本发明涉及蛋白酶K的制备领域，尤其是涉及一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的生产工艺。
背景技术：
蛋白酶 K 属丝氨酸蛋白酶类，它是林伯氏白色念球菌（Tritirac hium a Lbum Limber）产生的一类主要蛋白酶。因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白（Kerantin）为唯一碳氮源的环境中生长，故将其称作蛋白酶 K。蛋白酶 K具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸 C 末端邻接的酯键和肽键，常被用于降解蛋白生产短肽。它具有丝氨酸蛋白酶类所具有的典型催化三联体Asp39- His69-Ser224 特征并且活性中心周围有两个 Ca2+结合位点以增加其稳定性，使其在更广泛的条件下保持较高的酶活力。
申请号 201110436334.X的中国专利公布一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶 K 的生产工艺，以林伯氏白色念球菌(Tritirac hium a Lbum Limber) 为出发菌株，经60 Goγ 射线诱变及原生质体紫外诱变后，采用特定的培养基，经液态深层发酵生产蛋白酶 K。在培养温度为 22 ～ 28℃，发酵液 p H 值维持在 5.5 ～6.0范围内，发酵罐搅拌转速为250～500rev/min的培养条件下，蛋白酶 K 的产量有大幅度提高，适用于工业化生产。与现有技术相比，该发明填补了国内在蛋白酶 K 生产工艺上的空白，大幅度提高了生物表达量，同时降低了生产成本，从而极大地提高了产品的市场竞争力。
该发明对生物表达量的控制上虽有显著上升，但是还是比较低，同时随着技术的发展该产品的市场竞争力在慢慢弱化。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种生物表达量大、成本较低的利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的生产工艺。
本发明解决其技术同题所釆用的技术方案是:
一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的生产工艺，包括以下步骤：
S1摇瓶种子培养阶段
S11试管活化：甘油管保藏菌种，先在一个 5ml试管 YPD 培养，30℃，活化12-16 个小时，可以在弹簧网状震荡摇床培养。
S12摇瓶活化：将试管菌种接种到 YPD 液体培养基活化 30℃，活化 16-18 个小时（一般下午 5-6 点活化；做 1-2 个摇瓶，25ml/250ml）。
S13菌种平板培养：平板培养基为 MD 或 MGY，30℃培养 3 天，挑选单菌落。（一般做3个平行平板），挑取单菌落进行甘油管保藏。
S14挑取单菌落，在 BMGY 试管斜面上 30℃，培养 3 天。
S15种子液的体积为摇瓶额定体积的 5-10%，液体培养基为含有 1-5g/kg癸基葡萄糖苷的MGY 或 BMGY，
30℃，250-300 rpm，培养 16-24 h。
S2发酵罐培养阶段
S21总体概述:
P H 5.0（浓氨水调节 p H），温度 30℃，通气量 1.0vvm，甘油初始浓度为 4%，接种量为10%，搅拌控制在 400-600 rpm 接种之前溶解氧标定到 10%，发酵过程中控制溶氧大于 20%，大约发酵 18-24 h ，初步预测此时，湿菌体浓度达到 90-150g/ L。剩余部分-20℃冷冻保存，待测酶活，蛋白含量等。同时，调节甘油补料培养基的补料量，开始甘油补料。
S22甘油补料培养阶段：
补加甘油补料培养基，流量控制：1 h，1 L 发酵液中补加 18.15ml。补料维持大约在 4 小时菌体菌体湿重在 50-300g/ L。
S23甲醇补料培养阶段：
补加甲醇补料培养基，流量控制：1 h，1 L发酵液中补加3.6ml，在刚开始的 2-3 h内溶氧不稳定，是毕赤酵母的适应期。一旦适应并以甲醇进行代谢后，溶氧趋于稳定（1 分钟），然后在底线条件之上维持 1 h；然后提高到原来两倍的流加速率，即 1 h，1 L 发酵液中补加 3.6ml，维持大约 2 h；然后提高流加速率至 10.9ml，直到发酵结束。整个甲醇表达阶段，大约 70 h，1 L 发酵液中大约补加 740ml 的甲醇补料培养基。在整个发酵过程中，一旦出现溶氧低于 20%的情况，立即停止补料，提高通气量，搅拌速率。
作为优选，S11试管活化：活化14个小时；
作为优选，S12一般下午 5-6 点活化；做 1-2 个摇瓶，25ml/250ml。
作为优选，S15种子液的体积为摇瓶额定体积的8%，液体培养基为含有 1-5g/kg癸基葡萄糖苷的MGY 或 BMGY，30℃，275 rpm，培养 20 h。
作为优选，S21总体概述:发酵过程中控制溶氧大于20%，大约发酵 20 h。
作为优选，S22甘油补料培养阶段：溶氧始终＞20%，甘油浓度小于 4%。p H 严格控制在5左右，不能低于3，高于7。
作为优选，S23甲醇补料培养阶段：在整个发酵过程中，一旦出现溶氧低于 20%的情况，立即停止补料，提高通气量，搅拌速率。
本发明的一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的生产工艺可以毕赤酵母重组表达系统,原料来源广泛,价格低廉,实现了高效的合成蛋白酶 K，进一步降低生产成本。
具体实施方式
实施例1
本发明解决其技术同题所釆用的技术方案是:
S1摇瓶种子培养阶段
S11试管活化：甘油管保藏菌种，先在一个 5ml试管 YPD 培养，30℃，活化12-13个小时，可以在弹簧网状震荡摇床培养。
S12摇瓶活化：将试管菌种接种到 YPD 液体培养基活化 30℃，活化 16-18 个小时。
S13菌种平板培养：平板培养基为 MD 或 MGY，30℃培养 3 天，挑选单菌落。（一般做3个平行平板），挑取单菌落进行甘油管保藏。
S14挑取单菌落，在 BMGY 试管斜面上 30℃，培养 3 天。
S15种子液的体积为摇瓶额定体积的 5-7%，液体培养基为含有 1-5g/kg癸基葡萄糖苷的MGY 或 BMGY，
30℃，250-270 rpm，培养 16-20 h。
S2发酵罐培养阶段
S21总体概述:
P H 5.0（浓氨水调节 p H），温度 30℃，通气量 1.0vvm，甘油初始浓度为 4%，接种量为10%，搅拌控制在 400-600 rpm 接种之前溶解氧标定到 10%，发酵过程中控制溶氧大于20%，大约发酵24 h ，初步预测此时，湿菌体浓度达到 95g/ L。剩余部分-20℃冷冻保存，待测酶活，蛋白含量等。同时，调节甘油补料培养基的补料量，开始甘油补料。
S22甘油补料培养阶段：
补加甘油补料培养基，流量控制：1 h，1 L 发酵液中补加 18.15ml。补料维持大约在 4 小时菌体湿重在 70g/ L。
S23甲醇补料培养阶段：
补加甲醇补料培养基，流量控制：1 h，1 L发酵液中补加3.6ml，在刚开始的 2-3 h内溶氧不稳定，是毕赤酵母的适应期。一旦适应并以甲醇进行代谢后，溶氧趋于稳定（1 分钟），然后在底线条件之上维持 1 h；然后提高到原来两倍的流加速率，即 1 h，1 L 发酵液中补加 3.6ml，维持大约 2 h；然后提高流加速率至 10.9ml，直到发酵结束。整个甲醇表达阶段，大约 70 h，1 L 发酵液中大约补加 740ml 的甲醇补料培养基。在整个发酵过程中，一旦出现溶氧低于 20%的情况，立即停止补料，提高通气量，搅拌速率。
实施例2
本发明解决其技术同题所釆用的技术方案是:
S1摇瓶种子培养阶段
S11试管活化：甘油管保藏菌种，先在一个 5ml试管 YPD 培养，30℃，活化12-16 个小时，可以在弹簧网状震荡摇床培养。
S12摇瓶活化：将试管菌种接种到 YPD 液体培养基活化 30℃，活化17个小时。
S13菌种平板培养：平板培养基为 MD 或 MGY，30℃培养 3 天，挑选单菌落。（一般做3个平行平板），挑取单菌落进行甘油管保藏。
S14挑取单菌落，在 BMGY 试管斜面上 30℃，培养 3 天。
S15种子液的体积为摇瓶额定体积的 8%，液体培养基为含有 1-5g/kg癸基葡萄糖苷的MGY 或 BMGY，
30℃，250-300 rpm，培养 22 h。
S2发酵罐培养阶段
S21总体概述:
P H 5.0（浓氨水调节 p H），温度 30℃，通气量 1.0vvm，甘油初始浓度为 4%，接种量为10%，搅拌控制在 400-600 rpm 接种之前溶解氧标定到 10%，发酵过程中控制溶氧大于20%，大约发酵 20 h ，初步预测此时，湿菌体浓度达到 90-150g/ L。剩余部分-20℃冷冻保存，待测酶活，蛋白含量等。同时，调节甘油补料培养基的补料量，开始甘油补料。
S22甘油补料培养阶段：
补加甘油补料培养基，流量控制：1 h，1 L 发酵液中补加 18.15ml。补料维持大约在 4 小时菌体菌体湿重在 200g/ L。
S23甲醇补料培养阶段：
补加甲醇补料培养基，流量控制：1 h，1 L发酵液中补加3.6ml，在刚开始的 2-3 h内溶氧不稳定，是毕赤酵母的适应期。一旦适应并以甲醇进行代谢后，溶氧趋于稳定（1 分钟），然后在底线条件之上维持 1 h；然后提高到原来两倍的流加速率，即 1 h，1 L 发酵液中补加 3.6ml，维持大约 2 h；然后提高流加速率至 10.9ml，直到发酵结束。整个甲醇表达阶段，大约 70 h，1 L 发酵液中大约补加 740ml 的甲醇补料培养基。在整个发酵过程中，一旦出现溶氧低于 20%的情况，立即停止补料，提高通气量，搅拌速率。
实施例3
本发明解决其技术同题所釆用的技术方案是:
S1摇瓶种子培养阶段
S11试管活化：甘油管保藏菌种，先在一个 5ml试管 YPD 培养，30℃，活化12-16 个小时，可以在弹簧网状震荡摇床培养。
S12摇瓶活化：将试管菌种接种到 YPD 液体培养基活化 30℃，活化 16-18 个小时（一般下午 5-6 点活化；做 1-2 个摇瓶，25ml/250ml）。
S13菌种平板培养：平板培养基为 MD 或 MGY，30℃培养 3 天，挑选单菌落。（一般做3个平行平板），挑取单菌落进行甘油管保藏。
S14挑取单菌落，在 BMGY 试管斜面上 30℃，培养 3 天。
S15种子液的体积为摇瓶额定体积的 8%，液体培养基为含有 1-5g/kg癸基葡萄糖苷的MGY 或 BMGY，能促进菌的生长，提高培养效率。30℃，270 rpm，培养20 h。
S2发酵罐培养阶段
S21总体概述:
P H 5.0（浓氨水调节 p H），温度 30℃，通气量 1.0vvm，甘油初始浓度为 4%，接种量为10%，搅拌控制在 500 rpm 接种之前溶解氧标定到 10%，发酵过程中控制溶氧大于 20%，大约发酵 18-24 h ，初步预测此时，湿菌体浓度达到100g/ L。剩余部分-20℃冷冻保存，待测酶活，蛋白含量等。同时，调节甘油补料培养基的补料量，开始甘油补料。
S22甘油补料培养阶段：
补加甘油补料培养基，流量控制：1 h，1 L 发酵液中补加 18.15ml。补料维持大约在 4 小时菌体湿重在 200g/ L。
S23甲醇补料培养阶段：
补加甲醇补料培养基，流量控制：1 h，1 L发酵液中补加3.6ml，在刚开始的 2-3 h内溶氧不稳定，是毕赤酵母的适应期。一旦适应并以甲醇进行代谢后，溶氧趋于稳定（1 分钟），然后在底线条件之上维持 1 h；然后提高到原来两倍的流加速率，即 1 h，1 L 发酵液中补加 3.6ml，维持大约 2 h；然后提高流加速率至 10.9ml，直到发酵结束。整个甲醇表达阶段，大约 70 h，1 L 发酵液中大约补加 740ml 的甲醇补料培养基。在整个发酵过程中，一旦出现溶氧低于 20%的情况，立即停止补料，提高通气量，搅拌速率。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。