本发明涉及一种多肽制备方法，具体涉及一种蚯蚓多肽提取物的制备方法。
背景技术：
活性肽广泛存在于自然界中，生物体很多活性物质都以肽的形式存在，没有肽，就没有活性，没有生命。科学家们研究发现了具有免疫调节、激素调节、酶调节、抗病毒、降血压和降血脂等功能性肽。由于功能性肽的特殊功能，使得人们对它需求增加，现在已提取出多种功能性肽多用于医用和保健，如功能性大豆蛋白肽已经用于降血脂。
蚯蚓为环节动物门寡毛纲动物，可改量土壤，促进农业增产，在物质循环、生物多样性、保护生态环境等方面发挥着特殊作用。此外，蚯蚓还是我国常用中药，名为地龙。研究发现，蚯蚓具有治疗心血管疾病、癌症、哮喘等多种药理作用，同时还具有增强免疫力，促进伤口愈合等作用。蚯蚓中含有丰富的人体所需营养物质，包括蛋白质、核酸、微量元素、维生素等。其中蛋白质总量约占干质量的45.9％～68.11％。蚯蚓经酶水解可获得小分子多肽和氨基酸，不仅可以提供均衡的、易于吸收的营养物质，而且蚯蚓肽还具有抗氧化、增强免疫、抗菌等生理活性，在保健食品领域具有潜在的应用价值。
目前，蚯蚓活性多肽的制备主要由以下几种方法：(1)通过蚯蚓自身含有的自溶酶进行酶解来制备蚯蚓活性小分子多肽；(2)通过加入外源酶，然后再结合内源酶进行水解，得到蚯蚓多肽提取物；但是采用上述制备方法对pH值、温度要求严格，并且所得到的多肽提取率低、颜色差、有腥味和苦味。因此，针对上述问题，有必要建立一种蚯蚓活性多肽制备的新方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种蚯蚓多肽提取物的制备方法，该方法能提高多肽的提取率、而且颜色好、无腥味和苦味。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种蚯蚓多肽提取物的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：
(1)预处理：取新鲜蚯蚓清洗干净，然后在0.5～1mg/L的蔗糖溶液中浸泡,捞出后再将蚯蚓置于生理盐水中浸泡15～30min，待生理盐水中无泥沙污物时将蚯蚓捞出沥干，然后按照料液比1:10～20的比例加入0.15～0.3mol/L的氯化钾溶液，匀浆，超声浸提，得到固液混合体；
(2)发酵处理：取步骤(1)中的固液混合体，加入固液混合体重量0.05～0.15倍的混合菌种，调pH3～6,温度控制在30～37℃发酵12～24h，得到发酵混合物；
(3)一次酶解：取步骤(2)中的发酵混合物，加入发酵混合物重量0.02～0.1倍的菠萝蛋白酶，调pH5～7.5，温度控制在50～60℃进行酶解15～30min，灭酶，得到酶解物；
(4)二次酶解：取步骤(3)中的酶解物，加入酶解物重量0.02～0.05倍的胃蛋白酶，在维持胃蛋白酶活性条件下进行酶解处理，将所得酶解物离心去渣，收集的上清液为多肽粗提液；
(5)超滤处理：取步骤(4)中的多肽粗提液经过超滤膜超滤，然后再将所得滤液经过纳滤膜截留，将所得截留液冷冻干燥得到蚯蚓多肽提取物。
作为一种改进的技术方案，步骤(1)中超声浸提条件：超声功率80～200w，超声时间10～25min，超声温度30～45℃。
作为一种改进的技术方案，步骤(2)中混合菌种为乳酸菌、酵母菌和曲霉菌，且所述乳酸菌、酵母菌和曲霉菌的质量比为0.1～0.5:0.15～0.35:0.12～0.3。
作为一种改进的技术方案，所述乳酸菌、酵母菌和曲霉菌的质量比为0.43:0.3:0.25。
作为一种改进的技术方案，步骤(4)中的酶解温度为30～37℃，酶解时间为10～25min。
作为一种改进的技术方案，步骤(1)中超声浸提条件为：超声功率160w，超声时间15min，超声温度40℃。
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
(1)本发明采用蔗糖溶液和盐溶液依次对蚯蚓浸泡，可快速清除蚯蚓体内的沙土和污物，缩短清洗和浸泡时间；然后加入氯化钾溶液对蚯蚓进行匀浆处理，超声浸提促进了蛋白组分的溶出；
(2)本发明通过大量实验，筛选出由乳酸菌、酵母菌和曲霉菌组成的混合菌种，利用混合菌种的协同作用对蚯蚓匀浆组织液进行发酵，发酵过程中产生的蛋白酶可将蚯蚓组织中蛋白充分发酵，而且在发酵过程中，由于微生物的代谢作用会对一些多肽分子进行修饰，使小肽之间，小肽与氨基酸之间发生移接与重排，制得的活性肽无苦味和异味，进而改善多肽的质量；然后再经过菠萝蛋白酶及胃蛋白酶的酶解，更进一步起到对蛋白质的降解作用，提高了小分子多肽的提取率；
(3)本发明采用分子截留技术对多肽粗提掖进行超滤和纳滤，得到分子量小于300的小分子多肽提取物，具有较好的抗氧化活性，对DPPH自由基和超氧阴离子自由基具有较好的清除作用。
综上所述，本发明采用发酵与酶解相互结合的方法来制备的蚯蚓多肽提取物，颜色好，无异味和苦味，具有较好的抗氧化活性，而且采用此种方法还大大提高了多肽提取物的提取率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种蚯蚓多肽提取物的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：
(1)预处理：取新鲜蚯蚓1000g清洗干净，然后在0.5mg/L的蔗糖溶液中浸泡20min后捞出，再将蚯蚓置于生理盐水中浸泡15min，待生理盐水中无泥沙污物时将蚯蚓捞出沥干，然后按照料液比1:10的比例加入0.15mol/L的氯化钾溶液，匀浆，超声浸提(超声功率80w，超声时间10min，超声温度30℃)，得到固液混合体；
(2)发酵处理：取步骤(1)中的固液混合体，加入固液混合体重量0.05倍的混合菌种(乳酸菌、酵母菌和曲霉菌的质量比为0.1:0.15:0.12)，调pH3.5,温度控制在30℃发酵12h，得到发酵混合物；
(3)一次酶解：取步骤(2)中的发酵混合物，加入发酵混合物重量0.03倍的菠萝蛋白酶，调pH5，温度控制在53℃进行酶解15min，90℃灭酶，得到酶解物；
(4)二次酶解：取步骤(3)中的酶解物，加入酶解物重量0.02倍的胃蛋白酶，在维持胃蛋白酶活性条件下进行酶解处理(酶解温度为30℃，酶解时间为10min)，将所得酶解产物离心去渣，收集的上清液为蚯蚓多肽粗提液；
(5)超滤处理：取步骤(4)中的多肽粗提液经过截留分子量为5000的超滤膜超滤，然后再将所得滤液经过截留分子量为300的纳滤膜截留，将所得截留液冷冻干燥得到蚯蚓多肽。
此条件下蚯蚓多肽提取物的提取率为9.56％，多肽提取物呈微黄色、带有香味的，所得多肽提取物的分子量小于300。
实施例2
一种蚯蚓多肽提取物的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：
(1)预处理：取新鲜蚯蚓1000g清洗干净，然后在0.8/L的蔗糖溶液中浸泡25min后捞出，再将蚯蚓置于生理盐水中浸泡20min，待生理盐水中无泥沙污物时将蚯蚓捞出沥干，然后按照料液比1:15的比例加入0.2mol/L的氯化钾溶液，匀浆，超声浸提(超声功率120w，超声时间15min，超声温度35℃)，得到固液混合体；
(2)发酵处理：取步骤(1)中的固液混合体，加入固液混合体重量0.1倍的混合菌种(乳酸菌、酵母菌和曲霉菌的质量比为0.2:0.27:0.2)，调pH4.5,温度控制在32℃发酵18h，得到发酵混合物；
(3)一次酶解：取步骤(2)中的发酵混合物，加入发酵混合物重量0.05倍的菠萝蛋白酶，调pH5.3，温度控制在57℃进行酶解20min，90℃灭酶，得到的酶解物；
(4)二次酶解：取步骤(3)中的酶解物，加入酶解物重量0.04倍的胃蛋白酶，在维持胃蛋白酶活性条件下进行酶解处理(酶解温度为32℃，酶解时间为15min)，将所得酶解产物离心去渣，收集的上清液为蚯蚓多肽粗提液；
(5)超滤处理：取步骤(4)中的蚯蚓多肽粗提液经过截留分子量为4000的超滤膜超滤，然后再将所得滤液经过截留分子量为300的纳滤膜截留，将所得截留液冷冻干燥得到蚯蚓多肽。
此条件下蚯蚓多肽提取物的提取率为10.56％，多肽提取物呈微黄色、带有香味的，所得多肽提取物的分子量小于300。
实施例3
一种蚯蚓多肽提取物的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：
(1)预处理：取新鲜蚯蚓1000g清洗干净，然后在1mg/L的蔗糖溶液中浸泡35min后捞出，再将蚯蚓置于生理盐水中浸泡25min，待生理盐水中无泥沙污物时将蚯蚓捞出沥干，然后按照料液比1:18的比例加入0.25mol/L的氯化钾溶液，匀浆，超声浸提(超声功率160w，超声时间15min，超声温度40℃)，得到固液混合体；
(2)发酵处理：取步骤(1)中的固液混合体，加入固液混合体重量0.1倍的混合菌种(乳酸菌、酵母菌和曲霉菌的质量比为0.43:0.3:0.25)，调pH5.5,温度控制在35℃发酵20h，得到发酵混合物；
(3)一次酶解：取步骤(2)中的发酵混合物，加入发酵混合物重量0.08倍的菠萝蛋白酶，调pH7，温度控制在58℃进行酶解25min，92℃灭酶，得到酶解物；
(4)二次酶解：取步骤(3)中的酶解物，加入酶解物重量0.04倍的胃蛋白酶，在维持胃蛋白酶活性条件下进行酶解处理(酶解温度为35℃，酶解时间为20min)，将所得酶解产物离心去渣，收集的上清液为蚯蚓多肽粗提液；
(5)超滤处理：取步骤(4)中的蚯蚓多肽粗提液经过截留分子量为3000的超滤膜超滤，然后再将所得滤液经过分子量为300的纳滤膜截留，将所得截留液冷冻干燥得到蚯蚓多肽。
此条件下蚯蚓多肽提取物的提取率为11.35％，多肽提取物呈微黄色、带有香味的，所得多肽提取物的分子量小于300。
实施例4
一种蚯蚓多肽提取物的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：
(1)预处理：取新鲜蚯蚓1000g清洗干净，然后在1mg/L的蔗糖溶液中浸泡40min后捞出，再将蚯蚓置于生理盐水中浸泡30min，待生理盐水中无泥沙污物时将蚯蚓捞出沥干，然后按照料液比1：20的比例加入0.3mol/L的氯化钾溶液，匀浆，超声浸提(超声功率200w，超声时间25min，超声温度45℃)，得到固液混合体；
(2)发酵处理：取步骤(1)中的固液混合体，加入固液混合体重量0.15倍的混合菌种(乳酸菌、酵母菌和曲霉菌的质量比为0.5:0.35:0.3)，调pH6,温度控制在37℃发酵24h，得到发酵混合物；
(3)一次酶解：取步骤(2)中的发酵混合物，加入发酵混合物重量0.1倍的菠萝蛋白酶，调pH6.5，温度控制在60℃进行酶解30min，90℃灭酶，得到酶解物；
(4)二次酶解：取步骤(3)中的酶解物，加入酶解物重量0.05倍的胃蛋白酶，在维持胃蛋白酶活性条件下进行酶解处理(酶解温度为37℃，酶解时间为25min)，将所得酶解物离心去渣，收集的上清液为蚯蚓多肽粗提液；
(5)超滤处理：取步骤(4)中的蚯蚓多肽粗提液经过超滤膜超滤，然后再将所得滤液经过纳滤膜截留，将所得截留液冷冻干燥得到蚯蚓多肽。
此条件下蚯蚓多肽提取物的提取率为10.89％，多肽提取物呈微黄色、带有香味的，所得多肽提取物的分子量小于300。
实施例5
一种蚯蚓多肽提取物的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：
(1)预处理：取新鲜蚯蚓1000g清洗干净，然后在1mg/L的蔗糖溶液中浸泡40min后捞出，再将蚯蚓置于生理盐水中浸泡30min，待生理盐水中无泥沙污物时将蚯蚓捞出沥干，然后按照料液比1：20的比例加入0.3mol/L的氯化钾溶液，匀浆，超声浸提(超声功率200w，超声时间25min，超声温度45℃)，得到固液混合体；
(2)发酵处理：取步骤(1)中的固液混合体，加入固液混合体重量0.15倍的混合菌种(乳酸菌、酵母菌和曲霉菌的质量比为0.5:0.35:0.3)，调pH6,温度控制在37℃发酵24h，得到发酵混合物；
(3)一次酶解：取步骤(2)中的发酵混合物，加入发酵混合物重量0.1倍的菠萝蛋白酶，调pH6.5，温度控制在60℃进行酶解30min，90℃灭酶，得到酶解物；
(4)二次酶解：取步骤(3)中的酶解物，加入酶解物重量0.05倍的胃蛋白酶，在维持胃蛋白酶活性条件下进行酶解处理(酶解温度为37℃，酶解时间为25min)，灭酶，得酶解物；
(5)三次酶解：取步骤(4)中的酶解物，然后加入酶解物重量0.03倍的无花果蛋白酶，调pH6.5，温度控制在48℃，酶解30min，灭酶，酶解物离心去渣，收集的上清液为蚯蚓多肽粗提液；
(6)超滤处理：取步骤(5)中的蚯蚓多肽粗提液经过超滤膜超滤，然后再将所得滤液经过纳滤膜截留，将所得截留液冷冻干燥得到蚯蚓多肽。
此条件下蚯蚓多肽提取物的提取率为11.56％，多肽提取物呈微黄色、带有香味的，所得多肽提取物的分子量小于300。
对比实施例
与实施例3相比，区别仅在于不进行步骤(2)发酵处理。此工艺条件下多肽提取物的得率为8.45％，多肽提取物颜色差、带有腥味，所得多肽提取物的分子量小于3000。
实施例5
(1)蚯蚓多肽提取物对有机自由基DPPH的清除作用
取蚯蚓多肽提取物，分别按照表1中的浓度配置多肽提取物样品溶液，以a-熊果苷作为阳性对照。采用DPPH法检测蚯蚓多肽提取物对DPPH的清除作用，清除率计算公式:
清除率(％)＝(A对照-A样品)/A对照×100％
清除率结果见表1。
表1蚯蚓多肽提取物对超氧阴离子自由基的清除作用
实验结果表明各浓度下的蚯蚓多肽提取物对体外有机自由基DPPH都有一定的清除能力，并且在0.05～8mg/ml的范围内，其清除率随着浓度的增高而增强，当浓度为8mg/ml时蚯蚓多肽提取物对DPPH的清除率达到93.6％。
(2)蚯蚓多肽提取物对超氧阴离子自由基的清除作用
取蚯蚓多肽提取物，分别按照表2中的浓度范围0.8-25mg/ml配置多肽提取物样品溶液，以VC作为阳性对照(其中VC对照品溶液配置0.1mg/ml、0.4mg/ml和0.8mg/ml三个浓度)，采用邻苯三酚法检测蚯蚓多肽提取物对超氧阴离子自由基的清除作用，清除率结果见表2。
表2蚯蚓多肽提取物对超氧阴离子自由基的清除作用
实验结果表明各浓度下的蚯蚓多肽提取物样品溶液对体外超氧阴离子自由基都有一定的清除能力，并且在0.8～25mg/ml的范围内，其清除率随着浓度的增高而增强，当浓度为25mg/ml时蚯蚓多肽提取物对超氧阴离子自由基的清除率达到70.3％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。