通过LC‑MS/MS快速检测微生物对内酰胺抗生素的抗性的制作方法

相关申请案的交叉参考

本申请案主张2015年2月11日申请的序列号为62/114,852的美国临时专利申请案的权益，所述临时专利申请案的全部内容以引用的方式并入本文中。

本文中的教示涉及用于通过检测抗生素的变化而非细菌细胞生长的变化来确定微生物对抗生素的抗性的方法及系统。更具体地说，通过利用液相色谱法耦合质谱法/质谱法(lc-ms/ms)以定量母体内酰胺抗生素的浓度且还检测由细菌的β-内酰胺酶活动引起的水解产物来鉴定细菌对抗生素的抗性。

背景技术：

基质辅助激光解吸电离飞行时间(maldi-tof)质谱法已基于核糖体蛋白质表达而彻底改变了细菌鉴定。然而，细菌对抗生素的抗性通常仍是通过在存在抗生素的情况下评估细菌生长的常规方法而确定。细菌细胞的生长是以多种方式而确定。浊度测定方法测量细菌细胞吸收的光量以量化其生长。分光光度测定方法测量细菌细胞随波长而变的反射或透射性质以量化其生长。最后，纸片扩散方法涉及将抗生素浸渍的晶片或纸片放置在细菌细胞生长的琼脂板上。接着在某个时间段之后分析晶片或纸片以确定细胞细胞生长是否在晶片或纸片周围被明显抑制。

用于确定细菌微生物对特定抗生素的抗性的所有这些常规方法是相对慢的方法，其常常需要12小时到24小时。由于培养，其需要大量的时间。基本上，在这些方法中，所提取的细菌细胞需要被培养持续大量的时间，以便提供大到足以被检测的细胞生长。

细菌性败血症及败血性休克是世界范围内死亡的主要原因。在美国，据估计，每年有250,000名患者会发生威胁生命的感染，其中死亡率从28％变为大于50％，这取决于其它潜在的疾病状况及感染的严重度。不幸的是，治疗细菌感染的时间至关重要。抗生素抗性可被确定得越早，患者可被成功治疗的可能性越大。

因此，需要比依赖于检测细菌细胞生长的常规方法更快地确定微生物对抗生素的抗性的系统及方法。

技术实现要素：

揭示一种用于检测细菌微生物对一或多种抗生素药物的抗性的系统。系统包含培养装置、分离装置、离子源装置、串联质谱仪及处理器。

培养装置在第一时间段内培养细菌微生物与一或多种抗生素药物的样品混合物。样品混合物中的一或多种抗生素药物的初始浓度是已知的。

分离装置在第一时间段之后的第二时间段内将一或多种抗生素药物与经培养混合物分离。

离子源装置在第二时间段内将分离的一或多种抗生素药物反复地变换为离子。

串联质谱仪在第二时间段内反复地选择及分裂一或多种抗生素药物的离子。反复地选择及分裂一或多种抗生素药物的离子会在第二时间段内产生一或多种抗生素药物的多个产物离子光谱。

处理器与串联质谱仪通信。处理器从多个产物离子光谱计算一或多种抗生素药物的产物离子的色谱图。处理器从色谱图计算一或多种抗生素药物的经测量浓度。处理器比较经测量浓度与初始浓度。处理器在一或多种抗生素药物中的抗生素药物的经测量浓度比抗生素药物的初始浓度小预定量的情况下报告细菌微生物对抗生素药物的抗性的检测。

揭示一种用于检测细菌微生物对一或多种抗生素药物的抗性的方法。使用培养装置在第一时间段内培养细菌微生物与一或多种抗生素药物的样品混合物。样品混合物中的一或多种抗生素药物的初始浓度是已知的。

使用分离装置在第一时间段之后的第二时间段内将一或多种抗生素药物与经培养混合物分离。

使用离子源装置在第二时间段内将经分离的一或多种抗生素药物反复地变换为离子。

使用串联质谱仪在第二时间段内反复地选择及分裂一或多种抗生素药物的离子。反复地选择及分裂一或多种抗生素药物的离子会在第二时间段内产生一或多种抗生素药物的多个产物离子光谱。

使用处理器从多个产物离子光谱计算一或多种抗生素药物的产物离子的色谱图。

使用处理器从色谱图计算一或多种抗生素药物的经测量浓度。

使用处理器来比较经测量浓度与初始浓度。

使用处理器在一或多种抗生素药物中的抗生素药物的经测量浓度比抗生素药物的初始浓度小预定量的情况下报告细菌微生物对抗生素药物的抗性的检测。

本文中阐述本申请人的教示的这些及其它特征。

附图说明

技术人员将理解，下文所描述的图式是仅出于说明目的。图式并不意欲以任何方式限制本教示的范围。

图1是说明计算机系统的框图，本教示的实施例可实施于所述计算机系统上。

图2是根据各种实施例的展示在没有抗生素水解的情况下的敏感菌株中的氨苄青霉素及哌拉西林母体药物的检测的色谱图。

图3是根据各种实施例的展示在出现水解产物的情况下水解两种药物的抗性菌株的色谱图。

图4是根据各种实施例的展示在不存在水解的情况下的头孢噻肟母体药物的色谱图。

图5是展示头孢噻肟母体药物在存在表达扩展光谱β-内酰胺酶的大肠杆菌的情况下消失的色谱图。

图6是根据各种实施例的用于检测细菌微生物对一或多种抗生素药物的抗性的系统的示意图。

图7是根据各种实施例的展示用于检测细菌微生物对一或多种抗生素药物的抗性的方法的流程图。

在详细地描述本教示的一或多个实施例之前，所属领域的技术人员将了解，本教示在其应用上并不限于以下详细描述中所阐述或图式中所说明的构造细节、组件布置及步骤布置。此外，应理解，本文中所使用的短语及术语是出于描述目的且不应被视为限制性的。

具体实施方式

计算机实施系统

图1是说明计算机系统100的框图，本教示的实施例可实施于计算机系统100上。计算机系统100包含总线102或用于传达信息的其它通信机构，及与总线102耦合以用于处理信息的处理器104。计算机系统100还包含存储器106，其可为随机存取存储器(ram)或其它动态存储装置，存储器106耦合到总线102以用于存储待由处理器104执行的指令。存储器106还可用于在执行待由处理器104执行的指令期间存储临时变量或其它中间信息。计算机系统100进一步包含只读存储器(rom)108或耦合到总线102以用于存储用于处理器104的静态信息及指令的其它静态存储装置。存储装置110(例如磁盘或光盘)被提供且耦合到总线102以用于存储信息及指令。

计算机系统100可经由总线102而耦合到显示器112(例如阴极射线管(crt)或液晶显示器(lcd))以用于将信息显示给计算机用户。包含字母数字键及其它键的输入装置114耦合到总线102以用于将信息及命令选择传达到处理器104。其它类型的用户输入装置是光标控制件116，例如鼠标、轨迹球或用于将方向信息及命令选择传达到处理器104且用于控制光标在显示器112上的移动的光标方向键。此输入装置通常在两个轴(第一轴(即，x)及第二轴(即，y))上具有两个自由度，此允许所述装置在平面中指定位置。

计算机系统100可执行本教示。按照本教示的某些实施方案，由计算机系统100响应于处理器104执行存储器106中所含有的一或多个指令的一或多个序列而提供结果。此类指令可从另一计算机可读媒体(例如存储装置110)读取到存储器106中。存储器106中所含有的指令序列的执行会致使处理器104执行本文中所描述的过程。替代地，可使用硬接线电路以代替软件指令或与软件指令组合以实施本教示。因此，本教示的实施方案并不限于硬件电路与软件的任何特定组合。

如本文中所使用的术语“计算机可读媒体”是指参与向处理器104提供指令以供执行的任何媒体。此类媒体可呈许多形式，包含但不限于非易失性媒体、易失性媒体及传输媒体。非易失性媒体包含(例如)光盘或磁盘，例如存储装置110。易失性媒体包含动态存储器，例如存储器106。传输媒体包含同轴电缆、铜线及光纤，其包含包括总线102的导线。

计算机可读媒体的常见形式包含(例如)软磁盘、软盘、硬盘、磁带，或任何其它磁性媒体、cd-rom、数字视频光盘(dvd)、蓝光光盘、任何其它光学媒体、指状驱动器、存储卡、ram、prom，及eprom、flash-eprom、任何其它存储器芯片或存储器匣，或可供计算机读取的任何其它有形媒体。

在将一或多个指令的一或多个序列携载到处理器104以供执行时可涉及到各种形式的计算机可读媒体。举例来说，指令最初可携载在远程计算机的磁盘上。远程计算机可将指令加载到其动态存储器中并使用调制解调器在电话线上发送指令。计算机系统100本地的调制解调器可接收电话线上的数据并使用红外线发射器以将数据转换为红外线信号。耦合到总线102的红外线检测器可接收红外线信号中携载的数据并将数据放置在总线102上。总线102将数据携载到存储器106，处理器104从存储器106检索及执行指令。由存储器106接收的指令可任选地在由处理器104执行之前或之后存储在存储装置110上。

根据各种实施例，被配置为由处理器执行以执行方法的指令存储在计算机可读媒体上。计算机可读媒体可为存储数字信息的装置。举例来说，计算机可读媒体包含如所属领域中所知的用于存储软件的光盘只读存储器(cd-rom)。计算机可读媒体是由适合于执行经配置以被执行的指令的处理器存取。

已出于说明及描述的目的而呈现本教示的各种实施方案的以下描述。所述描述并非详尽的且并不将本教示限于所揭示的精确形式。鉴于以上教示的修改及变化是可能的，或可根据本教示的实践来获得所述修改及变化。另外，虽然所描述的实施方案包含软件，但本教示可被实施为硬件与软件的组合或单独地以硬件予以实施。可使用面向对象的编程系统及非面向对象的编程系统两者来实施本教示。

使用液相色谱法-串联质谱法(lc-ms/ms)快速检测抗生素之间的抗性

如上文所描述，细菌对抗生素的抗性通常仍是通过在存在抗生素的情况下评估细菌生长的常规方法而确定。由于培养，用于确定细菌微生物对特定抗生素的抗性的所有这些常规方法是相对慢的方法，其常常需要12小时到24小时。基本上，在这些方法中，所提取的细菌细胞需要被培养持续大量的时间，以便提供大到足以被检测的细胞生长。

不幸的是，治疗细菌感染的时间至关重要。抗生素抗性可被确定得越早，患者可被成功治疗的可能性越大。因此，需要比依赖于检测细菌细胞生长的常规方法更快地确定微生物对抗生素的抗性的系统及方法。

在各种实施例中，多种方法及系统通过检测抗生素的变化而非细菌细胞生长的变化来确定微生物对抗生素的抗性。更具体地说，通过利用液相色谱法耦合质谱法/质谱法(lc-ms/ms)以定量母体内酰胺抗生素的浓度且还检测由细菌的β-内酰胺酶活动引起的水解产物来鉴定细菌对抗生素的抗性。

抗生素的此药敏试验在短达90分钟的时间段内完成，所述药敏试验包含使用抗生素的细菌培养及lc-ms/ms分析。此外，可在相同的较短时间段内分析多种抗生素。换句话说，抗生素可被复用以使用细菌进行培养来最小化分析时间。大肠杆菌的23种不同菌株已经通过此方法进行评估，所述菌株包括atcc参考菌株(3)以及临床分离株(20)。这些评估实现了与传统方法完全一致。迄今为止，已经试验了以下抗生素：青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、氯唑西林、哌拉西林/他唑巴坦及头孢噻肟。在不存在及存在用作对照的他唑巴坦的情况下进行所有培养。在absciex3200qtrap系统上利用使用线性甲醇梯度在c18反相柱上进行多重反应监测(mrm)检测及药物分离的正离子电喷雾来进行lc-ms/ms分析。以下图2到5中展示样品色谱轮廓。通过使用氨苄青霉素、哌拉西林与头孢噻肟的混合物来培养临床大肠杆菌分离株并在absciex3200qtrap混合三重四极杆/线性离子阱质谱仪上对分离株进行lc-ms/ms分析而发现这些图所展示的数据。

图2是根据各种实施例的展示在没有抗生素水解的情况下的大肠杆菌的敏感菌株中的氨苄青霉素及哌拉西林母体药物的检测的色谱图200。色谱图200中仅展示母体药物氨苄青霉素210及哌拉西林220。

图3是根据各种实施例的展示由水解两种抗生素药物的大肠杆菌的抗性菌株产生的水解产物的出现的色谱图300。色谱图300中存在氨苄西林水解315及哌拉西林水解325。色谱图300中也展示母体药物哌拉西林320。

图4是根据各种实施例的展示从具有大肠杆菌的敏感菌株的样品中检测头孢噻肟母体药物的色谱图400。色谱图400中仅展示母体药物头孢噻肟410。色谱图400中不存在头孢噻肟母体药物的水解。

图5是展示头孢噻肟母体药物在存在表达扩展光谱β-内酰胺酶的大肠杆菌的抗性菌株的情况下消失的色谱图500。应注意，头孢噻肟母体药物在位置510处消失。还应注意，图5的色谱图500中的峰强度比图4的色谱图400中的峰强度小1.2倍。

用于检测抗生素抗性的系统

图6是根据各种实施例的用于检测细菌微生物对一或多种抗生素药物的抗性的系统的示意图600。

系统600包含培养装置610、分离装置620、离子源装置630、串联质谱仪640及处理器650。

培养装置610在第一时间段内培养细菌微生物与一或多种抗生素药物的样品混合物。样品混合物中的一或多种抗生素药物的初始浓度是已知的。

分离装置620在第一时间段之后的第二时间段内将一或多种抗生素药物与经培养混合物分离。分离装置620可执行分离技术，其包含但不限于液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳或离子迁移。

离子源装置630可为串联质谱仪640的部分，或可为单独装置。离子源装置630在第二时间段内将分离的一或多种抗生素药物反复地变换为离子。

举例来说，串联质谱仪640可包含一或多个物理质量过滤器及一或多个物理质量分析器。串联质谱仪640的质量分析器可包含但不限于飞行时间(tof)、四极杆、离子阱、线性离子阱、轨道阱或傅里叶变换质量分析器。串联质谱仪640可分别包含空间或时间中的单独阶段或步骤。

串联质谱仪640在第二时间段内反复地选择及分裂一或多种抗生素药物的离子。反复地选择及分裂一或多种抗生素药物的离子会在第二时间段内产生一或多种抗生素药物的多个产物离子光谱。

处理器650可为但不限于计算机、微处理器，或能够从串联质谱仪640发送及接收控制信号及数据且处理数据的任何装置。处理器650可为(例如)图1的计算机系统100。在各种实施例中，处理器650与串联质谱仪640通信。

处理器650从多个产物离子光谱计算一或多种抗生素药物的产物离子的色谱图。处理器650从色谱图计算一或多种抗生素药物的经测量浓度。处理器650比较经测量浓度与初始浓度。处理器650在一或多种抗生素药物中的抗生素药物的经测量浓度比抗生素药物的初始浓度小预定量的情况下报告细菌微生物对抗生素药物的抗性的检测。

在各种实施例中，第一时间段与第二时间段的总和小于90分钟。

在各种实施例中，图6的分离装置620在第二时间段内进一步分离一或多种抗生素药物的一或多种水解成分。离子源装置630在第二时间段内将分离的一或多种水解成分进一步反复地变换为离子。串联质谱仪640在第二时间段内进一步反复地选择及分裂一或多种水解成分的离子，从而在第二时间段内产生一或多种水解成分的多个产物离子光谱。处理器650从多个产物离子光谱进一步计算一或多种水解成分的产物离子的色谱图。处理器650从色谱图进一步计算一或多种水解成分的经测量浓度。处理器650在一或多种抗生素药物中的抗生素药物的水解成分的经测量浓度大于预定阈值量的情况下进一步报告细菌微生物对抗生素药物的抗性的检测。

在各种实施例中，一或多种抗生素药物包括青霉素。

在各种实施例中，一或多种抗生素药物包括氨苄青霉素。

在各种实施例中，一或多种抗生素药物包括阿莫西林。

在各种实施例中，一或多种抗生素药物包括氯唑西林。

在各种实施例中，一或多种抗生素药物包括哌拉西林/他唑巴坦。

在各种实施例中，一或多种抗生素药物包括头孢噻肟。

在各种实施例中，分离装置620包括c18反相色谱柱。

在各种实施例中，离子源装置630包括正离子电喷雾。

在各种实施例中，串联质谱仪640使用mrm来选择及分裂离子。

用于检测抗生素抗性的方法

图7是根据各种实施例的展示用于检测细菌微生物对一或多种抗生素药物的抗性的方法700的流程图。

在方法700的步骤710中，使用培养装置在第一时间段内培养细菌微生物与一或多种抗生素药物的样品混合物。样品混合物中的一或多种抗生素药物的初始浓度是已知的。

在步骤720中，使用分离装置在第一时间段之后的第二时间段内将一或多种抗生素药物与经培养混合物分离。

在步骤730中，使用离子源装置在第二时间段内将经分离的一或多种抗生素药物反复地变换为离子。

在步骤740中，使用串联质谱仪在第二时间段内反复地选择及分裂一或多种抗生素药物的离子。反复地选择及分裂一或多种抗生素药物的离子会在第二时间段内产生一或多种抗生素药物的多个产物离子光谱。

在步骤750中，使用处理器从多个产物离子光谱计算一或多种抗生素药物的产物离子的色谱图。

在步骤760中，使用处理器从色谱图计算一或多种抗生素药物的经测量浓度。

在步骤770中，使用处理器来比较经测量浓度与初始浓度。

在步骤780中，使用处理器在一或多种抗生素药物中的抗生素药物的经测量浓度比抗生素药物的初始浓度小预定量的情况下报告细菌微生物对抗生素药物的抗性的检测。

虽然结合各种实施例而描述本教示，但不希望将本教示限于此类实施例。相反，本教示涵盖各种替代、修改及等效物，如由所属领域的技术人员将了解。

此外，在描述各种实施例时，本说明书可能已将方法及/或过程呈现为特定步骤序列。然而，在所述方法或过程并不依赖于本文中所阐述的特定步骤顺序的程度上，不应将所述方法或过程限于所描述的特定步骤序列。所属领域的一般技术人员将了解，其它步骤序列可为可能的。因此，本说明书中所阐述的特定步骤顺序不应被认作对权利要求书的限制。另外，不应将涉及方法及/或过程的权利要求限于按所书写的顺序执行其步骤，且所属领域的技术人员可容易地了解，序列可变化且仍保持在各种实施例的精神及范围内。