一种无血清Vero细胞制备轮状病毒疫苗原液的方法以及无血清轮状病毒疫苗制品与流程

文档序号:11899118阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种无血清Vero细胞制备轮状病毒疫苗原液的方法,其特征在于,包含以下步骤,

步骤1.用无血清培养基培养Vero细胞,获得无血清培养基适应细胞株;

步骤2.利用获得的所述无血清培养基适应细胞株,建立无血清Vero细胞种子库;

步骤3.利用获得的所述无血清培养基适应细胞株,建立无血清轮状病毒毒株工作种子库;

步骤4.使用无血清培养基复苏、培养、传代、扩增Vero细胞工作种子库细胞,作为生物反应器培养的基础细胞,细胞扩增后,应用生物反应器和微载体,使用无血清培养基,连续灌流培养高密度Vero细胞;

步骤5.接种轮状病毒毒株工作种子库毒种后,进行生物反应器微载体无血清培养,在病毒扩增至高峰时,收获病毒液,收获液病毒滴度,经澄清、超滤浓缩、灭活和纯化处理,得到无血清人用轮状病毒原液。

2.根据权利要求1所述的一种无血清Vero细胞制备轮状病毒原液的方法,其特征在于,所述步骤2中,直接以无血清培养基复苏、培养和传代扩增所述无血清培养基适应细胞株,建立无血清Vero细胞主种子库和工作种子库。

3.根据权利要求2所述的一种无血清Vero细胞制备轮状病毒原液的方法,其特征在于,

所述步骤3中,使用无血清培养基,复苏、传代和扩增无血清Vero细胞工作种子库细胞,接种病毒性疫苗毒株,培养扩增后收获冻存,建立无血清病毒性疫苗毒株主种子库,再以无血清病毒性疫苗毒株主种子库毒种接种无血清Vero细胞工作种子库细胞,培养扩增后收获冻存,建立无血清病毒性疫苗毒株工作种子库。

4.根据权利要求3所述的一种无血清Vero细胞制备轮状病毒原液的方法,其特征在于,

所述步骤4中,使用无血清培养基,复苏、传代和扩增所述无血清Vero细胞工作种子库细胞,作为生物反应器培养的基础细胞,称取适量微载体,加入无血清培养基平衡过夜,将收获的细胞转入到细胞接种瓶中,无菌连接细胞接种瓶和生物反应器,使用正压将细胞接种到罐内,补充无血清培养液至工作体积,调整生物反应器培养参数,细胞接种一定时间后,调整搅拌桨转速,开始灌流细胞扩增培养基,在细胞数量达到规定量时,做好接种病毒的准备。

5.根据权利要求4所述的一种无血清Vero细胞制备轮状病毒原液的方法,其特征在于,

所述步骤5中,在微载体上满球率达80%以上,换液,取样进行细胞计数,按MOI0.001-0.01加入无血清培养基,进行载体上细胞与病毒的吸附,完成细胞对病毒的吸附之后,在病毒高峰到来时,收获病毒液。

6.根据权利要求3所述的一种无血清Vero细胞制备轮状病毒原液的方法,其特征在于,

所述步骤3中,在病毒液中加入含10-40μg/mL胰蛋白酶的激活剂,37℃水浴作用60min,取长满单层的状态良好的Vero细胞,将激活后的病毒液株以MOI 0.005接种Vero细胞,置于37℃恒温室吸附60min,补加无血清病毒维持液液至30mL,轻轻混匀,将细胞瓶继续置于37℃恒温室培养,于接种病毒规定时间后,病毒高峰期收获病毒并取样,细胞瓶及取样管密封置于-20℃,连续冻融三次,置于-80℃冻存。

7.根据权利要求4所述的一种无血清Vero细胞制备轮状病毒原液的方法,其特征在于,

所述步骤4中,使用无血清培养基,复苏、传代和扩增无血清Vero细胞工作种子库细胞,根据生物反应器工作体积,按载体投入量8-18g/L计算,称取适量微载体,用0.05mol/L PBS浸泡,换液3~4次,用PBS于4℃浸泡过夜,经高压灭菌后,载体以加液泵导入罐体内,加入无血清培养基,转速50转/分钟,温度37℃,PH7.2-7.6,DO20-60,平衡过夜,将收获的细胞转入到细胞接种瓶中,控制细胞悬液的体积,取样进行细胞计数,保证接种后的细胞密度不低于1.0-1.5×106个/ml,无菌连接细胞接种瓶和生物反应罐,使用正压将细胞接种到罐内,补充无血清培养液至工作体积,整生物反应培养参数:温度为37℃,DO20-60,通气量为0.5LPM,搅拌桨转速25-35转/分钟,温度37℃,PH7.2-7.6,细胞接种24小时后,调整搅拌桨转速至50-60转/分钟,开始灌流细胞扩增培养基,第一至三天为0.5-1个罐体积/灌流量,第二天为2.5个罐第三天至第七天为1-3个罐体积/灌流量,每天取样镜下观察细胞生长状态,同时结合氧气消耗量和PH变化情况调整灌流量,当第6-7天细胞数量达到0.9-1.1×107个/ml时,做好接种病毒的准备。

8.根据权利要求5所述的一种无血清Vero细胞制备轮状病毒原液的方法,其特征在于,

所述步骤5中,在病毒液中加入含10-40μg/mL胰蛋白酶的激活剂,37℃水浴作用60min,生物反应器微载体培养Vero细胞7天左右,待微载体上满球率达80%以上,换液,取样进行细胞计数,按MOI0.001-0.01加入病毒,并补充胰蛋白酶至2-4μg/mL,然后以25-30转/分钟进行载体上细胞与病毒的吸附,大约30-60分钟,温度33-35℃,吸附完成后,将搅拌桨转速调至50转/分钟,完成细胞对病毒的吸附之后,搅拌桨转速提至50-60转/分钟,温度35℃,观察细胞病变情况,三天左右之后,病毒高峰到来,3-7天,收获病毒液,连续冻融3次后备用。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的一种无血清Vero细胞制备轮状病毒原液的方法,其特征在于,

所述步骤5中,根据生物反应器的容量,对于低于14L的生物反应器的容量,进行灌流培养。

10.无血清轮状病毒疫苗制品,其特征在于,所述无血清轮状病毒制品由权利要求1至9中任一方法制得。

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