾青素二酯)进行检测，结果为：提取得到的南极磷虾油脂中虾青素及其酯的总量为2.518mg。对比例4：在南极磷虾油脂提取的步骤(2)中，将乙酸乙酯和甲醇混合溶液中，二氯甲烷和甲醇和丙酮的体积比调整为2:1:1，其余操作同实施例1，经检测，提取得到的南极磷虾油脂为1.8453g。采用实施例5的方法对南极磷虾油脂中的虾青素及其酯(虾青素一酯和虾青素二酯)进行检测，结果为：提取得到的南极磷虾油脂中虾青素及其酯的总量为2.863mg。对比例5：采用正己烷和乙醇混合溶剂对南极磷虾中的油脂进行提取，步骤如下：取少量-45℃冷冻保存的南极磷虾放在5％(质量分数)的盐水中解冻，解冻完全后取50g南极磷虾(干重为10g)；加入150g质量比为10：1的正己烷/乙醇混合溶剂；在150转/分钟的转速下搅拌提取2小时，分离富含油脂的上相。提取过程中温度由开始的-20℃逐渐上升至20℃。在温度25～40℃，相对真空度为-0.07～-0.095Mpa条件下，减压蒸馏，蒸去溶剂，即可得到富含磷脂和多不饱和脂肪酸的南极磷虾粗油脂，同时回收溶剂，对所得到的南极磷粗虾油脂进行干燥和过滤，去除杂质，得到的南极磷虾油脂为1.3146g。采用实施例5的方法对南极磷虾油脂中的虾青素及其酯(虾青素一酯和虾青素二酯)进行检测，结果为：提取得到的南极磷虾油脂中虾青素及其酯的总量为1.835mg。对比例6：将对比例5中正己烷/乙醇混合溶剂的用量调整为500g，其余操作同对比例5，经检测，提取得到的南极磷虾油脂为1.5308g。采用实施例5的方法对南极磷虾油脂中的虾青素及其酯(虾青素一酯和虾青素二酯)进行检测，结果为：提取得到的南极磷虾油脂中虾青素及其酯的总量为2.0423mg。由上述对比例可以看出，在南极磷虾油脂提取过程中，替换不同的提取溶剂，则会直接影响南极磷虾油脂的提取率及油脂中虾青素及其酯的总含量，使提取的南极磷虾油脂和虾青素及其酯的总量明显下降。与对比例相比，采用本发明的提取方法，能够显著提高南极磷虾油脂的提取率和油脂中虾青素及其酯的总量。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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