本发明涉及在丝状真菌中生产重组多肽的方法，所述丝状真菌经遗传修饰以降低或消除纤维素酶调节物1(CLR1)的活性并表达所述重组多肽。该方法还涉及经降低或消除CLR1活性的遗传修饰的丝状真菌嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)，以及该丝状真菌在生产重组多肽中的用途。发明背景已显示丝状真菌是用于生产多种蛋白质的优异宿主。真菌菌株如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)和毁丝霉属(Myceliophthora)已被应用于大范围的酶的工业生产，因为它们可以将大量蛋白质分泌入发酵肉汤中。这些真菌的蛋白质分泌能力使它们成为特定酶或酶混合物靶向生产的优选宿主。然而，通常，这些宿主分泌许多不同酶的混合物，使得粗蛋白质产物不明确并且对于目的蛋白质需要复杂的纯化方案。即使在编码目标酶的基因通过遗传修饰过度表达的情况下，目标酶也只构成总分泌蛋白的一小部分。因此，非常需要提供一种真菌生产系统，其能够分泌大量的特定酶而不存在高水平的其他蛋白质。这样的生产系统将能够生产相对纯的酶和简化的大规模纯化所需的酶。所产生的酶可以用于不同的应用，例如，用于食品和饲料应用、洗涤剂或家庭护理以及植物生物质水解(生物燃料和化学品)、纺织品整理以及造纸和纸浆工业。WO2010/107303A2描述了嗜热毁丝霉菌株的UV诱导的诱变，这导致产生少量内源性纤维素酶和蛋白酶的分离物。Visser等人(2011)IndustrialBiotechnology7(3)：214-223公开了称为LC(低纤维素酶)菌株的嗜热毁丝霉菌株，所述菌株几乎丧失了其全部产生纤维素酶的能力。然而，仍然需要一种用于在丝状真菌中生产重组多肽的有效方法。发明目的和概述这个需求由本发明解决。本发明人出人意料地发现丝状真菌如嗜热毁丝霉中纤维素酶调节物1(CLR1)活性的降低导致具有产生增加纯度的重组多肽的能力的菌株。因此，一方面，本发明提供了一种在丝状真菌中生产重组多肽的方法，该丝状真菌被遗传修饰以与不具有该遗传修饰且与被遗传修饰的丝状真菌在相同条件下培养的丝状真菌相比降低或消除了CLR1的活性，并且该丝状真菌被进一步遗传修饰以表达所述重组多肽，其中该重组多肽在不能被CLR1活化的启动子的控制下表达，所述方法包括：(i)在不含有能够诱导CLR1活性的纤维素或其纤维素衍生物的培养基中生长所述经遗传修饰的丝状真菌；和(ii)从培养基中分离重组多肽。另一方面，本发明提供了一种在丝状真菌中生产重组多肽的方法，该丝状真菌被遗传修饰以与不具有该遗传修饰且与被遗传修饰的丝状真菌在相同条件下培养的丝状真菌相比降低或消除CLR1的活性，并且该丝状真菌被进一步遗传修饰以表达所述重组多肽，其中该重组多肽在不能被CLR1活化的启动子的控制下表达，所述方法包括：(i)在不含有能够诱导CLR1活性的纤维素或其纤维素衍生物的培养基中生长所述经遗传修饰的丝状真菌；和(ii)从培养基中分离重组多肽。丝状真菌可以是嗜热毁丝霉菌。另一方面，本发明涉及一种丝状真菌嗜热毁丝霉，其经遗传修饰以与不具有该遗传修饰且与被遗传修饰的丝状真菌在相同条件下培养的丝状真菌相比降低或消除CLR1的活性，并且该丝状真菌被进一步遗传修饰以表达重组多肽，其中所述重组多肽在不被CLR1活化的启动子的控制下表达。另一方面，本发明涉及一种丝状真菌嗜热毁丝霉，其经遗传修饰以与不具有该遗传修饰且与被遗传修饰的丝状真菌在相同条件下培养的丝状真菌相比降低或消除CLR1的活性，并且该丝状真菌被进一步遗传修饰以表达重组多肽，其中所述重组多肽在不被CLR1活化的启动子的控制下表达。重组多肽可以是异源多肽。在本发明的方法或丝状真菌的一个实施方案中，重组多肽是水解酶。在一个实施方案中，所述遗传修饰的丝状真菌能够以比所述不具有遗传修饰且与遗传修饰的丝状真菌在相同条件下培养的丝状真菌更高的纯度积累重组多肽。CLR1活性的降低或消除可能是由于编码CLR1蛋白的核酸分子表达的减少或消除。在一个实施方案中，编码CLR1蛋白的核酸分子包含选自以下的核酸序列：(a)根据SEQIDNo.1或2的核酸序列或其功能部分；(b)编码根据SEQIDNo.3的多肽或其功能部分的核酸序列；和(c)编码具有CLR1活性且与根据SEQIDNo.1或2的核酸序列具有至少70％序列同一性的多肽的核酸序列。丝状真菌可以包含至少一种额外的遗传修饰。所述至少一种额外的遗传修饰可以降低或消除CLR1以外的转录因子的活性，优选地降低或消除木聚糖酶调节物1(XYR1)的活性。额外地或备选地，所述至少一种额外的遗传修饰可以降低或消除蛋白酶，优选地碱性蛋白酶1(ALP1)的活性。另一方面，本发明涉及降低或消除CLR1活性的核酸构建体用于提高丝状真菌中产生的重组多肽的纯度和/或量的用途。CLR1的活性可以通过减少编码CLR1蛋白的核酸分子的表达来降低。在一个实施方案中，编码CLR1蛋白的核酸分子包含选自以下的核酸序列：(a)根据SEQIDNo.1或2的核酸序列或其功能部分；(b)编码根据SEQIDNo.3的多肽或其功能部分的核酸序列；和(c)编码具有CLR1活性且与根据SEQIDNo.1或2的核酸序列具有至少70％序列同一性的多肽的核酸序列。又一方面，本发明涉及如本文所定义的丝状真菌用于生产重组多肽的用途。附图简述：图1示出了亲本菌株(HC-manT；空心方块)和clr1基因缺失的菌株(HC_manT_Δclr1#α；实心圆圈)的甘露聚糖酶比活性，以总的U/mg蛋白质表示，其中蛋白质在培养期间不同的时间点获得。图2示出了来自亲本菌株HC_manT和clr1缺失菌株HC_manT_Δclr1#α的发酵样品的上清液的SDS-PAGE分析。加载等量的总蛋白质。图3示出了与亲本菌株UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70相比，来自clr1缺失菌株UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70Δclr1#α的等体积上清液的SDS-PAGE分析。发明详述本发明涉及允许在丝状真菌中生产重组多肽的改良手段和方法，所述丝状真菌经遗传修饰以降低或消除CLR1的活性并表达重组多肽。尽管将针对特定实施方案描述本发明，但是本说明书不应被解释为限制意义。在详细描述本发明的示例性实施方案之前，给出对于理解本发明重要的定义。如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式的“一”和“一个”还包括各自的复数形式。在本发明的上下文中，术语“大约”和“约”表示本领域技术人员将理解的仍然确保所讨论特征的技术效果的准确性区间。该术语通常表示与指示数值±20％，优选±15％，更优选±10％，甚至更优选±5％的偏差。应该理解，术语“包括/包含”不是限制性的。为了本发明的目的，术语“由...组成”被认为是术语“包括/包含”的优选实施方案。如果在下文中将组定义为包含至少一定数量的实施方案，这也意味着还涵盖优选仅由这些实施方案组成的组。此外，在说明书和在权利要求书中的术语“第一”，“第二”，“第三”或“(a)”，“(b)”，“(c)”，“(d)”等以及类似术语用于区分相似的要素，而不一定用于描述序贯的或时间的顺序。应该理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施方案能够以不同于本文描述或示出的其他顺序操作。在术语“第一”，“第二”，“第三”或“(a)”，“(b)”，“(c)”，“(d)”，“i”，“ii”等涉及方法或用途或测定法的步骤的情况下，步骤之间没有时间间隔的一致性或有时间间隔的一致性，即步骤可以同时进行、或者在这些步骤之间可以存在秒、分钟、小时、天、周、月或甚至数年的时间间隔，除非在申请中如在本文上面或下文中所述那样另外指出。应该理解，本发明不限于本文所述的具体方法学，方案，试剂等，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不意图限制仅由所附权利要求限制的本发明的范围。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。如上所述，本发明在一个方面涉及在丝状真菌中生产重组多肽的方法，该丝状真菌被遗传修饰以与不具有该遗传修饰且与被遗传修饰的丝状真菌在相同条件下培养的丝状真菌相比降低或消除CLR1的活性，并且该丝状真菌被进一步遗传修饰以表达所述重组多肽，所述方法包括：(i)在合适的培养基中培养所述遗传修饰的丝状真菌；和(ii)从培养基中分离重组多肽。如本文所用，术语“重组多肽”是指通过重组手段在宿主细胞中产生的任何多肽，即通过用核酸分子转化宿主细胞，所述核酸分子控制由核酸分子编码的重组多肽的表达。在一个方面，重组多肽是由用于其产生的细胞天然表达的多肽，但以比未转化的宿主细胞更高的量表达。这种多肽也被称为“同源多肽”。在另一方面，重组多肽不是由用于其产生的细胞天然表达的，因此它只能在转化的宿主细胞中检测到。这种多肽也被称为“异源多肽”。优选地，重组多肽是异源多肽。在本发明中，重组多肽可以是重组水解酶。水解酶是催化化学键水解的酶。水解酶的实例是酯酶，脂肪酶，磷酸酶和肽酶，并且包括核酸酶、糖苷酶和蛋白酶。脂肪酶水解脂质中的羧酸和醇之间的酯键，和磷酸酶类似地作用于磷酸酯。核酸酶是水解核酸的磷酸酶。糖苷酶水解碳水化合物中糖分子之间的键。蛋白酶水解蛋白质分子内一个氨基酸的羧酸基团与另一个氨基酸的氨基之间的肽键。糖苷酶包括催化葡糖苷水解的葡糖苷酶和催化基于木糖的均聚物木聚糖切割的木聚糖酶。葡糖苷酶的具体实施方案包括甘露聚糖酶，乳糖酶，昆布多糖酶(laminaridase)，淀粉酶，葡糖淀粉酶，几丁质酶，蔗糖酶，麦芽糖酶，神经氨酸酶，转化酶，透明质酸酶，溶菌酶，纤维素酶和半纤维素酶。在一个实施方案中，重组多肽是不同于纤维素酶的水解酶。在一个实施方案中，重组多肽在启动子控制下表达，即编码重组多肽的核酸序列与所述启动子有效连接，所述启动子在遗传修饰的丝状真菌中有功能并且是不能被CLR1活化的。在WO2013/022594A1的表1A中公开了由CLR1活化的基因，由此这些基因的启动子不适于调节本发明中的重组多肽的表达，所述基因公开为在clr突变体中未显示诱导的基因。WO2013/022594A1的表1A中公开的基因包括参与氨基酸代谢的基因，编码纤维素酶和半纤维素酶的基因以及参与寡糖和多糖降解的其他酶，编码δ-氨基乙酰丙酸脱水酶，5-氨基乙酰丙酸合酶，磷酸吡哆胺氧化酶，半乳糖激酶，脂肪酶，核分离蛋白，多萜基磷酸(dolichyl-phosphate)β-葡糖基转移酶，线粒体DNA复制蛋白YHM2，线粒体内膜蛋白酶亚基2，核伸长和变形蛋白1，钟控信息素CCG-4，钙稳态蛋白Regucalcinendothiapepsin，参与核苷酸代谢，蛋白质折叠，蛋白质修饰，rRNA产生，易位和转运的基因，转录因子的基因。技术人员还可以容易地确定启动子是否被CLR1活化。为此，待测试的启动子可以与编码报告蛋白例如萤光素酶，绿色荧光蛋白或β-葡糖醛酸糖苷酶的核酸序列有效连接，并转化到clr1缺陷宿主细胞中。如果在clr1缺陷型宿主细胞中报告蛋白的表达减少少于50％，则启动子不被CLR1活化，因此可用于在遗传修饰的宿主细胞中表达重组多肽。如果在clr1缺陷型宿主细胞中报告蛋白的表达降低超过50％，则启动子被CLR1活化，因此不适合在遗传修饰的宿主细胞中表达重组多肽。表1中列出了其表达不被CLR1活化的基因。这些基因的启动子可用于表达重组多肽。表2中列出了其表达被CLR1活化的基因。这些基因的启动子不适于在本发明中表达重组多肽。表1：表2：可用于表达重组多肽的合适启动子包括根据SEQIDNo.11的chi1基因的启动子和根据SEQIDNo.12的延伸因子1-α基因的启动子。其他合适的启动子公开于WO2010/107303A2并且包括hex1启动子、his2a启动子和gla启动子。所有上述启动子都不能被CLR1活化。本领域技术人员还知晓通常可用于表达重组多肽的其他合适的启动子。这些启动子包括来源于其他丝状真菌的启动子，如来自丝状真菌如曲霉属(Aspergillus)，镰孢属(Fusarium)，腐质霉属(Humicola)，毁丝霉属(Myceliophthora)，脉孢菌属(Neurospora)，青霉属(Penicillium)，蓝状菌属(Talaromyces)和木霉属(Trichoderma)的gpd(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)，pdc(丙酮酸脱羧酶)，eno(烯醇酶)，trpC(色氨酸生物合成蛋白)，pda(丙酮酸脱氢酶)，glaA(葡糖淀粉酶)，tpi(丙糖磷酸异构酶)，icl(异柠檬酸裂合酶)，tef1(延伸因子1)和kdh(酮戊二酸脱氢酶)启动子。用于表达重组蛋白质的表达构建体可以含有其他元件，例如编码能够将重组多肽分泌到培养基中的信号肽的核酸序列和一个或多个在丝状真菌中有功能的终止子。宿主细胞可以包含在基因组中多于一个拷贝的编码所述重组多肽的核酸序列。在另一个实施方案中，重组多肽的表达可以通过密码子使用的优化来传递，例如，通过将编码重组多肽的核酸序列的密码子使用向生物体中最常转录或表达的或最高度表达的基因(与持家基因例如β-肌动蛋白或β-微管蛋白相比)的密码子使用进行适应。这种高度表达基因的密码子使用的例子可以包括丝状真菌，优选嗜热毁丝霉的5、10、15、20、25或30个或更多个最高度表达的基因的组的密码子使用。过表达可以进一步通过优化相对于丝状真菌，优选嗜热毁丝霉的转录基因的全部或几乎全部或者90％或80％或75％或70％的总体密码子使用的密码子使用来实现。这种方法可涉及基因密码子使用的检查，以及与可从丝状真菌，优选嗜热毁丝霉的基因组序列(特别是生物体的注释基因组序列)得到的总体密码子使用进行比较。重组多肽在遗传修饰的丝状真菌中的表达可通过本领域已知的任何方法检测和定量，包括Western印迹，Northern印迹和RT-PCR。如果重组多肽是酶，则其表达也可以通过测量酶活性来检测。用于确定植酸酶和甘露聚糖酶(mannanase)活性的合适测定法在本文的实施例部分中描述。如本文所用的术语“丝状真菌”是指包括真菌亚门和卵菌纲的所有丝状形式的真核微生物(如由Hawksworth等人Ainsworth&Bisby'sDictionaryoftheFungi.第8版，CABInternational，Wallingford所定义)。丝状真菌的特征在于包含几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复合多糖的菌丝体壁。通过菌丝伸长而发生营养生长并且碳分解代谢专性好氧。丝状真菌菌株包括但不限于支顶孢菌属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、伞菌属(Agaricus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Corynascus、金孢菌属(Chrysosporium)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镜抱菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻痕菌属(Magnaporthe)、红曲霉属(Monascus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Mortierella、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉抱菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、Phanerochaete、柄抱壳菌属(Podospora)，红孔菌属(Pycnoporus)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、Sordaria、篮状菌属(Talaromyces)、Rasamsonia、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭抱壳菌属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)菌株。可以用于本发明的优选的丝状真菌菌株属于黑曲霉(Aspergillusniger)，米曲霉(Aspergillusoryzae)，烟曲霉(Aspergillusfumigatus)，产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)，桔青霉(Penicilliumcitrinum)，产孢枝顶孢霉(Acremoniumchrysogenum)，里氏木霉(Trichodermareesei)，埃默森拉默萨姆氏菌(Rasamsoniaemersonii，以前称为Talaromycesemersonii)，酱油曲霉(Aspergillussojae)和嗜热毁丝霉(Myceliophtorathermophila，以前称为Chrysosporiumlucknowense)。最优选地，丝状真菌是嗜热毁丝霉。如本文所用，术语“遗传修饰的丝状真菌”是指通过诱变和选择和/或遗传工程改造的丝状真菌的野生型物种的修饰，或指对已经遗传修饰的生物体的进一步修饰，例如，先前用一种或多种除clr1基因以外的基因工程改造的丝状真菌菌株。本发明的遗传修饰是降低或消除CLR1活性的修饰。如本文所用，术语“不具有遗传修饰的丝状真菌”是指未经遗传修饰以降低或消除CLR1的活性并且除此之外具有与在本发明中使用的遗传修饰的丝状真菌相同的遗传结构的丝状真菌，即与本发明的遗传修饰的丝状真菌的唯一遗传差异是降低或消除CLR1活性的本发明的遗传修饰。因此，不具有遗传修饰的丝状真菌是在本发明中引入降低或消除CLR1活性的遗传修饰的亲本菌株。亲本菌株至少包含进一步的遗传修饰以表达重组多肽，但也可以包含额外的遗传修饰。丝状真菌可以进一步包含遗传修饰以能够选择转化的细胞。这类修饰的实例包括编码乳清苷5'-磷酸脱羧酶的pyr4基因的缺失和编码尿苷5'单磷酸合酶的pyr5基因的缺失。两种基因都参与尿嘧啶的生物合成，因此缺失任何这些基因的细胞不能在缺乏尿嘧啶和尿苷的培养基上生长，除非它们经过遗传修饰以弥补这种缺陷。丝状真菌的另一种遗传修饰可以是缺失编码Ku70的基因，所述Ku70参与非同源端连接(non-homologousend-joining；NHEJ)介导的修复。如本文所用的术语“在合适的培养基中培养所述遗传修饰的丝状真菌”是指使用本领域技术人员已知的任何合适的手段和方法，其允许如本文所定义的丝状真菌的生长，并且其适合于重组多肽的生产。生长可以以分批或补料分批工艺或在连续发酵工艺中进行。优选地，培养基不含有能够诱导CLR1活性的纤维素或其任何衍生物。进行分批、补料分批或连续发酵工艺的方法是本领域技术人员熟知的并且在文献中有描述。培养可以在特定的温度条件下进行，例如，在15℃和50℃之间，优选在20℃和47℃之间，更优选在32℃和45℃之间，最优选在38℃和42℃之间。培养可以在pH5至pH8.5，优选pH5.5至7.5，更优选pH6至7，最优选6至6.7之间的pH进行。合适的发酵培养基包含本领域已知的碳源、氮源、磷酸盐、硫和痕量元素，但不限于以下组分：作为碳源，可以使用单糖、二糖和多糖，像葡萄糖，右旋葡萄糖，果糖，木糖，蔗糖，麦芽糖，乳糖。也可以使用复杂的碳源，像纤维素，乳清，玉米淀粉，麦麸，淀粉麦芽提取物，甜菜糖蜜，赤糖糊，甘蔗糖蜜，脂肪酸或大豆油。可应用本领域已知的任何复杂合适的氮源，包括但不限于玉米浆液体/固体，干蒸馏物可溶物，酵母，鱼或骨粉，肉或酵母提取物，玉米胚芽或麸质粗粉，蛋白质蛋白胨，水解产物和酪蛋白的消化物，酵母，棉籽，牛奶蛋白或大豆蛋白，大豆粉，花生粉，米糠或Pharmamedia。备选地，可以使用无机氮源如氨或其盐，有机氮源如尿素和/或氨基酸。除了碳源和氮源之外，培养基还可以提供各种有机或无机化合物，其提供硫，磷，铁，镁，锌和其他对于细胞生长、活力和目的蛋白质生产至关重要的元素。在下面的实施例中也描述了合适的培养基。如本文所用的措词“从培养基中分离重组多肽”是指用于从培养基的细胞碎片和成分中分离重组多肽的任何合适的方法。本领域已知的合适的分离技术包括但不限于过滤，微滤，超滤，离心，提取，喷雾干燥，蒸发，冷冻干燥和沉淀。重组多肽可以通过本领域已知的多种方法进一步纯化，包括但不限于硫酸铵沉淀或其他蛋白沉淀方法，离子交换层析，亲和层析，疏水相互作用层析，尺寸排阻层析或电泳操作。如本文所用的术语“遗传修饰丝状真菌”或“遗传修饰的丝状真菌”是指丝状真菌通过本领域技术人员已知的任何合适的遗传手段和方法改变。类似地，如本文所用，术语“遗传修饰的丝状真菌”是指通过本领域技术人员已知的任何合适的遗传手段和方法修饰或改变丝状真菌，使得CLR1的活性降低或消除，并且重组多肽被表达。用于遗传修饰丝状真菌的方法是本领域技术人员已知的并且在文献中描述。它们包括用于将遗传元件或物质引入丝状真菌以便包含在丝状真菌中，整合到染色体或染色体外，或去除或破坏或修饰丝状真菌基因组中天然存在的遗传元件或序列的常用的方法。如本文所用的术语“遗传元件”是指能够运输遗传信息的任何分子单位。因此它涉及基因，优选地涉及天然基因，嵌合基因，外源基因或转基因。术语“基因”是指表达特定蛋白质或多肽的核酸分子或其片段，优选其指包括编码序列上游(5'非编码序列)和下游(3'非编码序列)的调控序列的核酸分子。术语“天然基因”是指在自然界中发现的，例如，在野生型丝状真菌中，具有其自身的调控序列的基因。术语“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含在自然界中未发现在一起的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或源自相同来源的调控序列和编码序列，但以不同于自然界中发现的方式排列，使得调控序列和编码序列来源于相同生物体的不同基因。根据本发明，“外源基因”是指通常不在该丝状真菌中发现、但通过遗传操作将其引入丝状真菌中的基因。外源基因可以包含在引入它们的生物体以外的生物体中天然的基因或是嵌合基因。术语“转基因”是指已经通过转化操作被引入基因组的基因。术语“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。术语“调控序列”是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列可以包括启动子，增强子，翻译前导序列，内含子，聚腺苷酸化识别序列，RNA加工位点，效应子结合位点和茎环结构。术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3'。启动子可以全部来源于自天然基因，或由来源于自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA片段。通常，由于调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。本领域技术人员可以理解，不同的启动子可以指导处于不同发育阶段或者响应不同的环境或生理条件的基因表达。在大多数时间导致基因在大多数细胞类型中表达的启动子通常被称为组成型启动子。另一方面，仅在特定情况下导致基因表达的启动子，例如基于特定因子的存在，生长阶段，温度，pH或特定代谢物的存在等导致基因表达的启动子，被理解为可调节启动子。术语“3'非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列。它包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。聚腺苷酸化信号的特征通常在于影响向mRNA前体的3'端添加一段聚腺苷酸。3'非编码序列可以影响相关编码序列的转录，即RNA转录本的存在，RNA加工或稳定性或翻译。术语“RNA转录本”是指由DNA序列的RNA聚合酶催化的转录产生的产物。当RNA转录本是DNA序列的完美互补拷贝时，其被称为初级转录本，或者其可以是源自初级转录本的转录后加工的RNA序列，并且被称为成熟RNA。术语“mRNA”是指信使RNA，即没有内含子并且可以被细胞翻译成蛋白质的RNA。术语“有效连接”是指核酸序列在单个核酸片段上的缔合，使得一个核酸序列的功能受另一个的影响。在启动子的背景下，该术语意指编码序列处于启动子的转录控制之下。在本发明的一个中心实施方案中，丝状真菌的遗传修饰降低或消除了CLR1的活性。术语“CLR1”是指锌双核簇转录因子，其与某些基因的启动子区域结合并刺激基因表达。在本发明的优选实施方案中，CLR1活性由包含SEQIDNO：3的氨基酸序列或其功能部分或片段，基本上由其组成或由其组成的多肽提供，或由包含SEQIDNO：1或2的核苷酸序列或其功能部分或片段，基本上由其组成或由其组成的核酸编码，或由包含与SEQIDNO：3的氨基酸序列或其功能部分或片段具有至少约50％，52％，54％，56％，58％，60％，62％，64％，66％，68％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成的多肽提供，或由与SEQIDNO：1或2的核苷酸序列或其功能部分或片段具有至少约50％，52％，54％，56％，58％，60％，62％，64％，66％，68％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸编码，并且编码与具有SEQIDNo.3的多肽基本相同的活性(即CLR1活性)的多肽，其意指结合靶基因的启动子区域内的DNA并活化转录。根据SEQIDNo.1的序列是clr1基因的cDNA序列，并且根据SEQIDNo.2的序列是包含clr1基因的基因组区域。在一个优选的实施方案中，仅使用编码CLR1的基因组区域，其对应于SEQIDNo.2的核苷酸3001至5245。因此，上述百分比序列同一性的值也适用于包含SEQIDNo.2的核苷酸3001至5245的序列。术语“功能性片段”或“功能性部分”旨在指具有与具有SEQIDNo.3的多肽基本相同的活性(即CLR1活性)的多肽的较小的连续部分，其表示结合靶基因的启动子区域内的DNA并活化转录。SEQIDNo.3的氨基酸序列的功能片段具有至少200或250个氨基酸的长度，优选至少300或350个氨基酸，更优选至少400或450个氨基酸，甚至更优选至少500或550个氨基酸，和最优选至少600至650个氨基酸。锌(2)-半胱氨酸(6)双核簇结构域位于SEQIDNo.3的135至171位，并显示于SEQIDNo.4中。因此，如上所定义的功能片段优选位于氨基酸80至280或氨基酸80至330之间，更优选在氨基酸80至380之间或氨基酸80至430之间，甚至更优选在氨基酸80至480，氨基酸80至530或氨基酸80至580之间，和最优选在氨基酸80至630或氨基酸80至680之间。在一个备选的实施方案中，提供CLR1活性的多肽包含与SEQIDNO：3的氨基酸序列具有至少约50％，52％，54％，56％，58％，60％，62％，64％，66％，68％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性，并且在对应于SEQIDNo.3的位置135至171的位置包含根据SEQIDNo.4的氨基酸序列的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在本发明的含义内，“序列同一性”表示与另一种核酸分子相比核酸分子内关于5'至3'序列的一致性程度。序列同一性可以使用基于各种算法的一系列程序确定，所述程序例如BLASTN，ScanProsite，激光基因软件等。作为替代方案，国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的BLAST程序包(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)可以与默认参数一起使用。另外，可以采用使用用于序列比较的“dirtydata”算法的程序Sequencher(GeneCodesCorp.，AnnArbor，MI，USA)。将两种蛋白质或核酸序列之间的同一性定义为用2011年4月可用版本中的程序needle计算得到的同一性。Needle是可免费获得的程序包EMBOSS的一部分，其可以从网站http：//emboss.sourceforge.net/下载。使用的标准参数是：gapopen10.0(“空位开放罚分”)，gapextend0.5(“空位延伸罚分”)，在蛋白质情况下的数据文件EBLOSUM62(矩阵)和在ONA情况下的数据文件EONAFULL(矩阵)。序列同一性是指根据SEQIDNo.1或2的核酸序列的700、800或900个核苷酸，优选1000、1100、1200、1300或1400个核苷酸，更优选1500、1600、1700、1800或1900个核苷酸的长度上，并且最优选全长长度的序列同一性程度。序列同一性是指根据SEQIDNo.3的氨基酸序列的300、350或400个氨基酸，优选450、500或550个氨基酸，更优选600、630、660或680个氨基酸的长度上，并且最优选全长长度的序列同一性程度。如上所讨论的CLR1变体的活性，即根据SEQIDNo.3的蛋白质的功能片段或与根据SEQIDNo.3的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性的蛋白质可以使用本领域技术人员已知的合适的测试或测定法进行测量，或者可以从合适的文献来源获得。例如，已知含有CLR1结合位点的启动子例如纤维素酶启动子可以与编码蛋白质例如绿色荧光蛋白(GFP)，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或萤光素酶的报告基因有效连接并与编码其活性待测试的CLR1变体或野生型CLR1蛋白的核酸分子一起转染入合适的宿主细胞。然后，可以比较用该变体转染的细胞与用野生型蛋白转染的细胞中的报告基因的表达。如上所述，由CLR1活化的启动子在上面的表2和WO2013/022594A1中公开。术语“基本上相同的活性”是指具有SEQIDNO.3的多肽的CLR1活性的至少50％或55％，优选至少60、65或70％，更优选至少75、80、85或90％，最优选至少92、94％、96％、98％或99％的多肽，即通过将如上所述的报告基因构建体与变体温育产生的报告蛋白的量为通过将相同的报告基因构建体与SEQIDNO.3的多肽一起温育产生的报告蛋白的量的至少50％或55％，优选至少60、65或70％，更优选至少75、80、85或90％，最优选至少92、94、96、98或99％或更多。如本文所用的术语“活性降低”或“量减少”是指编码CLR1蛋白的遗传元件的任何修饰，例如，在分子基础上，由遗传元件表达的转录本或由所述遗传元件编码的蛋白质或活性，其导致所述CLR1活性降低，细胞中所述CLR1活性浓度降低和/或所述CLR1活性的功能的降低。如本文所用的术语“消除的活性”是指编码CLR1的遗传元件的任何修饰，其导致CLR1活性的完全消除，即，当报告基因构建体与具有遗传修饰以在本文讨论的条件下消除活性的蛋白质或来自细胞的提取物一起温育时，不能检测到报告蛋白。例如，编码活性的遗传元件的修饰可导致与不具有本发明的遗传修饰的生物体相比，优选地与用作引入本发明的遗传修饰的亲本生物体的生物体相比，约5％，8％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％或在这些值之间的任何值的CLR1活性降低。在优选的实施方案中，这样的活性降低由如本文上面定义的SEQIDNO：3的氨基酸序列或其变体表示，包含它，基本上由其组成，或由其组成。在具体的实施方案中，活性的降低是由于遗传元件的表达减少或消除，其中所述遗传元件的表达产生如上所述的活性。如本文所用的术语“表达”是指源自如本文所述的核酸分子或基因的有义链(mRNA)的转录和积累。更优选地，该术语还指将mRNA翻译成多肽或蛋白质并在细胞内相应提供这种多肽或蛋白质。术语“减少的表达”涉及比在相同生物体的背景下产生所述多肽或蛋白质的遗传元件的内源拷贝表达减少的转录本数量和/或减少的多肽或蛋白质数量。在一个特别优选的实施方案中，CLR1活性的降低是由于编码CLR1蛋白的核酸分子的表达降低。在优选的实施方案中，如上所述的降低的表达可导致与不具有本发明的遗传修饰的生物体相比，优选地与用作引入本发明的遗传修饰的亲本生物体的生物体相比，基因转录率降低约5％，8％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％或在这些值之间的任何值。在优选的实施方案中，可以为本文上面定义的SEQIDNO：1或2的核苷酸序列或其变体的转录本提供基因转录率的这种降低。在进一步优选的实施方案中，降低的表达可导致与不具有本发明的遗传修饰的生物体相比，优选地与用作引入本发明的遗传修饰的亲本生物体的生物体相比，基因的mRNA量降低约5％，8％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％或在这些值之间的任何值。在优选的实施方案中，可以为如本文上面定义的SEQIDNO：1或2的核苷酸序列或其变体的转录本提供基因的mRNA量的这种降低。在优选的实施方案中，降低的mRNA的量指包含如本文上面定义的SEQIDNO：1或2的核苷酸序列或其变体的mRNA，基本上由其组成或由其组成的mRNA。又在另一个优选的实施方案中，降低的表达可导致与不具有本发明的遗传修饰的生物体相比，优选地与用作引入本发明的遗传修饰的亲本生物体的生物体相比，CLR1多肽或蛋白质的量减少约5％，8％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％或在这些值之间的任何值。在优选的实施方案中，其量降低的多肽由如本文上面定义的SEQIDNO：3的氨基酸序列或其变体表示，包含它，基本上由其组成或由其组成。本文使用的术语“对照生物体”旨在包括野生型生物体，即不具有任何遗传修饰的生物体，和具有除本发明的遗传修饰(即降低或消除CLR1活性的遗传修饰)之外的一种或多种遗传修饰的生物体。在一个实施方案中，可以通过用弱启动子替代内源clr1基因的启动子来降低CLR1的表达。可用于降低基因表达的本发明设想的启动子可以是组成型启动子或可调节启动子。优选的是启动子是内源性毁丝霉属启动子。在具体的实施方案中，启动子也可以是异源启动子或合成启动子，例如弱的异源启动子或可调节的异源启动子。启动子可以有效连接至编码序列，例如编码CLR1的核酸序列。在一个优选的实施方案中，术语“启动子”是指能够控制编码序列表达的DNA序列，该DNA序列在丝状真菌，更优选嗜热毁丝霉中是有活性的。在本发明的含义内，术语“弱启动子”旨在指这样的启动子，其活性低于在野生型生物体中有效连接至待表达的核酸分子的启动子的活性，即具有比内源性clr1基因的启动子更低活性的启动子。优选地，与在野生型生物体中有效连接至待表达的核酸分子的启动子的活性，即内源性clr1基因启动子的活性相比较，弱启动子的活性低约5％，8％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。技术人员知晓如何确定启动子活性并比较不同启动子的活性。为此目的，启动子通常有效连接于编码报告蛋白例如萤光素酶、绿色荧光蛋白或β-葡糖醛酸糖苷酶的核酸序列，并且确定报告蛋白的活性。备选地或额外地，可以将内源基因的mRNA水平彼此比较，例如，通过定量实时PCR或Northern印迹。在这些测定法中，适合用于本发明的弱启动子将导致标记蛋白的表达或mRNA水平比内源clr1基因的启动子低。在另一个实施方案中，CLR1活性可以通过功能性破坏clr1基因而降低，优选通过核苷酸缺失。缺失可以包括遗传元件的编码(ORF)或非编码部分中的两个或更多个残基的任何区域，例如，从两个残基到整个基因或基因座。在具体的实施方案中，缺失可以影响较小的区域，例如小于约50个连续碱基对的结构域、蛋白质亚部分、重复序列或片段，尽管较大的缺失是优选的。缺失或功能性破坏优选发生在clr1基因的编码序列或ORF内。特别优选的是SEQIDNo.1或2的完整clr1编码序列或其如上定义的变体缺失。还优选的是clr1基因的编码序列的功能部分，即CLR1活性所需部分的缺失。如上所述，锌(2)-半胱氨酸(6)双核簇结构域位于SEQIDNo.3的135至171位。因此，clr1基因的编码序列的功能部分的缺失包含编码锌(2)-半胱氨酸(6)双核簇结构域的序列的一部分，即包含SEQIDNo.3的氨基酸135至171的根据SEQIDNo.3的序列的一部分的缺失。还设想的是在本文上面定义的clr1基因的3'非编码序列中，在本文上面定义的clr1基因的启动子序列(也是5'非编码区)中，或在如本文上面所定义的与clr1基因相关的调控序列中的功能性破坏。这样的功能性破坏或修饰可能导致例如转录本的表达减少或不稳定性，转录起始的困难等，从而提供减少量或完全不存在的酶活性。对于从丝状真菌的基因组，优选从嗜热毁丝霉的基因组中缺失部分或全部内源性clr1基因，优选SEQIDNo.1或2的编码序列或如本文所定义的变体，可以产生含有侧接与内源性clr1基因的序列同源的序列的合适选择标志物的编码序列的构建体。同源序列可以具有约1000至2000bp的长度。但是，原则上也可以使用更小或更大的序列。在将构建体引入细胞后，同源序列将与内源基因的相应序列重组，导致用编码选择标志物的序列替代内源基因。然后可以使用选择标志物来鉴定携带clr1编码序列缺失的菌株。该构建体可以进一步含有位于同源序列和选择标志物的编码序列之间的序列，该序列能够在选择标志物编码序列引入基因组例如lox或FRT位点后将选择标志物编码序列缺失。任选地，选择标记的编码序列可以被分开，使得编码选择标志物的基因的5'部分由第一质粒携带，并且所述基因的3'部分由第二质粒携带。当两种质粒存在于一个细胞内时，编码选择标志物的编码序列的重叠部分重新组合，使得选择标志物变得有功能。第一质粒也携带clr1基因的5'侧翼区，并且第二个质粒也携带clr1基因的3'侧翼区。在进一步的实施方案中，失活也可能是由于clr1的遗传元件的编码区(ORF)和/或非编码区中的突变、重排和/或插入。例如，突变可以是点突变或2或3个核苷酸的交换，这导致编码的氨基酸序列的修饰，或ORF中的一个或多个读框移位的引入，或成熟前终止密码子的引入或终止密码子从ORF中的去除，和/或用于细胞机制例如聚腺苷酸化机制的识别信号的引入或用于蛋白质降解机制的破坏信号的引入等。这些修饰的序列部分可能产生不再提供蛋白质野生型形式活性的蛋白质。这些蛋白质可能因此例如在它们的活性所需的区域中具有取代，导致功能丧失，或者可能包含不同的氨基酸(由于读框移位)并因此不能正常发挥功能。修饰的序列部分可能进一步引起不稳定的转录本，其易于降解。此外，蛋白质的靶向可能会受到降低。一种将点突变引入丝状真菌细胞(优选嗜热毁丝霉细胞)的基因组中的技术是CRISPR(成簇的规则间隔的短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关)系统，其已显示促进RNA引导的位点特异性DNA切割并且可用于基因组工程(参见例如Sander和Young(2014)NatureBiotechnol.32：347-355)。该系统使用Cas9作为由crRNA和tracrRNA指导切割特定DNA序列的核酸酶。成熟的crRNA：tracrRNA复合物通过crRNA上的间隔区和前间隔区邻近基序(protospaceradjacentmotif；PAM)旁边的靶DNA上的前间隔区之间的碱基配对将Cas9引导至靶DNA。然后Cas9介导靶DNA的切割以在前间隔区内产生双链断裂。除了crRNA和tracrRNA之外，可将引导RNA设计成包含模拟tracrRNA-crRNA复合物的发夹(Jinek等人(2012)Science337(6096)：816-821)。又在另一个实施方案中，内源性clr1编码序列可以用编码序列的突变形式替代，所述编码序列的突变形式是这样的编码序列，即，其在转录和翻译时产生与原始CLR1蛋白相比具有一个或多个氨基酸缺失、插入或取代且比原始CLR1蛋白活性低的蛋白。如上所述，CLR1蛋白内SEQIDNo.3氨基酸135至171之间的区域是保守的。该区域内一个或多个氨基酸的取代或缺失将导致降低或消失的活性。因此，在本发明的一个实施方案中，将内源性clr1编码序列用clr1编码序列的突变形式替代，该clr1编码序列的突变形式在编码对应于在所述生物体的基因组中SEQIDNo.3的氨基酸135至171的氨基酸残基的5，6，7或8，优选9，10，11或12，更优选13，14，15，16，17或18，最优选19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30或31个位置处具有突变。又在另一个实施方案中，内源性clr1编码序列可以用另一个编码区替代，所述编码区使用在丝状真菌中不太优选的密码子，优选地在遗传修饰的嗜热毁丝霉中不太优选的密码子。技术人员知晓，取决于细胞中存在的tRNA池，一些编码特定氨基酸的密码子比编码相同氨基酸的其他密码子更不优选。通过使用不太优选的密码子，可以因此降低基因的表达。为了降低CLR1活性的遗传修饰，例如如本文上面或下文所述的导致降低的基因表达的修饰可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行。可以在本上下文中使用的典型方法是靶向同源重组。例如，clr1基因的修饰形式，例如包含弱启动子而不是原始启动子，或选择标志物的编码序列可以侧接与目标内源多核苷酸序列同源的DNA(例如基因的编码区或基因调控区)，在其位置可发生插入。这样的构建体可以使用或不使用选择标志物和/或使用或不使用阴性选择标志物，以转化丝状真菌，特别是嗜热毁丝霉的细胞。通过靶向同源重组插入DNA构建体可导致在原始基因的基因座处插入修饰形式的靶向基因，或导致内源基因的缺失。术语“转化”是指遗传元件、通常是核酸分子、例如包含用于同源重组的构建体的特异性表达盒、或染色体外元件如载体或质粒转移到丝状真菌，特别是嗜热毁丝霉的细胞中，其中所述转移导致遗传稳定的遗传。丝状真菌转化的条件和相应的技术是本领域技术人员已知的。这些技术包括化学转化，优选聚乙二醇介导的原生质体转化，乙酸锂转化，孢子或发芽分生孢子的电穿孔，农杆菌介导的转化，原生质体融合，弹道冲击转化，显微注射或向真菌细胞引入目的基因或核酸分子的任何其他方法。优选地，可以通过选择导入的遗传元件上包含的标志物来鉴定转化的细胞。备选地，分离的标志物构建体可以与目的遗传元件共转化。通常，可以选择转化的细胞在选择性培养基上生长的能力。选择性培养基可掺入抗生素或缺乏未转化细胞生长所必需的因子，如营养素或生长因子。引入的标志物基因可赋予抗生素抗性，或编码必需的生长因子或酶，从而允许在转化宿主中表达时在选择性培养基上生长。如果可以直接或间接检测表达的标志蛋白质，则可以通过检测标志蛋白质来选择转化的细胞。标志蛋白可以单独表达或作为与另一种蛋白的融合物表达。标志蛋白可以例如通过其酶活性来检测。备选地，可以使用抗体来检测标记蛋白或在例如目的蛋白质上的分子标签。表达标志蛋白或标签的细胞可以例如视觉地选择，或通过诸如FACS的技术或使用抗体淘选来选择。优选地，可以使用本领域技术人员已知的在丝状真菌的细胞中起作用的任何合适的标志物。更优选地，可以使用提供对卡那霉素、潮霉素、氨基糖苷G418或诺尔丝菌素(也称为NTC或ClonNAT)有抗性的标志物以及在缺乏氮，尿嘧啶，亮氨酸，组氨酸，甲硫氨酸，赖氨酸或色氨酸的培养基上生长的能力的标志物。当使用如上所述的选择标志物时，例如乙酰胺酶或G418或ClonNAT抗性标志物或任何其他合适的标志物，可使用位于标志物两端侧翼的重组酶识别序列，例如Cre-lox系统的重组酶识别序列。在表达识别该识别序列的相应重组酶后，该系统允许在插入构建体后消除选择标志物并随后重新使用它。还设想使用技术人员已知的其他类似重组酶系统。在具体的实施方案中，标志物也可以与位点特异性核酸酶的靶位点组合，例如，锌指核酸酶(ZFN)或大范围核酸酶(meganucleases)，其能够在体内切割特定的DNA靶序列。这种系统的具体实例是TALEN(转录活化物样效应子核酸酶)系统，即人造限制性酶，其通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生。TAL效应子是通常由黄单胞菌属细菌或相关物种分泌的或由其衍生并已经被修饰的蛋白质。TAL效应子的DNA结合结构域可以包含高度保守的序列并且通常显示与特定核苷酸识别的强关联的序列，其中所述高度保守的序列是例如约33-34个氨基酸，除了第12和第13个氨基酸高度可变(重复可变二残基或RVD)。基于该原理，可以通过选择含有对应于靶基因DNA序列的重复可变二残基的重复区段的组合来工程化DNA结合结构域。TALENDNA切割结构域可以衍生自合适的核酸酶。例如，来自FokI内切核酸酶或来自FokI内切核酸酶变体的DNA切割结构域可用于构建杂合核酸酶。由于作为二聚体发挥功能的FokI结构域的特质，TALEN可以优选作为独立的实体提供。在具体的实施方案中，TALENDNA结合结构域和FokI切割结构域之间的氨基酸残基数目和两个单独的TALEN结合位点之间的碱基数目可以根据待插入到丝状真菌，优选嗜热毁丝霉的基因组中的构建体的序列进行修饰或优化，以提供高水平的活性。可以对TALEN或TALEN组分进行工程改造或修饰以靶向任何目的DNA序列，例如，包含选择标志物的DNA序列，该选择标志物位于待插入生物体基因组的基因的同源端之间。重组所需的酶活性可以如此提供，或者可以将其与选择盒一起提供在构建体上，导致在核酸酶活性开始时将其去除。工程化可以根据合适的方法进行，例如，如Zhang等人(2011)NatureBiotechnol.29：143-148或Reyon等人(2012)NatureBiotechnol.30：460-465所述。用于从丝状真菌细胞(优选嗜热毁丝霉细胞)的基因组中去除标志物序列的另一系统是以上讨论的CRISPR(成簇的规则间隔的短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关)系统。在本发明的一个优选实施方案中，同源重组可按照下文实施例中所述进行。特别优选的是使用包含来自构巢曲霉的分裂(split)乙酰胺酶基因的转化盒，使得能够在无氮培养基上生长，如下所述。一般地，可以在转化盒或表达盒的帮助下将遗传元件导入丝状真菌细胞，优选嗜热毁丝霉细胞。根据本发明，术语“转化盒”是指含有外源基因并且除外源基因之外还具有促进丝状真菌细胞、优选嗜热毁丝霉细胞转化的元件的特定载体。术语“表达盒”是指含有外源基因并且除外源基因之外还具有元件的特定载体，其允许该基因在外来宿主中，特别是在丝状真菌细胞中，优选在嗜热毁丝霉细胞中表达。导致如本文所定义的CLR1活性降低的核酸序列可相应地以本文上面定义的表达盒或转化盒的形式提供在遗传元件上，特别是制备用于通过同源重组实施基因组整合的表达盒或转化盒。还设想了提供质粒或载体。术语“质粒”和“载体”是指通常携带不属于细胞中央代谢部分的基因并且通常以圆形双链DNA片段的形式存在的染色体外元件。更优选地，术语质粒是指本领域技术人员已知的适合于丝状真菌细胞优选嗜热毁丝霉细胞转化的任何质粒，并且特别是指适于在丝状真菌细胞优选嗜热毁丝霉细胞中表达蛋白质的任何质粒，例如能够在其他生物中优选在细菌中，特别是在大肠杆菌中自主复制，并且可以被制备，例如消化，用于丝状真菌细胞，优选嗜热毁丝霉细胞的基因组插入转化的质粒。遗传元件的功能性破坏或缺失以及如上勾勒的在这些遗传元件中点突变的引入可以通过本领域技术人员已知的任何合适方法进行，例如，通过如本文上面所述的同源重组。在进一步的具体实施方案中，失活可能是由于在RNA转录本水平上发生的特定失活过程所致。这种失活可能是由于clr1基因的RNA转录本的序列特异性识别以及这些转录本的随后降解。对于这种方法，可以使用来自高等真核生物中已知的RNA干扰或反义方法。例如在Liu(2010)CellMol.LifeSci.67(22)：3849-3863中讨论了丝状真菌中的RNAi途径。因此，本发明设想提供对clr1转录本特异的siRNA种类。术语“siRNA”是指特定类型的反义分子，即诱导RNA干扰(RNAi)途径的小的抑制性RNA双链。这些分子的长度可以变化并且长度可以在约18-28个核苷酸之间，例如，具有18，19，20，21，22，23，24，25，26，27或28个核苷酸的长度。优选地，该分子具有21，22或23个核苷酸的长度。根据本发明的siRNA分子可以含有与其靶mRNA不同程度的互补性，优选在反义链中。siRNAs可能在有义链和/或反义链的5'或3'端具有不配对的突出碱基。术语“siRNA”包括两条分开链的双链体，以及可形成包含双链体区的发夹结构的单链。优选地，siRNA可以是双链的，其中双链siRNA分子包含第一链和第二链，siRNA分子的每条链长约18至约23个核苷酸，siRNA分子的第一链包含通过RNA干扰与靶RNA具有足够的互补性的核苷酸序列，并且所述siRNA分子的第二链包含与第一链互补的核苷酸序列。这类干扰分子的产生可以通过从可调节启动子产生siRNA来进一步控制和调节。又在本发明的另一个具体实施方案中，失活可能是由于在蛋白质或酶的水平上发生的特定的失活过程。这种失活可能是由于特异性结合分子如小分子与CLR1蛋白的结合。本发明上下文中的“小分子”是指优选具有生物活性的小有机化合物，即生物分子，但优选不是聚合物。这种有机化合物可以具有任何合适的形式或化学性质。该化合物可以是天然化合物，例如次级代谢产物，或人造化合物，它们是从头设计和生成的。在本发明的一个实施方案中，小分子能够阻断CLR1与靶基因的启动子区域的结合，或者能够阻断CLR1的转录活性。例如，小分子可以结合CLR1，从而诱导分子和蛋白质之间的紧密或不可逆的相互作用，从而导致蛋白质或酶的正常(野生型)功能的丧失或降低，例如，如果涉及酶的核心或结合口袋时会如此。用于鉴定和制备此类小分子的方法和技术以及用于测试小分子的测定法是本领域技术人员已知的，并且也在本文中设想。在具体实施方案中，遗传元件可以包含微生物表达系统。此类表达系统和表达载体可含有指导外源蛋白质的高水平表达的调控序列。在本发明的一个优选实施方案中，如本文上面定义的遗传修饰的生物体，例如包含降低或消除所述生物体中CLR1活性的修饰的生物体，例如，来自其基因组缺失了编码CLR1的内源核酸分子或其中clr1的编码序列有效连接至弱启动子的生物体能够积累比不具有本发明的遗传修饰的对照生物体更多的重组多肽。本文使用的术语“对照生物体”是指与用作遗传修饰的起始生物体并经遗传修饰以表达重组多肽的生物体具有相同或非常相似的遗传背景的生物体。优选地，对照生物体可以是用于如本文所述的遗传修饰的生物体。与未经降低或消除CLR1活性的遗传修饰的丝状真菌相比，本发明导致由遗传修饰的丝状真菌产生的重组多肽的纯度增加。术语“增加的纯度”是指重组多肽的量为丝状真菌产生的总蛋白质的至少约50％，优选丝状真菌产生的总蛋白质的至少55或60％，更优选为丝状真菌产生的总蛋白质的至少65％或70％，最优选丝状真菌产生的总蛋白质的至少75％，77％或80％。如果重组多肽是酶，则重组多肽纯度的增加导致每一由遗传修饰的丝状真菌产生的总蛋白质的量中酶比活性增加，其中酶比活性可以以每克蛋白质的酶活性单位表示。因此，重组蛋白的纯度可以通过确定重组酶的比活性来测量。每总蛋白量的酶比活性增加至少约30％或40％，优选至少50％，60％或70％，更优选至少70％，80％或90％，并且最优选至少100％，120％或150％，其中在遗传修饰的丝状真菌培养80至240小时的一段时间后测定酶活性。如本文所述的降低或消除CLR1活性的遗传修饰可导致生物体产生或积累的重组多肽的量与不具有所述降低或消除CLR1活性的遗传修饰的生物体且该生物体在相同的条件下培养的量比较而言，前者增加。在具体实施方案中，增加可取决于进行修饰的生物体的遗传背景和/或修饰的数目和/或活性降低或消除的技术和/或诸如培养条件、培养基条件等的其他因素，或上述任何参数和因素的组合。在具体的实施方案中，由该生物体产生或积累的重组多肽的量与不具有本发明的遗传修饰但被遗传修饰以表达重组多肽的生物体(该生物体在与本发明的遗传修饰生物体相同的条件下培养)相比的增加可以是至少0.3％，0.5％，0.7％，1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％，110％，120％，130％，140％，150％，160％，170％，180％，190％，200％，210％，220％，230％，240％，250％，260％，270％，280％，290％，300％或多于300％。可以如上所述进行重组多肽的产生或积累的测定，并且因此也确定与对照生物体相比在修饰的生物体中该产生的增加。在另一个实施方案中，本发明涉及如本文上面定义的遗传修饰的生物体或使用所述遗传修饰的生物体生产重组多肽的方法，其中所述生物体包含导致CLR1活性降低或消除的遗传修饰，优选如本文上面详细定义的和表达重组多肽的遗传修饰，并且其中所述生物体包含至少一种额外的遗传修饰。如本文所用，术语“额外的遗传修饰”是指如上所定义的生物体的除了本发明的遗传修饰以外还有的任何其他遗传或生物化学修饰，例如，如基因或基因组区域的缺失，基因或基因片段的过度表达等修饰。这种额外的遗传修饰可能已经存在于根据本发明进行遗传修饰的生物体中，或者可以在生物体已经根据本发明进行遗传修饰之后引入。在一个优选的实施方案中，如上定义的生物体的额外遗传修饰涉及对所述重组多肽的纯度和/或量有影响的元件。这些元件包括参与在丝状真菌优选嗜热毁丝霉中高度表达的基因的表达的转录因子，以及参与内源和重组多肽降解的蛋白酶。这种转录因子的一个例子是参与木聚糖酶表达调节的XYR1(木聚糖酶调节物1)(Rauscher等人，(2006)EukaryoteCell5(3)：447-456)。另一个例子是参与纤维素酶表达调控的CLR2。可用于本发明的蛋白酶包括ALP1蛋白酶和WO2012/048334A2和WO2013/048661A1中公开的蛋白酶。因此，额外的遗传修饰可以优选地用丝状真菌(优选地，嗜热毁丝霉)的一个或多个基因xyr1或alp1进行。在进一步优选的实施方案中，额外的遗传修饰可导致至少一种以下改变：(i)XYR1活性降低或消除；和/或(ii)ALP1活性降低或消除。在进一步优选的实施方案中，XYR1的活性由包含SEQIDNO：7的氨基酸序列或其功能部分或片段，基本上由其组成或由其组成的多肽提供，或由包含SEQIDNO：5或6的核苷酸序列或其功能部分或片段，基本上由其组成或由其组成的核酸编码，或由包含与SEQIDNO：7的氨基酸序列或其功能部分或片段，基本上由其组成或由其组成的氨基酸具有至少约50％，52％，54％，56％，58％，60％，62％，64％，66％，68％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的多肽提供，或由包含SEQIDNO：5或6的核苷酸序列或其功能部分或片段，基本上由其组成或由其组成的核苷酸序列具有至少约50％，52％，54％，56％，58％，60％，62％，64％，66％，68％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的核酸编码。根据SEQIDNo.5的序列是xyr1基因的cDNA序列，并且根据SEQIDNo.6的序列是包含xyr1基因的基因组区域。在一个优选的实施方案中，仅使用编码XYR1的基因组区域，其对应于SEQIDNo.6的核苷酸3001至6016。因此，用于百分比同一性的上述值也适用于包含SEQIDNo.6的核苷酸3001至6016的序列。在进一步优选的实施方案中，ALP1的活性由包含SEQIDNO：10的氨基酸序列或其功能部分或片段，基本上由其组成或由其组成的多肽提供，或由包含SEQIDNO：8或9的核苷酸序列或其功能部分或片段，基本上由其组成或由其组成的核酸编码，或由包含与SEQIDNO：10的氨基酸序列或其功能部分或片段，基本上由其组成或由其组成的氨基酸具有至少约50％，52％，54％，56％，58％，60％，62％，64％，66％，68％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的多肽提供，或由包含SEQIDNO：8或9的核苷酸序列或其功能部分或片段，基本上由其组成或由其组成的核苷酸序列具有至少约50％，52％，54％，56％，58％，60％，62％，64％，66％，68％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的核酸编码。根据SEQIDNo.8的序列是alp1基因的cDNA序列，并且根据SEQIDNo.9的序列是包含alp1基因的基因组区域。在一个优选的实施方案中，仅使用编码ALP1的基因组区域，其对应于SEQIDNo.9的核苷酸5001至6547。因此，用于百分比同一性的上述值也适用于包含SEQIDNo.9的核苷酸5001至6547的序列。在本文所述序列的上下文中使用的术语“功能部分或其片段”是指能够提供与全长多肽基本相同的活性的多肽和编码核苷酸序列的连续区段或部分，或者编码能够分别提供与全长多肽基本相同的活性的多肽。多肽的功能部分或片段的活性为全长多肽活性的至少10％，20％，30％或40％，优选至少45％，50％，55％或60％，更优选至少65％，70％，75％或80％，甚至更优选至少82％，85％，88％或90％，最优选至少92％，94％，96％，98％或100％。如果多肽是转录活化物如CLR1，CLR2和XYR1，则该多肽的功能部分或片段与全长多肽具有基本上相同的转录活化活性。如果多肽是蛋白酶如ALP1，则该多肽的功能部分或片段与全长多肽具有基本上相同的蛋白水解活性。在具体的实施方案中，CLR1活性和XYR1活性可以通过上面讨论的任何技术减少或消除，优选通过同源重组减少或消除。在其他具体的实施方案中，CLR1活性和ALP1活性可以通过上面讨论的任何技术减少或消除，优选通过同源重组减少或消除。在其他具体实施方案中，CLR1活性，ALP1活性和XYR1活性可以通过上面讨论的任何技术减少或消除，优选通过同源重组减少或消除。在其他具体的实施方案中，CLR1活性，CLR2活性和XYR1活性可以通过上面讨论的任何技术减少或消除，优选通过同源重组减少或消除。在其他具体的实施方案中，CLR1活性，CLR2活性，ALP1活性和XYR1活性可以通过上面讨论的任何技术减少或消除，优选通过同源重组减少或消除。如果丝状真菌，优选嗜热毁丝霉经遗传修饰以通过分别的复制载体降低或增加多于一种蛋白质的活性，则期望每种载体或质粒具有不同的选择手段并且应该与其他构建体缺乏同源性以保持稳定的表达并防止构建体之间的元件重配。本发明进一步设想使用核酸构建体来降低或消除CLR1的活性，用于增加表达所述重组多肽的丝状真菌中重组多肽的纯度和/或量。可以使用核酸构建体，使得编码的CLR1多肽和活性可以在细胞中以减少的量或浓度提供。CLR1的活性可优选通过用弱启动子取代内源clr1启动子或通过从生物体基因组中缺失编码CLR1的基因或其功能部分来降低。本文上面已经描述了用于基因缺失的启动子和方法等。在进一步的具体实施方案中，可以使用额外的基因来增加丝状真菌中重组多肽的纯度和/或量。这些基因可以包括xyr1，alp1和alp1以外的蛋白酶基因。特别优选的是，使xyr1失活，从而降低或消除XYR1活性；和/或使alp1和/或一种或多种其他蛋白酶基因失活，从而降低或消除ALP1活性和/或一种或多种其他蛋白酶的活性。在具体的实施方案中，这些基因可以如上所述地失活。生物体可以是如本文上面所述的任何丝状真菌，优选嗜热毁丝霉。使用丝状真菌并且特别是嗜热毁丝霉用于增加重组多肽的纯度和/或量可以包括使用合适的发酵环境、营养、从发酵容器的蛋白质提取等。本发明因此设想了相应的方法用于生产如本文上面所定义的重组多肽。在进一步的实施方案中，丝状真菌可以是已经被遗传修饰的生物体。遗传修饰可以是如本文所述的修饰，例如，对重组多肽的纯度和/或量有直接影响，或者可能具有不同的效果，例如，在其他途径中，或涉及除重组多肽之外还有其他生物化学实体的产生，涉及使用某些碳源的可能性，涉及使用某些氮源等的可能性，涉及基因组或基因组区域的稳定性，允许或改进同源重组的步骤，允许异源基因或启动子等的表达，改善细胞的培养行为，例如成丝，菌丝片段化(mycelfragmentation)，pH耐受性，密度耐受性，盐的使用，耐盐性，涉及细胞的产生率，涉及对抗生素的抗性或能有利于重组多肽生产的任何其他性状。本发明的又一方面涉及如本文上面定义的生物体的用途，特别是经遗传修饰的生物体的用途，用于重组多肽生产，其中所述生物体包含上述导致CLR1活性降低或消除的遗传修饰，并且任选地包含进一步的遗传修饰，例如对基因xyr1、alp1和/或编码本文上面定义的除ALP1以外的蛋白酶的基因的修饰。为了说明的目的，提供以下实施例和附图。因此应该理解，这些实施例和附图不应被解释为限制性的。本领域的技术人员将清楚地能够设想对本文阐述的原理的进一步修改。实施例实施例1嗜热毁丝霉的转化文献(WO00/20555，US2012/0005812，Verdoes等人(2007)IndustrialBiotechnology3(1)：48-57)描述了用于转化嗜热毁丝霉原生质体的几种方法。嗜热毁丝霉菌株的原生质体通过在250ml摇瓶中接种100ml具有106个孢子/ml的标准真菌生长培养基，在35℃和250转/分钟温育24小时来制备。通过无菌Myracloth过滤器(Calbiochem)过滤收获菌丝体并用100ml1700mosmolNaCl/CaCl2洗涤。将洗过的菌丝体转移到50ml管中并称重。将3ml新鲜制备的Caylase(Cayla，法国)溶液(在1700mosmolNaCl/CaCl2中的20mg/mlCaylase)与3g菌丝体和15ml1700mosmolNaCl/CaCl2合并并混合。将菌丝体悬浮液在37℃和70转/分钟下温育2-4h直到在显微镜下可见原生质体。通过无菌Myracloth过滤器过滤到无菌50ml管中完成原生质体收获。向流过液中加入25ml冰冷的STC溶液(1.2M山梨醇，50mMCaCl2，35mMNaCl，10mMTris/HClpH7.5)后，离心(2500转/分钟，10分钟，4℃)收获原生质体。原生质体再次在50mlSTC中洗涤并重悬于1mlSTC中。为了转化，将5-10μg的线性化DNA(在两个DNA片段共转化的情况下，1:5的比例用于标志物片段和表达盒片段，而1:1的比例用于分裂标志物构建体的两个片段)，1μl金精三羧酸(ATA)和100μl原生质体悬浮液混合并在室温温育25分钟。然后加入1.7mlPEG溶液(60％PEG4000[聚乙二醇]，50mMCaCl2，35mMNaCl，10mMTris/HClpH7.5)并轻轻混合。在室温温育20分钟后，用STC溶液填充管，离心(10分钟，4℃，2500转/分钟)并弃去上清液。如本领域已知的，将沉淀重新悬浮于剩余的STC中，并铺在选择性培养基平板上(组成取决于所用的标志物)。在37℃将平板温育3-6天后，挑选转化体并在选择性培养基上重新划线。选择性培养基板当使用amdS作为选择标志物时，使用补充了20mM乙酰胺但没有额外氮源的富集最小培养基来选择阳性转化体。如果使用pyr4或pyr5基因作为选择标志物，则使用没有尿苷和尿嘧啶的富集最小培养基来选择阳性转化体。如果使用诺尔丝菌素抗性选择标志物，则培养基含有诺尔丝菌素。通过在FAC培养基琼脂平板上培养进行具有丧失乙酰胺酶功能的克隆的选择。用于amdS选择的富集最小培养基：用于pyr4或pyr5选择的富集最小培养基：用于诺尔丝菌素选择的富集最小培养基：用于amdS标志物去除的选择的FAC-培养基用于amdS标志物去除的选择对携带amdS基因的正确整合的阳性测试克隆选择amdS标志物的除去，所述amdS基因侧接重复的5'-序列，用于在缺失的基因座去除标志物。使用amdS侧翼5'-序列，将通过同源重组除去amdS敲除盒，从而留下缺失基因座的无缺陷的邻近的非编码5'和3'序列。通过在FAC培养基琼脂平板上培养进行具有丧失乙酰胺酶功能的克隆的选择。表达乙酰胺酶的克隆会将氟乙酰胺转化为阻止生长的有毒化合物氟乙酸。检测能够在FAC培养基上生长的克隆在用于amdS选择的富集最小培养基上的生长丧失。通过PCR分析导致amdS标志物丢失的阳性测试克隆，旨在获得在缺失的基因座处的正确重组事件。使用amdS分裂标志物构建体选择具有正确标志物去除的克隆用于进一步敲除。实施例2缺失构建体的产生本领域已知的分裂标志物方法用于产生不同基因的敲除突变体。通过PCR从嗜热毁丝霉的基因组DNA中扩增待破坏基因的1000-2000bp的5'和3'同源区域(“侧翼_A”和“侧翼_B”)并使用本领域已知的标准方法克隆到携带部分分裂标志物基因的质粒中。每个标志物片段本身不具有功能，但在分裂到两个质粒上的两个标志物片段的重叠部分重组后发挥功能。本领域公知的编码来自构巢曲霉的乙酰胺酶的amdS基因用作选择标志物。任选地，以稍微不同的方式构建携带amdS分裂标志物的C端部分的缺失质粒。代替靶向缺失盒的侧翼_B，质粒含有直接接触的侧翼_A和侧翼_B。该构建体的使用导致在分裂标志物系统的两个部分的靶向同源整合之后基因组中侧翼_A的重复。在这种情况下，可以任选地通过第二同源重组步骤去除amdS标志物盒并如本领域已知的用氟乙酰胺选择。使用本领域已知的标准分子生物学技术，基于作为用于对amdS标志物片段进行PCR扩增的模板的载体pH305(SEQIDNO：15)和pGBAAS-1(SEQIDNo.16)克隆普通的amdS分裂标志物缺失质粒pDB40-amdS-5'(SEQIDNO：13)和pDB41-amdS-3'(SEQIDNO：14)。amdS分裂标志物(splitmarker)载体构建体的构建使用本领域已知的标准技术，使用质粒pGBAAS-1(构建细节参见WO98/46772和EP0635574(pGBLA50与pGBAAS-1相同))(SEQIDNO：16)作为模板PCR扩增约1.8kb的含有构巢曲霉gpdA启动子和amdS分裂标志物的N端部分的片段，并克隆到质粒pH305(SEQIDNO：14)中。得到的质粒pDB40-amdS-5'(SEQIDNO：13)含有从碱基142-1044的gpdA-启动子和从碱基1045-1959的amdS分裂标志物的N-端部分。以类似的方式，使用质粒pGBAAS-1(SEQIDNO：16)作为模板，PCR扩增含有C-端amdS分裂标志物的C-端部分和amdS终止子的约1.7kb片段，并克隆到质粒pH305(SEQIDNO：15)。得到的质粒pDB41-amdS-3'(SEQIDNO：14)含有从碱基321-1626的amdS分裂标志物的C端部分和从碱基1627-1976的amdS终止子。clr1缺失质粒使用本领域已知的标准技术，PCR扩增约1.3kb的clr1基因的5'侧翼区(clr1_侧翼_A)，并克隆到携带gpdA启动子和amdS分裂标志物的N端部分的质粒pDB40-amdS-5'(SEQIDNO：13)中。得到的质粒pMT122-Dclr1-A(SEQIDNO：17)含有从碱基95–1378的clr1_侧翼_A以及包括从碱基1389–3206的gpda-启动子和5'-amdS序列的标志物片段。以类似的方式，PCR扩增约1.3kb的clr1基因的3'侧翼区(clr1_侧翼_B)，并克隆到携带amdS分裂标志物的C端部分和终止子区的质粒pDB41-amdS-3'(SEQIDNO：14)中。得到的质粒pMT120-Dclr1-B(SEQIDNO：18)含有从碱基3637-5292的标志物片段和从碱基6-1260的clr1_侧翼_B。所有质粒用SwaI消化以除去载体骨架，并从琼脂糖凝胶中分离含有缺失盒的片段。只有分离的DNA片段后来用于转化。xyr1缺失质粒使用本领域已知的标准技术，PCR扩增约1.5kb的xyr1基因的5'侧翼区(xyr_侧翼_A)，并克隆到携带gpdA启动子和amdS分裂标志物的N端部分的质粒pDB40-amdS-5'(SEQIDNO：13)中。得到的质粒pDB45_Dxyr1_A(SEQIDNO：19)含有从碱基66-1593的xyr1_侧翼_A和从碱基1601-3418的标志物片段。以类似的方式，PCR扩增约1.5kb的xyr1基因的3'侧翼区(xyr1_侧翼_B)。使用重叠引物的标准PCR融合技术，使用5'-和3'-侧翼区的PCR片段作为模板扩增约3kb的xyr1_侧翼_A/侧翼_B融合片段，并克隆到携带amdS分裂标志物的C端部分和终止子区域的质粒pDB41-amdS-3'(SEQIDNO：14)中。得到的质粒pDB58_Dxyr1_AB(SEQIDNO：20)含有从碱基321-1976的标志物片段和从碱基2055-5100的xyr1_侧翼_A/侧翼_B。两种质粒均用SwaI消化以除去载体骨架，并从琼脂糖凝胶中分离含有缺失盒的片段。只有分离的DNA片段后来用于转化。alp1缺失质粒质粒pDalp1-amdS(SEQIDNO：21)用于缺失嗜热毁丝霉的上清液中的主要蛋白酶(ALP1)。WO2010/107303和Visser等人(2011)IndustrialBiotechnology7(3)：214-223提供了该质粒的详细描述。该质粒含有amdS标志物基因，侧翼是来源自cbh基因座的短重复DNA片段。如本领域已知的，该直接重复可以用于通过同源重组除去amdS基因并用氟乙酰胺选择。该缺失标志物盒侧翼是alp1基因的较大基因组片段(1.6和3.6kb)，用于在alp1基因座处进行靶向整合。用此缺失盒进行转化将除去alp1基因的0.7kb的5'编码区和0.2kb的5'-UTR，并因此使蛋白酶失活。用HindIII和NotI消化质粒以除去载体骨架。从琼脂糖凝胶中分离含有缺失盒的片段并用于转化。ku70缺失质粒使用本领域已知的标准技术，PCR扩增约1kb的ku70基因(标识XP_003660551.1)的5'侧翼区(ku70_侧翼_A)，并克隆到携带gpdA启动子和amdS分裂标志物的N端部分的质粒pDB40-amdS-5'(SEQIDNO：13)中。得到的质粒pMT123-Dku70-A(SEQIDNO：22)含有从碱基269-1291的ku70_侧翼_A和含有从碱基1299-3116的gpda-启动子和5'-amdS序列的标志物片段。以类似的方式，PCR扩增约1.1kb的ku70基因的3'侧翼区(ku70_侧翼_B)。使用重叠引物的标准PCR融合技术，使用5'-和3'-侧翼区的PCR片段作为模板扩增约2.1kb的ku70_侧翼_A/侧翼_B融合片段，并克隆到携带amdS分裂标志物的C端部分和终止子区域的质粒pDB41-amdS-3'(SEQIDNO：14)中。得到的质粒pMT124_Dku70_AB(SEQIDNO：23)含有从碱基366-2021的标志物片段和从碱基2015-4150的ku70_侧翼_A/侧翼_B。所有质粒用SwaI消化以除去载体骨架，并从琼脂糖凝胶中分离含有缺失盒的片段。只有分离的DNA片段后来用于转化。实施例3酶表达盒的生成a)manT表达质粒密码子适应的合成基因(GeneArt，ThermoFisherScientificInc.，USA)manT(SEQIDNo.24)编码最初衍生自里氏木霉的甘露聚糖酶的工程化和截短变体(SEQIDNo.25)，其缺乏CBM结构域并且其中天然信号肽被来自嗜热毁丝霉的纤维素酶的信号肽替代。对于甘露聚糖酶manT的过表达，使用通常的表达载体pPchi(1.8)-Tcbh1_NotI。质粒使用来自嗜热毁丝霉的chi1基因的启动子和cbh1基因的终止子来驱动目的基因的表达。WO2010/107303中给出了该质粒的详细描述。使用标准克隆技术，构建manT表达质粒pChi1-manT(SEQIDNO：26)。该质粒含有从碱基6871-1813的启动子序列Pchi，包括从碱基1815-2930的信号序列和从碱基2938-3961的cbh1终止子序列的manT编码序列。用SmaI和NotI消化质粒以除去载体骨架，从琼脂糖凝胶中分离含有manT表达盒的片段。只有分离的DNA片段后来用于转化。b)植酸酶表达质粒使用编码来自细菌来源的合成植酸酶(在WO2012/143862中公开为植酸酶PhV-99；SEQIDNO.28)的合成基因(GeneArt，ThermoFisherScientificInc.，USA)(SEQIDNO：27)构建植酸酶表达质粒。为了分泌植酸酶，将编码衍生自嗜热毁丝霉的信号肽的信号序列加入到植酸酶的成熟序列中。将从TEF(延伸因子1-α)编码基因的上游区域扩增的启动子序列和从嗜热毁丝霉的Cbh1编码基因的下游区域扩增的终止子序列用作调控元件以驱动植酸酶的表达。使用标准PCR融合和克隆技术，基于大肠杆菌标准克隆载体pBSK+(colE1来源，amp抗性，lacZ用于蓝/白筛选)构建表达质粒pMT873(SEQIDNO：29)。该质粒含有来自碱基255-2733的启动子序列Ptef(延伸因子1-α的启动子)，该植酸酶包括从碱基2734-4076的信号序列和从碱基4077-5070的cbh1终止子序列。用EcoRI，SacI和XhoI消化质粒以除去载体骨架，并从琼脂糖凝胶中分离含有植酸酶表达盒的片段。只有分离的DNA片段后来用于转化。实施例4选择标志物表达盒的产生CloneNat标志物质粒合成基因盒PtrpC-Pcnat1由GENEARTAG(Regensburg，德国)从合成的寡核苷酸和/或PCR产物组装(SEQIDNO：30)。该盒含有在构巢曲霉trpC启动子控制下的丝状真菌密码子优化的诺尔斯链霉菌(Streptomycesnoursei)nat1基因(Krügel等人(1993)Gene127：127-131)，并且侧翼是可以用于FLP介导的重组的FRT位点。使用SfiI/SfiI克隆位点将该片段克隆到标准质粒MA-RQ(GENEARTAG，Regensburg，德国)中。该质粒含有ColE1复制起点和氨苄青霉素抗性基因。该质粒含有从碱基370-787的构巢曲霉启动子序列trpC(吲哚-3-甘油-磷酸合酶)和包括从碱基787-1410的终止子区域的诺尔丝菌素乙酰转移酶。用Sac1和Kpn1消化质粒以除去载体骨架，并从琼脂糖凝胶中分离含有诺尔丝菌素乙酰转移酶表达盒的片段。只有分离的DNA片段后来用于转化。实施例5表达manT的嗜热毁丝霉菌株的构建如WO2008/073914中详细描述的，来自C1谱系的具有尿嘧啶营养缺陷型和降低的蛋白酶活性的菌株：嗜热毁丝霉宿主菌株UV18#100.fΔpyr5Δalp1按实施例1中所述用来自质粒pChi1-manT(SEQIDNO：26)的SmaI和NotI消化和分离的manT(参见实施例3)表达构建体和分离的pyr5标志物构建体共转化。从来自C1基因组DNA和标准大肠杆菌克隆载体构建的基因组文库克隆的质粒pMBL71[pyr5](SEQIDNO：31)分离pyr5标志物片段。8kb的BglII片段含有pyr5基因，包括启动子和终止子序列。将转化体在37℃在用于pyr4/5选择的富集最小培养基上温育3-6天，以通过用本领域已知的共转化的pyr5标志物弥补pyr5缺失来选择恢复的尿嘧啶原养型。如本领域已知的，将菌落重新划线并使用对manT表达盒特异的引物对的PCR检查manT表达盒的共整合。选择测试为manT表达构建体阳性的转化体并将其命名为HC_manT。clr1缺失如实施例1中所述，用来自质粒pMT122-Dclr1-A(SEQIDNO.17)和pMT120-Dclr1-B(SEQIDNo.18)的两个分离的SwaI片段以1：1比例共转化不同的嗜热毁丝霉宿主菌株。使用用于amdS选择的富集最小培养基来温育。重新划线后，通过PCR分析转化体中缺失盒在靶向的clr1基因座中的正确整合以及完整clr1基因的消失。选择阳性测试克隆用于进一步表征。这样，在嗜热毁丝霉C1菌株UV18-25，UV18#100.f(在WO2008/073914中详细描述的构建)，UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70和HC_manT中缺失了clr1，产生了菌株UV18-25_Δclr1#α，UV18#100.f_Δclr1#α，UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70Δclr1#α和HC_manT_Δclr1#α。ku70缺失具有受损的非同源端连接(NHEJ)修复系统的菌株具有较高的同源重组率，并且可以通过Ku70的缺失获得。宿主菌株嗜热毁丝霉菌的Ku70缺失突变体可通过用来自质粒pMT123-Dku70-A(SEQIDNo.22)和pMT124_Dku70_AB(SEQIDNO.23)的两个分离的SwaI片段以1：1比例共转化而获得。使用用于amdS选择的富集最小培养基来温育。重新划线后，通过PCR分析转化体中缺失盒在目标ku70基因座中的正确整合以及完整ku70基因的消失。通过用FAC进行反选择，选择去除amdS标志物基因盒的阳性测试克隆。被选择的起始宿主菌株的标志物回收的Δku70突变体可用于进一步的遗传修饰。xyr1缺失如实施例1中所述，用来自质粒pDB45_Dxyr1_A(SEQIDNo.19)和pDB58_Dxyr1_AB(SEQIDNO.20)的两个分离的SwaI片段以1：1比例共转化嗜热毁丝霉宿主菌株UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70，允许稍后去除标志物。使用用于amdS选择的富集最小培养基来温育。重新划线后，通过PCR分析转化体中缺失盒在目标xyr1基因座中的正确整合以及完整xyr1基因的消失。阳性测试克隆表示为UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70Δxyr1#β，并被选择用于进一步表征以及用于标志物去除。xyr1敲除菌株中的clr1缺失从UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70Δxyr1#β中成功地进行amdS选择标志物的标志物去除导致嗜热毁丝霉菌株UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70Δxyr1，其如实施例1所述用来自质粒pMT122-Dclr1-A和pMT120-Dclr1-B的两个分离的SwaI片段以1：1比例共转化。使用用于amdS选择的富集最小培养基来温育。重新划线后，通过PCR分析转化体中缺失盒在靶向的clr1基因座中的正确整合以及完整clr1基因的消失。阳性测试克隆表示为UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70Δxyr1Δclr1#α，并被选择用于进一步表征。实施例6产生植酸酶的嗜热毁丝霉菌株的生产为了表达植酸酶，如实施例1中所述，用来自质粒pMT873(SEQIDNO：29)的EcoRI、ScaI和XhoI消化和分离的植酸酶(参见实施例3)的表达构建体和来自质粒PtrpC-Pcnat1(SEQIDNO：30)的Sac1和Kpn1消化且分离的nat1标志物表达构建体共转化不同的嗜热毁丝霉菌株。如本领域已知的，将转化体在37℃在富集最小培养基上培养3-6天用于诺尔丝菌素选择以选择诺尔丝菌素抗性。如本领域已知的，将菌落重新划线并使用具有对植酸酶表达盒特异的引物对的PCR检查植酸酶表达盒的共整合。选择测试为植酸酶表达构建体阳性的转化体用于进一步表征。实施例7酶活性测定法a)植酸酶活性测定法在微量滴定板中测定植酸酶活性。将含有植酸酶的上清液在反应缓冲液(250mM乙酸钠，1mMCaCl2，0.01％Tween20，pH5.5)中稀释，使得测量值保持在测定的线性范围内。将10μL酶溶液与140μl底物溶液(反应缓冲液中的6mM植酸钠(SigmaP3168))在37℃温育1h。加入150μL三氯乙酸溶液(15％w/w)使反应淬灭。为了检测释放的磷酸盐，用280μl新鲜的显色剂(60mML-抗坏血酸(SigmaA7506)，2.2mM钼酸铵四水合物，325mMH2SO4)处理20μL淬灭的反应溶液，并在50℃温育25分钟，随后测定820nm处的吸光度。对于空白值，将底物缓冲液本身在37℃温育，并且仅在用三氯乙酸淬灭后才加入10μL酶样品，对于剩余的测量类似地进行颜色反应。通过与已知浓度的磷酸盐溶液的颜色反应的校准曲线确定释放的磷酸盐的量。b)甘露聚糖酶活性测定法如本领域已知的，甘露聚糖酶活性定义为从半乳甘露聚糖中释放还原糖。具体而言，制备在50mMNaOAc，0.5mg/mLBSA，pH5.0中的含有甘露聚糖酶的样品的稀释系列，以测量在该测定法的线性范围内的至少两个样品。制备1％半乳甘露聚糖角豆(低粘度，Megazyme)，50mMNaOAc，pH5.0溶液。将17μl稀释的酶，76.5μl半乳甘露聚糖溶液和15.3μl缓冲液(250mMNaOAcpH5.0，0.025％Trition-X-100)混合并在50℃温育2h。在温育步骤之后和在检测步骤之前即刻将二硝基水杨酸溶液用作计算甘露聚糖酶活性的空白的样品，其中添加了经稀释的酶。在温育步骤之后，如下确定还原糖的量。将一份用于校准的半乳甘露聚糖测定法或确定的甘露糖稀释系列与一份含有1％(w/v)二硝基水杨酸(DNSA)，30％(w/v)酒石酸钾钠和0.4MNaOH的溶液混合。混合物在99℃温育10分钟，在4℃温育5分钟。最后在540nm处测量吸收。通过将甘露糖标准样品的吸收数据对甘露糖浓度作图来计算还原糖当量(作为甘露糖当量)。使用甘露糖标准样品数据的适当曲线拟合产生的方程式计算样品的还原糖当量的量。实施例8通过在搅拌釜反应器中培养嗜热毁丝霉来生产甘露聚糖酶通过在1L摇瓶中接种175mL具有104个孢子/mL的预培养培养基并在35℃和250转/分钟温育72h来制备嗜热毁丝霉的预培养物。备选地，预培养物可以通过嗜热毁丝霉的冷冻菌丝原种接种，而不影响工艺性能或蛋白质产量。对于详细的预培养培养基组成，参见表3。表3：预培养培养基表4：痕量元素溶液组分浓度[g/kg]EDTA50.0ZnSO4x7H2O20.05H3BO310.03MnSO4xH2O3.92FeSO4x7H2O4.56CoCl2x6H2O1.55CuSO4x5H2O1.46Na2MoO4x2H2O1.37在5L工作体积的玻璃反应器(SartoriusBiostatB)中进行扩展的补料分批培养。将预培养物无菌地转移到搅拌釜反应器中。通常使用的接种体积为3.5L起始体积的5-10％体积。用于补料分批培养的培养基组合物在表5中给出。表5.补料分批培养基在38℃的温度，300转/分钟的初始搅拌器速度，用空气充气，1vvm(每体积肉汤和分钟的空气体积)下进行培养。通过调节搅拌器速度将DOT(溶解氧张力)控制在>20％。pH可以在pH6.0和pH6.7之间变化，并使用25％NH4OH溶液控制。当pH增加至pH＝7.0时，在分批阶段结束时开始进料50％(w/w)葡萄糖溶液。进料速率设定为对于初始起始体积计算的3-5g/L/h。贯穿整个发酵过程取出肉汤样品。通过用0.22μm过滤器过滤肉汤获得无细胞上清液并用于分析蛋白质浓度和甘露聚糖酶活性。以牛血清白蛋白作为标准使用本领域已知的Bradford法测定蛋白质浓度。如上所述测定甘露聚糖酶活性。从图1中可以看出，与亲本菌株相比，clr1的缺失提供了具有更高纯度(比活性更高)的甘露聚糖酶的发酵液。HC_manT_Δclr1#α菌株培养中产生的ManT比活性比HC_manT亲本菌株高2.5倍，并且164h后达到最高值275U/g蛋白质。通过SDS-PAGE分析来自两个不同时间点的无细胞上清液。如通过测量蛋白质浓度所确定的，SDS-PAGE在所有情况下都加载等量的蛋白质。凝胶用考马斯蓝染色(图2)。对于clr1缺失菌株显示出明显转变为更好的甘露聚糖酶(在约50kDa的糖基化甘露聚糖酶的宽蛋白质条带)对背景蛋白质比。实施例9蛋白质表达的分析在小规模培养中发酵产生的突变菌株并分析上清液。将嗜热毁丝霉菌株在48孔微量滴定板中接种于1ml表6所示的培养基中。将菌株在37℃在微量滴定板摇床上以900转/分钟和85％湿度发酵3-6天。在培养结束时收获无细胞上清液，并通过SDS-PAGE分析等体积的上清液。凝胶用考马斯蓝染色。可以清楚地看出，与相应的亲本菌株UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70相比，在UV18#100fΔpyr5Δalp1Δku70Δclr1#α菌株中细胞外蛋白的量急剧减少(图3)。这表明clr1缺失菌株将更适合于高纯度重组蛋白生产。表6：培养培养基当前第1页1 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