一种深层液体发酵制备葡萄糖氧化酶酶制剂的方法及应用与流程

本发明涉及微生物技术领域，具体的涉及一种深层液体发酵制备葡萄糖氧化酶酶制剂的方法。

背景技术：

葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，god)系统名为β-d-葡萄糖氧化还原酶(ec1.1.3.4)。它能专一地将β-d-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢。该酶是一种用途广泛的食品添加剂，可以用于除去食品中的葡萄糖，从而防止食品发生褐变或获得纯度较高的低聚糖；利用葡萄糖氧化酶氧化蛋白质的巯基产生的二硫键来改善面团的烘焙性质，替代溴酸钾，用作一种更为安全的面粉改良剂；葡萄糖氧化酶因能去除食品包装中少量残留氧而使食品保质期延长，改善食品风味，如去除啤酒中溶解氧及瓶颈氧，从而防止啤酒老化,保持啤酒原有风味,延长保质期。在制药行业中可以用于制作血糖和尿糖试纸，用于快速检测葡萄糖的含量；在发酵工业中，葡萄糖氧化酶的催化产物为葡萄糖酸，可用于生产葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌等。另外，纺织业中还利用葡萄糖氧化酶生成的过氧化氢进行漂白。目前，葡萄糖氧化酶的制备方法中以微生物发酵法使用最为广泛。

天然god热稳定性较差，在加工和使用过程中容易受热失活。如何有效地解决god在高温工艺条件下酶活力的稳定问题，如何使含god的产品在生产工艺流程中不用顾忌高温是高效利用god的关键。利用生物工程生产新一代高稳定性、高耐热性的god是当前god开发最重要的途径。现有的葡萄糖氧化酶的制备方法生产效率不够高，成本较高，不利于工业化生产。

技术实现要素：

1.要解决的技术问题

本发明要解决的技术问题在于提供一种以嗜热拟青霉作为菌种的深层液体发酵制备葡萄糖氧化酶酶制剂的方法，其生产效率高，成本较低，有利于工业化生产；且该生产方法制备的葡萄糖氧化酶具有耐高温、耐酸、酶活性强、酶回收率高等优点。

2.技术方案

为解决上述问题，本发明采取如下技术方案：

一种深层液体发酵制备葡萄糖氧化酶酶制剂的方法，包括如下步骤：

a.发酵菌种的活化：将保藏号为cgmccno.13182的嗜热拟青霉xzpt6在pda培养基平板上划线活化，而后倒置于40～42℃恒温培养箱中24～48h进行活化培养；

b.制备嗜热拟青霉孢子悬液：从步骤a活化好的菌种中用接种环刮取嗜热拟青霉菌丝，转移至嗜热拟青霉孢子培养基上，置于37～40℃生化培养箱内培养，培养至菌丝长出孢子，经两次传代培养恢复其活力，以含有0.01％吐温80的无菌水多次洗涤、收集孢子，制备孢子含量为1.0×10⁸cfu/ml的孢子悬液，备用；

c.一级嗜热拟青霉种子液的制备：将步骤b中制备好的嗜热拟青霉孢子悬液按照5～6％(v/v)的接种量接入装有150～200ml种子培养基的1000ml锥形瓶中，37～42℃摇床培养32～48h，转速160～180r/min；

d.葡萄糖氧化酶的搅拌式发酵罐发酵：将8l发酵培养基装入15l的搅拌式发酵罐中，发酵罐夹套升温至95℃，再将蒸汽直接通入发酵培养基中，121℃灭菌30min，将温度逐渐降至40～45℃，将步骤c所得的种子液按照5～10％(v/v)的量接入发酵罐发酵培养基中，发酵罐压为0.05mpa；初始发酵0～48h，发酵控制条件为：37～45℃，发酵培养基初始ph5.5～6.0，初始通气量1.0～1.2l/min，搅拌转速260～280r/min；发酵2～4d，发酵温度降为35～40℃，无菌空气通气量1.5～1.7l/min，同时调整搅拌转速280～350r/min，调整通气量及搅拌转速保证溶解氧不低于35％，ph调节至6.0～6.5；发酵过程中定时补料添加补料培养基，发酵结束后，发酵液葡萄糖氧化酶活力达到278u/l；

e.葡萄糖氧化酶酶液的提纯和浓缩：发酵结束后，发酵液经4层纱布过滤，去除菌丝，收集滤液，滤液8000r/min、离心20min，弃去杂质等沉淀，保留上清；采用超滤膜过滤，第一次采用截留分子质量为120～150kda的超滤膜过滤，保留滤出液，第二次用20～30kda的超滤膜过滤，滤液浓缩3～5倍，保存截留液；粗酶液在50～60℃下旋转蒸发仪抽真空浓缩，进一步将酶液浓缩至原体积的10～20％；

f.葡萄糖氧化酶酶液的冷冻干燥：向浓缩后的粗酶液中加入保护剂：2～3wt％的糊精、1～3wt％的可溶性淀粉、0.1～0.2wt％的山梨酸钾；充分搅拌分散后，-20℃冷冻8～10h，真空度30～40pa、温度-35℃下，冷冻15～18h；粉碎，即得到葡萄糖氧化酶酶制剂。

进一步地，步骤a中pda培养基的制备方法为：分别取土豆浸出液100ml，无机盐液1ml，蔗糖2g，琼脂粉1.5g；在ph值为5.0～6.0，温度为121℃的环境中灭菌15min。

进一步地，步骤b中嗜热拟青霉孢子培养基的制备方法为：分别取土豆浸出液50ml，麸皮浸出液50ml，蔗糖1g，琼脂粉1.5g；在ph值为5.0～6.0，温度为121℃的环境中灭菌15min。

进一步地，步骤c中一级种子培养基的制备方法为：分别取麸皮粉5g，麦芽糖4g，蔗糖3g，蛋白胨5g，玉米浆10g，尿素2g，微量元素4～5ml，混合均匀，加去离子水至1000ml；在ph值为5.5，温度为121℃的环境中灭菌20min。

进一步地，步骤d中发酵罐发酵培养基的制备方法为：分别取麸皮粉8g，花生壳粉5g，豆饼粉12～15g，纤维素粉3～5g，玉米浆10～15g，蛋白胨5～10g，尿素3～4g，(nh4)2so43～5g，牛肉膏2～5g，nacl2～5g，kh2po40.5g，mgso4·7h2o0.04g、cacl20.3～0.5g，吐温202g，微量元素4～5ml，去离子水1000ml；在ph值为6.5～6.8，温度为121℃的环境中灭菌30min。

进一步地，步骤d发酵过程中的补料操作具体为：发酵48h后，开始添加补料培养基，补料体积每次50～100ml，共补料2～4次；补料培养基的制备方法为：分别取蔗糖200g，nh4no310g，麸皮浸出液700ml，去离子水补充至1000ml；在温度为121℃的环境中灭菌20min。

进一步地，所述土豆浸出液的制备方法为：土豆削皮、切成1cm³的小块，称取200g，加入1000ml水，煮沸30min，过滤，定容到1000ml。

进一步地，所述麸皮浸出液的制备方法为：50g麸皮加入300ml水，煮沸30min，过滤，定容到200ml。

3.有益效果

(1)本发明以嗜热拟青霉为菌种，菌种的培养需在高温环境中进行，且葡萄糖氧化酶的发酵培养基的酸性较强，故而制得的葡萄糖氧化酶具有耐高温、耐酸的性能，有效地解决了葡萄糖氧化酶在高温工艺条件下酶活力的稳定问题，使含有葡萄糖氧化酶的产品在生产工艺流程中不用顾忌高温，可实现葡萄糖氧化酶的高效利用。

(2)本发明的发酵过程采用了分阶段控制的搅拌式深层液体通风发酵罐发酵技术，发酵过程分两阶段控制，发酵过程中，添加的补料用补料培养基取代尿素溶液，不仅能提供氮源，还能提供碳源和生长因子，有助于促进酶的生产；根据菌种的生长特性以及产酶规律，调节发酵温度、通风量、搅拌转速、发酵液ph，并根据产酶速度和原料消耗情况合理补料，精确地控制通气、ph、温度等参数，方便地控制发酵产酶条件，有利于实现葡萄糖氧化酶的高效发酵生产，具有重要的应用前景。分阶段控制发酵参数及补料方法和发酵培养基的独特配方。

(3)本发明的具体步骤内容可体现出本制备方法具有发酵周期短的优点；发酵过程中，分阶段控制发酵参数、补料方法及发酵培养基的独特配方使得发酵液葡萄糖氧化酶活力达到278u/l，可体现制得的葡萄糖氧化酶具有活力较高的优点；酶制剂根据分子量的超滤浓缩技术提纯使酶制剂收率达到85％以上，体现制得的葡萄糖氧化酶具有酶回收率高的优点。

(4)本发明所用的各种培养基的配方所采用的原料多为廉价易得的农副产品，在满足各培养物的要求下，有利于降低成本。

(5)本发明发酵结束后的葡萄糖氧化酶粗酶液先经离心去杂质等沉淀，再经由两次超滤膜过滤，最后在50～60℃下旋转蒸发仪抽真空浓缩，达到提纯的目的；之后添加保护剂，再采用冷冻干燥技术使酶液固化，粉碎之后即得到葡萄糖氧化酶酶制剂。此提纯和干燥技术有利于本发明的工业化生产。

本发明所提供的生产方法的生产效率高，成本较低，有利于工业化生产；且该生产方法制备的葡萄糖氧化酶具有耐高温、耐酸、酶活性强、酶回收率高等优点。

附图说明

图1为实施例中葡萄糖氧化酶的最适作用温度折线图；

图2为实施例中葡萄糖氧化酶的最适作用ph值折线图；

图3为实施例中葡萄糖氧化酶的热稳定性折线图；

图4为实施例中葡萄糖氧化酶的ph稳定性折线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例

本实施例以嗜热拟青霉xzpt6作为菌种通过深层液体发酵制备葡萄糖氧化酶酶制剂，包括如下步骤：

a.发酵菌种的活化：将保藏号为cgmccno.13182的嗜热拟青霉xzpt6在pda培养基平板上划线活化，而后倒置于42℃恒温培养箱中35h进行活化培养；

b.制备嗜热拟青霉孢子悬液：从步骤a活化好的菌种中用接种环刮取嗜热拟青霉菌丝，转移至嗜热拟青霉孢子培养基上，置于40℃生化培养箱内培养，培养至菌丝长出孢子，经两次传代培养恢复其活力，以含有0.01％吐温80的无菌水多次洗涤、收集孢子，制备孢子含量为1.0×10⁸cfu/ml的孢子悬液，备用；

c.一级嗜热拟青霉种子液的制备：将步骤b中制备好的嗜热拟青霉孢子悬液按照5％(v/v)的接种量接入装有180ml种子培养基的1000ml锥形瓶中，40℃摇床培养40h，转速180r/min；

d.葡萄糖氧化酶的搅拌式发酵罐发酵：将8l发酵培养基装入15l的搅拌式发酵罐中，发酵罐夹套升温至95℃，再将蒸汽直接通入发酵培养基中，121℃灭菌30min，将温度逐渐降至42℃，将步骤c所得的种子液按照8％(v/v)的量接入发酵罐发酵培养基中，发酵罐压为0.05mpa；初始发酵24h，发酵控制条件为：40℃，发酵培养基初始ph5.7，初始通气量1.0l/min，搅拌转速260r/min；发酵3d，发酵温度降为37℃，无菌空气通气量1.6l/min，同时调整搅拌转速300r/min，调整通气量及搅拌转速保证溶解氧不低于35％，ph调节至6.3；发酵过程中定时补料添加补料培养基；发酵结束后，发酵液中葡萄糖氧化酶的酶活力为276u/ml。

e.葡萄糖氧化酶酶液的提纯和浓缩：发酵结束后，发酵液经4层纱布过滤，去除菌丝，收集滤液，滤液8000r/min、离心20min，弃去杂质等沉淀，保留上清；采用超滤膜过滤，第一次采用截留分子质量为130kda的超滤膜过滤，保留滤出液，第二次用25kda的超滤膜过滤，滤液浓缩4倍，保存截留液；粗酶液在55℃下旋转蒸发仪抽真空浓缩，进一步将酶液浓缩至原体积的15％；

f.葡萄糖氧化酶酶液的冷冻干燥：向浓缩后的粗酶液中加入保护剂：3wt％的糊精、2wt％的可溶性淀粉、0.2wt％的山梨酸钾；充分搅拌分散后，-20℃冷冻9h，真空度35pa、温度-35℃下，冷冻16h；粉碎，即得到葡萄糖氧化酶酶制剂。

利用本方法制备的酶制剂收获率达到85％以上。

在本实施例中，步骤a中pda培养基的制备方法为：分别取土豆浸出液100ml，无机盐液1ml，蔗糖2g，琼脂粉1.5g；在ph值为5.5，温度为121℃的环境中灭菌15min。

在本实施例中，步骤b中嗜热拟青霉孢子培养基的制备方法为：分别取土豆浸出液50ml，麸皮浸出液50ml，蔗糖1g，琼脂粉1.5g；在ph值为5.5，温度为121℃的环境中灭菌15min。

在本实施例中，步骤c中一级种子培养基的制备方法为：分别取麸皮粉5g，麦芽糖4g，蔗糖3g，蛋白胨5g，玉米浆10g，尿素2g，微量元素5ml，加去离子水至1000ml；在ph值为5.5，温度为121℃的环境中灭菌20min。

在本实施例中，步骤d中发酵罐发酵培养基的制备方法为：分别取麸皮粉8g，花生壳粉5g，豆饼粉13g，纤维素粉4g，玉米浆13g，蛋白胨8g，尿素3g，(nh4)2so44g，牛肉膏3g，nacl3g，kh2po40.5g，mgso4·7h2o0.04g、cacl20.4g，吐温202g，微量元素5ml，去离子水1000ml；在ph值为6.7，温度为121℃的环境中灭菌30min。

在本实施例中，步骤d发酵过程中的补料操作具体为：发酵48h后，开始添加补料培养基，补料体积每次50～100ml，共补料2～4次；补料培养基的制备方法为：分别取蔗糖200g，nh4no310g，麸皮浸出液700ml，去离子水补充至1000ml；在温度为121℃的环境中灭菌20min。

上述土豆浸出液的制备方法为：土豆削皮、切成1cm³的小块，称取200g，加入1000ml水，煮沸30min，过滤，定容到1000ml；上述麸皮浸出液的制备方法为：50g麸皮加入300ml水，煮沸30min，过滤，定容到200ml。

下面对本实施例中取得的葡萄糖氧化酶进行部分性能测定：

(1)酶反应最适温度测定

将发酵制备的酶制剂在不同的温度(35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃)下测定其葡萄糖氧化酶酶的活力(ph5.0)，并将最高的酶活力定义为100％，计算不同温度条件下葡萄糖氧化酶的活力。

结果如图1所示，葡萄糖氧化酶从35℃到65℃，随着温度升高酶活性逐渐增加，温度达到65℃时，酶活达到最大值。以后随着温度升高，酶活逐渐降低，故酶的葡萄糖氧化酶最适作用温度为65℃。整体看葡萄糖氧化酶是高温酶，在50℃～70℃之间酶的酶活都在80％以上，故在这个温度范围内酶制剂都会发挥高效的酶解作用。

(2)酶作用最适ph测定

将葡萄糖氧化酶酶液分别在不同的ph2.0、3.0、4.0、5.0、6.o、7.0、8.0、9.0)下测定其葡萄糖氧化酶酶活力。将最高的酶活力定义为100％，分别计算不同ph值条件下葡萄糖氧化酶的相对酶活。所用缓冲液为：ph2.0～3.0的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，ph3.0～4.0柠檬酸磷酸缓冲液，ph4.0～5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液，ph5.0～7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，ph7.0～9.0tris-hcl缓冲溶液。以酶在最适ph值下所测酶活为100％，其它ph值下所测为对其相对酶活。酶制剂在以上不同ph缓冲体系中，在65℃下测定葡萄糖氧化酶酶活性。

结果如图2所示，葡萄糖氧化酶在ph3.0～7.0之间酶活性在80％以上，最适作用ph为5.0。整体看酶制剂适合在酸性条件下酶解反应。

(3)酶的热稳定性实验

将葡萄糖氧化酶酶液，分别置于不同的温度条件下(60℃、65℃、67℃、70℃)保温不同的时间(ph＝4.5)，然后立即放置于4℃的环境中复性2h以上，再按标准的酶活测定方法测定其剩余酶活力。以未经保温失活处理的酶活力为100％，分别计算不同温度条件下葡萄糖氧化酶的相对剩余酶活。

结果如图3所示，酶基本随温度的上升以及热处理时间的延长酶活力逐渐降低，在温度高于75℃时，葡萄糖氧化酶酶活性下降显著。酶在75℃以下，保温时间3小时以内酶活保存率都在80％以上；65℃以下，热处理3小时剩余酶活都在90％以上。因此酶制剂的耐热性非常好，属于是耐高温型。

(4)ph值对酶稳定性的影响

另将葡萄糖氧化酶酶液分别置于不同的ph条件下(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)，分别于40℃保温24h，然后立即转移至ph为4.5、再测定其剩余酶活力。以酶在最稳定ph下所测酶活为100％，其它ph下所测为对其相对酶活。

结果如图4所示，40℃，ph2.0～8.0范围内24h葡萄糖氧化酶酶活性基本不发生变化，活性稳定，相对酶活均在80％以上。但在碱性条件下，酶活下降比较严重，ph8.0以后，随着ph增加，酶活逐渐降低。整体看酶制剂具有较广的酸碱稳定性，在酸性条件下性质更为稳定。

(5)酶制剂的保存时间对酶活性的影响

将制备好的固体酶制剂分别在4℃和室温下保存，每一个月检测一次酶活力，共检测6个月，查看酶活保留情况。结果如表1所示：

表1分别在4℃和室温下保存的葡萄糖氧化酶酶活保存率

在半年时间内，4℃下葡萄糖氧化酶酶活保存率都在90％以上，室温条件下酶活也在80％以上，可以看出酶的稳定性好。

由上述可知，本发明所得的酶制剂能达到以下指标：葡萄糖氧化酶酶活力574u/g；产品棕褐色固体粉末、可以溶于水、无异味；产品热稳定性好，35℃下，保存6个月后酶活力仍大于90％；酶催化活性强，最适作用温度在45℃～70℃之间；本产品最适作用ph值范围在4.5～7.0。

本发明生产的葡萄糖氧化酶耐热性好，即75℃下，保温3小时，残余酶活达85％；另外，发酵制备的葡萄糖氧化酶耐酸性强，在ph2.0～8.0范围内24h葡萄糖氧化酶酶活性基本不发生变化，活性稳定，相对酶活均在80％以上；发酵产量高，即发酵液酶活达278u/ml；酶回收率高，即总酶活回收率大于85％、酶冻干粉酶活力单位达到574u/g；能有效的降低生产成本；同时采用的提纯和干燥技术也有利于该生产方法的工业化生产。

本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求范围内。

应用例

下面探究葡萄糖氧化酶对蛋鸡生产性能的影响

选取体格健壮、体重相似、采食良好、产蛋性能相似的产蛋高峰期30周龄的海兰褐蛋鸡为试验蛋鸡，随机分为2组，每组设4个重复，每个重复为30只鸡；以玉米-豆粕一杂粕型日粮为基础日粮；其中对照组饲喂基础日粮，试验组是在基础日粮中添加葡萄糖氧化酶。添加方法为：将制备的葡萄糖氧化酶固态酶制剂以基础日粮为载体做成1％葡萄糖氧化酶预混剂，试验组为正常营养水平上添加0.5％的葡萄糖氧化酶酶制剂。试验鸡舍为上中下三层阶梯式舍饲笼养，自然通风，光照采用人工早晚补光，保证光照时间为16小时/天，光照强度10～15lx。每天喂料三次，仔细观察鸡群健康状况，认真作好试验记录。试验经一周的预试期进入正试期，试验期42天。在正试期中，记录产正常蛋数、异常蛋数(包括软蛋、破蛋、畸形蛋)、日采食量、料蛋比等生产性能指标。

产蛋量(克/天﹒只)＝产蛋总重/每天饲养只数。

日采食量(克/天﹒只)＝给料量-剩料量/每天饲养只数。

料蛋比＝每周耗料总量(千克)/每周产蛋总量(千克)。

产蛋率(％)＝每天产蛋只数/饲养只数

根据上述公式统计数据，结果如表2所示。由表2可以看出，在正常营养水平上，在蛋鸡饲料中添加葡萄糖氧化酶酶制剂能明显提高了蛋鸡的总产蛋率，比对照组提高了15％；试验组的软破畸形蛋率比对照组降低62.02％，表明饲料中添加葡萄糖氧化酶能明显提高蛋壳品质；试验组的料蛋比平均比对照组降低11.71％，说明葡萄糖氧化酶能够明显提高饲料转化率；死淘率显示，葡萄糖氧化酶添加组的死淘率为0，说明葡萄糖氧化酶能提高蛋鸡的抗病能力。

表2葡萄糖氧化酶酶制剂对蛋鸡生产性能的影响

注：表中日采食量、日产蛋量、日产蛋率均为平均值。