囊性纤维化患者的CFTR基因突变形式及其应用的制作方法

本发明涉及囊性纤维化患者的cftr基因突变形式及其应用。

背景技术：

囊性纤维化(cysticfibrosis，cf)是一种常染色体隐性遗传病，是由于囊性纤维化跨膜传导调节因子(cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator，cftr)的基因突变导致大量黏液阻塞全身外分泌腺，可累及呼吸、消化、生殖等多系统，临床表现为慢性咳嗽、咯大量黏痰、反复发作的肺部感染、脂肪泻、生长发育迟缓及男性不育等。

囊性纤维化首要累及的器官是肺，而肺部病变也是囊性纤维化患者的最主要的致死因素(85％)。囊性纤维化造成气道粘膜分泌物稠化，通过慢性阻塞、感染、炎症，最终导致支气管扩张和肺实质破坏。胰腺也是囊性纤维化的重要受累器官，患者主要表现为胰腺外分泌功能障碍：营养障碍(脂肪、蛋白质吸收障碍、脂肪泻、生长迟滞)，胰腺功能不全所致低体重和肺功能及生存率呈负相关，是预后不良的重要因素。患者亦可有其他消化系统表现，如肝脏肿大、肝硬化、黄疸等。因此当同时出现呼吸系统和消化系统表现时，更应警惕囊性纤维化。

囊性纤维化在发达国家高加索人群中的流行病学研究较为完善，是高加索人群中最常见的遗传性疾病之一，发病率约为1/1800至1/25000。亚洲囊性纤维化发病率的数据主要来自回顾性研究或病例研究，并不能十分准确、客观地描述囊性纤维化在亚洲人群准确的发病率，其发病率很可能被低估。1975年-2015年报道的文献中，共记载了36例囊性纤维化患者。近10年，中国大陆报道的囊性纤维化患者为13例。由于病例数较少，我国目前尚无该病发病情况的流行病学统计数据。

基因检测作为一种安全、快速、易行的手段在囊性纤维化诊断中也有着重要作用。对于临床表现不典型和/或汗液试验阴性(或临界值)的患者可通过基因检测进行确诊。囊性纤维化在我国的可能并非罕见，患者临床表现不典型，但如提高对疾病的认识，仍可通过临床表现和相关辅助检查发现高度怀疑的病例，进而通过基因检测快速地做出正确的判断。我国cftr基因与欧美国家报道大为不同且具有很高的异质性，因此关于cftr基因突变谱及与临床表型关系还需要进一步完善。

技术实现要素：

本发明的目的是提供囊性纤维化患者的cftr基因突变形式及其应用。

本发明保护一种蛋白质，为如下(a1)或(a2)：

(a1)将囊性纤维化跨膜传导调节因子第314位氨基酸残基由甘氨酸(gly)突变为色氨酸(trp)得到的蛋白质；

(a2)将囊性纤维化跨膜传导调节因子第604位氨基酸残基由苏氨酸(thr)突变为脯氨酸(pro)得到的蛋白质。

囊性纤维化跨膜传导调节因子具体如序列表的序列1所示。

编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因为如下(b1)或(b2)：

(b1)编码区为将序列表的序列2所示的dna分子第940位核苷酸由g突变为t得到的dna分子；

(b2)编码区为将序列表的序列2所示的dna分子第1810位核苷酸由a突变为c得到的dna分子。

本发明还保护用于检测特异突变甲的物质和/或用于检测特异突变乙的物质在制备试剂盒中的应用；所述特异突变甲为：人基因组中序列表的序列3所示dna分子中的第71位核苷酸由g突变为t；所述特异突变乙为：人基因组中序列表的序列4所示dna分子中的第44位核苷酸由a突变为c；

所述试剂盒的功能为如下(c1)、(c2)或(c3)：

(c1)评价待测者患囊性纤维化的风险性；

(c2)评价待测者或待测夫妻的后代患囊性纤维化的风险性；

(c3)诊断或辅助诊断待测者是否为囊性纤维化患者。

本发明还保护一种试剂盒，包括用于检测所述特异突变甲的物质和/或用于检测所述特异突变乙的物质；所述试剂盒的功能为评价待测者患囊性纤维化的风险性。所述试剂盒还包括记载如下判断标准(d1)和/或(d2)和/或(d3)的载体：(d1)如果待测者一条染色体携带所述特异突变甲，待测者相对正常人患囊性纤维化的风险性增高；(d2)如果待测者一条染色体携带所述特异突变乙，待测者相对正常人患囊性纤维化的风险性增高；(d3)如果待测者一条染色体携带所述特异突变甲，另一条染色体携带所述特异突变乙，待测者相对正常人患囊性纤维化的风险性增高。

本发明还保护一种试剂盒，包括用于检测所述特异突变甲的物质和/或用于检测所述特异突变乙的物质；所述试剂盒的功能为评价待测者的后代或待测夫妻的后代患囊性纤维化的风险性。所述试剂盒还包括记载如下判断标准(e1)和/或(e2)和/或(e3)和/或(e4)的载体：(e1)如果待测者一条染色体携带所述特异突变甲，待测者的后代相对正常人患囊性纤维化的风险性增高；(e2)如果待测者一条染色体携带所述特异突变乙，待测者的后代相对正常人患囊性纤维化的风险性增高；(e3)如果待测者一条染色体携带所述特异突变甲，另一条染色体携带所述特异突变乙，待测者的后代相对正常人患囊性纤维化的风险性增高；(e4)如果所述待测夫妻中的一位携带所述特异突变甲、另一位携带所述特异突变乙，待测夫妻的后代相对正常人患囊性纤维化的风险性增高。

本发明还保护一种试剂盒，包括用于检测所述特异突变甲的物质和/或用于检测所述特异突变乙的物质；所述试剂盒的功能为诊断或辅助诊断待测者是否为囊性纤维化患者。所述试剂盒还包括记载如下判断标准(f1)和/或(f2)和/或(f3)的载体：(f1)如果待测者一条染色体携带所述特异突变甲，待测者为或候选为囊性纤维化患者；(f2)如果待测者一条染色体携带所述特异突变乙，待测者为或候选为囊性纤维化患者；(f3)如果待测者一条染色体携带所述特异突变甲，另一条染色体携带所述特异突变乙，待测者为或候选为囊性纤维化患者。

所述正常人为两条染色体均携带序列表的序列1所示的囊性纤维化跨膜传导调节因子的编码基因的人。

所述序列表的序列1所示的囊性纤维化跨膜传导调节因子的编码基因具体如序列表的序列2所示。

所述序列表的序列1所示的囊性纤维化跨膜传导调节因子的编码基因具体如genbankaccessionno.ng_016465.4所示(linearpri28-aug-2016)。

以上任一所述用于检测所述特异突变甲的物质具体可为引物对甲。引物对甲由两条引物组成，一条引物为序列表的序列7所示的单链dna分子，另一条引物为序列表的序列8所示的单链dna分子。

以上用于检测所述特异突变乙的物质具体可为引物对乙。引物对乙由两条引物组成，一条引物为序列表的序列9所示的单链dna分子，另一条引物为序列表的序列10所示的单链dna分子。

本发明对于囊性纤维化患者的诊断具有重大应用价值。

附图说明

图1为胸部ct的照片。

图2为患儿父亲的相关测序结果。

图3为患儿母亲的相关测序结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

基因组中，cftr基因的核苷酸序列见genbankaccessionno.ng_016465.4所示(linearpri28-aug-2016)。

cftr基因编码的蛋白质，如序列表的序列1所示。

cftr基因的cdna中的读码框如序列表的序列2所示。

基因组中，cftr基因包括27个外显子，其中第8外显子的核苷酸序列如序列表的序列3所示，第14外显子的核苷酸序列如序列表的序列4所示。基因组中，cftr基因的第8外显子及其周边序列如序列表的序列5所示，cftr基因的第14外显子及其周边序列如序列表的序列6所示。

实施例、

一、患儿的相关信息

患儿基本情况：女，13岁，于2014年5月因“反复咳嗽、咯痰7年余”入院。

患儿病程：入院前7年患儿无明显诱因出现不剧烈咳嗽，伴咯痰、发热，无喘憋、发绀、呼吸困难，当地医院诊断“右下肺炎”，予静脉药物治疗，咳嗽、咯痰好转；此后每间隔1-2月患儿即出现上述症状，夜间及晨起为著，痰液多为黄色粘痰，不易咯出，伴喘息，无青紫，反复于当地医院静脉输注抗生素治疗，症状可缓解；入院前2年，患儿咳嗽较前明显加重，痰量较前增多，为黄绿色粘痰，并出现活动后气促，当地医院胸片、胸部ct提示双肺支气管扩张伴感染，予中药口服治疗症状稍有好转；入院前10月，患儿咯少量新鲜血丝痰，抗感染治疗后好转；发病以来，患儿食欲可，大小便正常，既往体健，生长发育正常。

患儿父母及家族情况：父母非近亲结婚,家族中无类似病人。

2014年5月入院查体结果：体温37℃，体重29kg，身高147cm，呼吸27次/min，脉搏106次/min，血压90/60mmhg，体格发育稍落后，营养差，卡疤(+)，双肺呼吸音粗，双下肺可闻及中量湿罗音，未闻及喘鸣银，杵状指(趾)阳性，余查体无明显异常。

2014年5月辅助检查结果：血气分析、血常规、血电解质、肝肾功能、大便常规、体液、细胞免疫功能正常；多次痰培养及支气管灌洗液培养均为铜绿假单胞菌；胸部ct(图1)提示双肺广泛支气管柱状及囊柱状扩张、支气管增厚；鼻窦ct提示双侧副鼻窦炎；腹部b超可见胰腺回声不均匀，考虑慢性胰腺炎；支气管镜检查显示气管、支气管内膜炎症，广泛粘稠分泌物阻塞，部分亚支扩张；肺功能提示混合性通气功能障碍。

2014年5月治疗过程：入院后先后予拉氧头孢、头孢哌酮舒巴坦静点抗感染治疗，行2次电子支气管镜灌洗治疗，咳嗽、咯痰症状好转，治疗13天好转出院。

二、患儿的cftr基因测序

1、提取患儿的基因组dna。

2、取步骤1得到的基因组dna，进行二代测序，患儿的cftr基因发生了复杂杂合突变，一条染色体中的cftr基因发生了940g>t突变(相应氨基酸突变为gly314trp)、其它位置均未发生突变，另一条染色体中的cftr基因发生了1810a>c突变(相应氨基酸突变位点为thr604pro)、其它位置均未发生突变。

940g>t突变即基因组中cftr基因的第8外显子的第71位核苷酸由g突变为了t。

1810a>c突变即基因组中cftr基因的第14外显子的第44位核苷酸由a突变为了c。

综合步骤一的病症和步骤二的测序结果，该患儿确诊为囊性纤维化患者。

三、患儿父母的cftr基因测序

1、分别提取患儿的父亲和母亲的基因组dna。

2、以步骤1得到的基因组dna为模板，分别采用引物对甲(f1和r1组成)和引物对乙(f2和r2组成)进行pcr扩增，将后分别将pcr扩增产物进行测序。

f1(序列表的序列7)：5’-ccatgctcagatcttccattcc-3’；

r1(序列表的序列8)：5’-cgcacatttttgcaaagttca-3’。

f2(序列表的序列9)：5’-tgctatcagaattcacaaggtaccaa-3’；

r2(序列表的序列10)：5’-acgctgatgcgaggcagtat-3’。

患儿父亲的相关测序结果见图2。图2中，a和b分别为不同染色体上的相关突变区域的测序结果。

患儿母亲的相关测序结果见图3。图3中，a和b分别为不同染色体上的相关突变区域的测序结果。

结果表明：患儿父亲的一条染色体上的cftr基因发生了940g>t突变，另一条染色体上的cftr基因未发生突变；患儿母亲的一条染色体上的cftr基因发生了1810a>c突变，另一条染色体上的cftr基因未发生突变；患儿获得了父亲cftr基因发生了940g>t突变的染色体和母亲cftr基因发生了1810a>c突变的染色体，因此发生了囊性纤维化。

sequencelisting

<110>首都医科大学附属北京儿童医院

<120>囊性纤维化患者的cftr基因突变形式及其应用

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