基于多个基因诊断胃癌患者的检测试剂盒的制作方法

文档序号:11061833阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种检测p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因及其片段的甲基化的试剂盒,其特征在于:

包括引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁和引物探针组合物戊;

所述引物探针组合物甲包括特异性引物对甲、封闭引物甲和探针甲;所述引物探针组合物乙包括特异性引物对乙、封闭引物乙和探针乙;所述引物探针组合物丙包括特异性引物对丙、封闭引物丙和探针丙;所述引物探针组合物丁包括特异性引物对丁、封闭引物丁和探针丁;所述引物探针组合物戊包括特异性引物对戊、封闭引物戊和探针戊;

所述引物探针组合物甲为第一引物探针组合物甲或第二引物探针组合物甲;所述第一引物探针组合物甲中:所述特异性引物对甲为序列表的序列6所示DNA和序列表的序列7所示DNA组成的引物对,所述封闭引物甲的核苷酸序列如序列表的序列8所示,所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列9所示;所述第二引物探针组合物甲中:所述特异性引物对甲为序列表的序列10所示DNA和序列表的序列11所示DNA组成的引物对,所述封闭引物甲的核苷酸序列如序列表的序列12所示,所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列13所示;

所述引物探针组合物乙为第三引物探针组合物乙或第四引物探针组合物乙;所述第三引物探针组合物乙中:所述特异性引物对乙为序列表的序列14所示DNA和序列表的序列15所示DNA组成的引物对,所述封闭引物乙的核苷酸序列如序列表的序列16所示,所述探针乙的核苷酸序列如序列表的序列17所示;所述第四引物探针组合物乙中:所述特异性引物对乙为序列表的序列18所示DNA和序列表的序列19所示DNA组成的引物对,所述封闭引物乙的核苷酸序列如序列表的序列20所示,所述探针乙的核苷酸序列如序列表的序列21所示;

所述引物探针组合物丙为第五引物探针组合物丙或第六引物探针组合物丙;所述第五引物探针组合物丙中:所述特异性引物对丙为序列表的序列22所示DNA和序列表的序列23所示DNA组成的引物对,所述封闭引物丙的核苷酸序列如序列表的序列24所示,所述探针丙的核苷酸序列如序列表的序列25所示;所述第六引物探针组合物丙中:所述特异性引物对丙为序列表的序列26所示DNA和序列表的序列27所示DNA组成的引物对,所述封闭引物丙的核苷酸序列如序列表的序列28所示,所述探针丙的核苷酸序列如序列表的序列29所示;

所述引物探针组合物丁为第七引物探针组合物丁或第八引物探针组合物丁;所述第七引物探针组合物丁中:所述特异性引物对丁为序列表的序列30所示DNA和序列表的序列31所示DNA组成的引物对,所述封闭引物丁的核苷酸序列如序列表的序列32所示,所述探针丁的核苷酸序列如序列表的序列33所示;所述第八引物探针组合物丁中:所述特异性引物对丁为序列表的序列34所示DNA和序列表的序列35所示DNA组成的引物对,所述封闭引物丁的核苷酸序列如序列表的序列36所示,所述探针丁的核苷酸序列如序列表的序列37所示;

所述引物探针组合物戊为第九引物探针组合物戊或第十引物探针组合物戊;所述第九引物探针组合物戊中:所述特异性引物对戊为序列表的序列38所示DNA和序列表的序列39所示DNA组成的引物对,所述封闭引物戊的核苷酸序列如序列表的序列40所示,所述探针戊的核苷酸序列如序列表的序列41所示;所述第十引物探针组合物戊中:所述特异性引物对戊为序列表的序列42所示DNA和序列表的序列43所示DNA组成的引物对,所述封闭引物戊的核苷酸序列如序列表的序列44所示,所述探针戊的核苷酸序列如序列表的序列45所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:

还包括针对内参基因的内参引物和内参探针,所述内参基因为ACTB和/或GSTP1。

3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于:

所述内参基因ACTB的内参引物对为序列表的序列46所示DNA和序列表的序列47所示DNA组成的引物对;所述内参基因ACTB的内参探针的核苷酸序列如序列表的序列48所示;

所述内参基因GSTP1的内参引物对为序列表的序列49所示DNA和序列表的序列50所示DNA组成的引物对;所述内参基因GSTP1的内参探针的核苷酸序列如序列表的序列51所示。

4.一种用于诊断胃癌患者的试剂盒,其特征在于,

包括如下五个引物探针组合物中的至少一种:引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁和引物探针组合物戊;

所述引物探针组合物甲包括特异性引物对甲、封闭引物甲和探针甲;所述引物探针组合物乙包括特异性引物对乙、封闭引物乙和探针乙;所述引物探针组合物丙包括特异性引物对丙、封闭引物丙和探针丙;所述引物探针组合物丁包括特异性引物对丁、封闭引物丁和探针丁;所述引物探针组合物戊包括特异性引物对戊、封闭引物戊和探针戊;

所述引物探针组合物甲为第一引物探针组合物甲或第二引物探针组合物甲;所述第一引物探针组合物甲中:所述特异性引物对甲为序列表的序列6所示DNA和序列表的序列7所示DNA组成的引物对,所述封闭引物甲的核苷酸序列如序列表的序列8所示,所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列9所示;所述第二引物探针组合物甲中:所述特异性引物对甲为序列表的序列10所示DNA和序列表的序列11所示DNA组成的引物对,所述封闭引物甲的核苷酸序列如序列表的序列12所示,所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列13所示;

所述引物探针组合物乙为第三引物探针组合物乙或第四引物探针组合物乙;所述第三引物探针组合物乙中:所述特异性引物对乙为序列表的序列14所示DNA和序列表的序列15所示DNA组成的引物对,所述封闭引物乙的核苷酸序列如序列表的序列16所示,所述探针乙的核苷酸序列如序列表的序列17所示;所述第四引物探针组合物乙中:所述特异性引物对乙为序列表的序列18所示DNA和序列表的序列19所示DNA组成的引物对,所述封闭引物乙的核苷酸序列如序列表的序列20所示,所述探针乙的核苷酸序列如序列表的序列21所示;

所述引物探针组合物丙为第五引物探针组合物丙或第六引物探针组合物丙;所述第五引物探针组合物丙中:所述特异性引物对丙为序列表的序列22所示DNA和序列表的序列23所示DNA组成的引物对,所述封闭引物丙的核苷酸序列如序列表的序列24所示,所述探针丙的核苷酸序列如序列表的序列25所示;所述第六引物探针组合物丙中:所述特异性引物对丙为序列表的序列26所示DNA和序列表的序列27所示DNA组成的引物对,所述封闭引物丙的核苷酸序列如序列表的序列28所示,所述探针丙的核苷酸序列如序列表的序列29所示;

所述引物探针组合物丁为第七引物探针组合物丁或第八引物探针组合物丁;所述第七引物探针组合物丁中:所述特异性引物对丁为序列表的序列30所示DNA和序列表的序列31所示DNA组成的引物对,所述封闭引物丁的核苷酸序列如序列表的序列32所示,所述探针丁的核苷酸序列如序列表的序列33所示;所述第八引物探针组合物丁中:所述特异性引物对丁为序列表的序列34所示DNA和序列表的序列35所示DNA组成的引物对,所述封闭引物丁的核苷酸序列如序列表的序列36所示,所述探针丁的核苷酸序列如序列表的序列37所示;

所述引物探针组合物戊为第九引物探针组合物戊或第十引物探针组合物戊;所述第九引物探针组合物戊中:所述特异性引物对戊为序列表的序列38所示DNA和序列表的序列39所示DNA组成的引物对,所述封闭引物戊的核苷酸序列如序列表的序列40所示,所述探针戊的核苷酸序列如序列表的序列41所示;所述第十引物探针组合物戊中:所述特异性引物对戊为序列表的序列42所示DNA和序列表的序列43所示DNA组成的引物对,所述封闭引物戊的核苷酸序列如序列表的序列44所示,所述探针戊的核苷酸序列如序列表的序列45所示。

5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:

还包括针对内参基因的内参引物和内参探针,所述内参基因为ACTB和/或GSTP1。

6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于:

所述内参基因ACTB的内参引物对为序列表的序列46所示DNA和序列表的序列47所示DNA组成的引物对;所述内参基因ACTB的内参探针的核苷酸序列如序列表的序列48所示;

所述内参基因GSTP1的内参引物对为序列表的序列49所示DNA和序列表的序列50所示DNA组成的引物对;所述内参基因GSTP1的内参探针的核苷酸序列如序列表的序列51所示。

7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒,其特征在于,

还包括:DNA提取试剂和亚硫酸氢盐试剂;

所述DNA提取试剂包括裂解缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液;其中,所述裂解缓冲液包括蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂;所述清洗缓冲液分为清洗缓冲液A和清洗缓冲液B,所述清洗缓冲液A包括蛋白质变性剂、核酸酶抑制剂、pH缓冲剂、乙醇,所述清洗缓冲液B包括核酸酶抑制剂、pH缓冲剂、乙醇;所述洗脱缓冲液包括核酸酶抑制剂和pH缓冲剂;所述蛋白变性剂选自异硫氰酸胍、盐酸胍和尿素中的一种或几种;所述去垢剂选自Tween20、Tween40、Triton X-100、NP-40和SDS中的一种或几种;所述pH缓冲剂选自Tris、硼酸、磷酸盐、MES和HEPES中的一种或几种;所述核酸酶抑制剂选自EDTA、EGTA和DEPC中的一种或几种;

所述亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液;其中,所述亚硫酸氢盐缓冲液选自重亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵和亚硫酸铵中的一种或几种;所述保护缓冲液包括氧自由基清除剂,所述氧自由基清除剂选自对苯二酚、维生素E、维生素E衍生物、没食子酸、Trolox、三羟基苯甲酸和三羟基苯甲酸衍生物中的一种或多种。

8.权利要求1-7任一项所述的试剂盒在制备检测胃癌产品中的应用。

9.一种采用权利要求7所述的试剂盒检测p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因及其片段的甲基化的方法,其特征在于,包括如下步骤:

S1:采用所述DNA提取试剂提取人源样本的DNA;

S2:将提取得到的DNA采用所述亚硫酸氢盐试剂进行处理;

S3:以处理后的DNA为模板,采用所述引物探针组合物和所述内参基因的内参引物及内参探针进行PCR扩增。

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