新型弹性蛋白酶抑制剂的制作方法

专利名称：新型弹性蛋白酶抑制剂的制作方法
背景技术：
本发明涉及用于各种生理性和目的用途应用的弹性蛋白酶，尤其是人中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的化合物。
人中性粒细胞弹性蛋白酶被认为是造成与许多炎症性疾病，如慢性支气管炎、肺囊性纤维化和类风湿性关节炎有关的组织破坏的因子。J.L.Malech和J.I.Gallin，New Engl.Med，317(11)，687(1987)。弹性蛋白酶对许多结缔组织大分子包括弹性蛋白、纤维结合素、胶原和proteoglycan具有广泛的蛋白水解活性。弹性蛋白酶的存在可以促成这些疾病的病理变化。
正常血浆中含有大量的蛋白酶抑制剂，调控在结缔组织的更新和炎症中涉及的各种酶。例如，α1蛋白酶抑制剂(α-1-PI)是一种可阻断弹性蛋白酶活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂。α-1-PI以受到相当多的关注，因为其血浆水平降低到正常值的15％以下与早期肺气肿有关。除血浆中得到的蛋白酶抑制剂外，分泌液，包括支气管、鼻、颈部粘液和精液含有叫做分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)的内源性蛋白酶抑制剂，它可以灭活弹性蛋白酶并确信在炎症细胞存在时对于维持上皮细胞的完整性起重要作用。在一定的病理状态下，α-1-PI和SLPI被中性粒细胞氧化机制灭活而使中性粒细胞蛋白酶在一个基本不含抑制剂的环境中产生作用。例如，已发现成人呼吸窘迫综合征(ARDS)病人的支气管灌洗液中含有活性弹性蛋白酶和已被氧化灭活的α-1-PI。
除氧化机制外，中性粒细胞具有通过抗蛋白酶来避免抑制的非-氧化机制。慢性肉芽肿疾病病人的中性粒细胞可以在过量α-1-PI的存在下降解内皮细胞基质。有相当多的体外证据表明，受激中性粒细胞可以牢固地结合在其底物上从而将血清抗蛋白酶从具有牢固的细胞-底物联系的微环境中有效地排出。大量中性粒细胞流入到炎症区域可导致由于发生在该区域的蛋白水解所引起的相当程度的组织破坏。
通过用中性粒细胞的溶解产物、纯化的弹性蛋白酶和受激中性粒细胞降解软骨基质proteoglycan的能力进行测定，申请人已经确定弹性蛋白酶是与软骨基质变性有关的主要中性粒细胞蛋白酶之一。此外，申请人首先发现了可用作弹性蛋白酶抑制剂，产生有价值的药理学活性的肽类衍生物。例如，在European Patent Application OPI No.0529568中，发明人Peet等，
公开日为1993年3月3日，公开了用作弹性蛋白酶抑制剂的肽类衍生物，其中羧基末端用一个五氟乙基羰酰基〔C(O)C2F5〕基团代替，氨基酸的N末端通过多种含有杂环的基团，例如4-吗啉羰酰基保护。申请人最近发现了肽基弹性蛋白酶抑制剂，其中的P2部分被多种含氮的杂环基团取代。
发明概述本发明涉及用作弹性蛋白酶抑制剂的具有以下分子式I的化合物 或水合物、电子等排物，或其药物可接受的盐类，其中P4是Ala，bAla，Leu，Ile，Val，Nva，bVal，Nle或一个键；P3是Ala，bAla，Leu，Ile，Val，Nva，bVal，Nle或N-甲基衍生物，Pro，Ind，Tic或Tca，或在其ε氨基用一个吗啉-B-基团取代的Lys或在其δ氨基用一个吗啉-B-基团取代的Orn；”P2是Pip，Aze，Pro(4-OH)，Pro(4-OAc)或Pro(4-OBzl)；R1是Ala，Leu，Ile，Val，Nva或bVal的侧链；X是-CF3，-CF2H，-CFH2，-C(＝O)Y，-C(＝O)P2′-Y，-CF2C(＝O)P2′-Y，-CF2CH(R1′)C(＝O)P2′-Y，-CF2CH(R1′)NBC(＝O)R3，-CHFCH(R1′)NHC(＝O)R3，-H，-C((＝O)R3，-CH(R1)C(＝O)P2′-Y，
-CF2CF3，-CF2(CH2)tCH3，-CF2(CH2)tCOOR4，-CHF(CH2)tCH3，-CF2(CH2)tCONHR4，-CF2(CH2)tCH2OR4，-CF2(CH2)vCH＝CH2，-CH2Cl或-C(＝O)-C(＝O)-Y；R3是C1-6烷基，苯基，苄基，环己基，环己基甲基；R4是H或C1-6烷基；R1‘是Ala，Leu，Ile，Val，Nva或bVal的侧链；P2’是一个键，Ala或Val；Y是-NHR3，OR3；t是2，3或4；v是1，2或3；k是氢，甲酰基，乙酰基，琥珀酰基，苯甲酰基，叔-丁氧羰酰基，苄氧羰基，甲苯磺酸基，丹酰基，异戊酰基，甲氧琥珀酰基，1-金刚烷磺酰基，1-金刚烷乙酰基，2-羧基苯甲酰基，苯乙酰基，叔-丁基乙酰基，二((1-萘基)甲基)乙酰基，-C(＝O)N-(CH3)2， -A-Rz其中A是 ；并且Rz是一个含有6，10或12个碳原子的芳基，被1到3个独立地选自由氟、氯、溴、碘、三氟甲基、羟基、含有1到6个碳原子的烷基、含有1到6个碳原子的烷氧基、羰基、烷基羰基氨基，其中的烷基含有1到6个碳原子、5-四唑基、和含有1到15个碳原子的酰基亚磺酰胺基，如果酰基亚磺酰胺基含有一个芳基，该芳基还可以被一个选自氟，氯，溴，碘和硝基的基团进一步取代所组成的组群的基团取代；或 其中Z是N或CH，并且B是以下分子式的基团 (波状曲线是与分子的其它部分的连接，即，不是连接到Z)其中R’是氢或一个C1-6烷基。显示抗炎效果的分子式I的化合物可用于痛风、类风湿性关节炎和其它炎症性疾病，例如成人呼吸窘迫综合征、败血症、慢性支气管炎、炎症性肠道疾病、弥漫性血管内凝血、肺囊性纤维化的治疗以及肺气肿的治疗。
发明详述分子式I的化合物的电子等排体包括那些其中(a)P2-P4取代基的一个或多个α-氨基残基是非天然构型的(当存在天然构型时)或(b)对正常的肽的酰胺键[-C(＝O)NH-]进行了修饰，例如，形成-CH2NH-(还原)，-COCH2-(酮)，-CH(OH)CH2-(羟基)，-CH(NH2)CH2-(氨基)，-CH2CH2-(烃)，-CH＝CH-(烯)。本发明的化合物最好不是电子等排体的形式；尤其优选不含有修饰的肽的酰胺基团，如果有的话，优选保持电子等排的修饰最少。
所选择的C1-6烷基包括直链、支链、或环状烷基基团，例如，甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，叔-丁基，戊基，异戊基，仲-戊基，环戊基，己基，异己基，环己基和环戊基甲基。
分子式I的化合物可以用任何无毒的有机或无机酸形成药物可接受的盐类。可形成适当的盐的无机酸的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和酸式金属盐例如磷酸一氢钠和硫酸氢钾。可形成适当的盐的有机酸的例子包括单、二和三羰酸。这些酸的例子是，例如乙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、枸橼酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水杨酸、2-苯氧基苯甲酸、和磺酸例如甲基磺酸和2-羟基乙基磺酸。
那些其中X是-C(＝O)-C(＝O)-Y的分子式I的化合物可以以水合物或脱水物的形式存在。这些分子式I的三酮化合物的水合物比其中X是-C(＝O)-C(＝O)-Y的分子式I的三酮化合物的脱水物在化学性质上稳定的多。基于这个原因，水合物为优选并且在该说明书和权利要求书中提到的任何三酮化合物根据环境许可均应采取相应的水合物形式。此外，预期本发明的化合物在正常的生理条件下是水合物的形式。
每个α-氨基酸均有一个特征性的“R-基团”，该R-基团是连接在”α-氨基酸的α-碳原子上的侧链或残基。例如，R-基侧链团对于甘氨酸是氢，对于丙氨酸是甲基，对于缬氨酸是异丙基。(因此，在整个说明书中，R1部分是每个所指的α-氨基酸的R-基团)。关于α-氨基酸的特定的R-基团或侧链参考A.L.Lehninger’s text on Biochemistry(具体参看第四章)会有帮助。
天然的氨基酸，除甘氨酸以外，均含有一个手性碳原子。除非特别说明，优选的化合物均是L-构型的光学活性的氨基酸；然而，申请人预计分子式I化合物的氨基酸可以是D-或L-构型或是D-和L-异构体的混合物，包括消旋的混合物。在表I中列出了公认的α-氨基酸的缩写。
具有任何基团的、有具体的同种用途的结构相关的化合物，在其end-use应用中，分子式I的化合物的某些基团和构型为优选。
关于取代基P4，优选P4是Ala或一个键的分子式I的化合物。特别优选P4是一个键的分子式I的化合物。
关于取代基P3，优选P3是Ile，Val或Ala的分子式I的化合物。特别优选P3是Val的分子式I的化合物。
关于取代基R1，优选R1是-CH(CH3)2或-CH2CH2CH3，分别是氨基酸Val和Nva的特征性“R-基团”的分子式I的化合物。特别优选R1是-CH(CH3)2的分子式I的化合物。
关于取代基X，优选X是-CF2CF3，-CF3，-CF2(CH2)tCH3，-CF2(CH2)tCOOR4，-CHF(CH2)tCH3，-CF2(CH2)tCONHR4，-CF2(CH2)tCH2OR4，或CF2(CH2)vCH＝CH2的分子式I的化合物。特别优选X是-CF2CF3的分子式I的化合物。
关于取代基K，优选K是苯甲酰基，叔-丁氧羰酰基，苄氧羰基，异戊酰基，-C(＝O)N(CH3)2，
或 其中Z是N并且B是以下分子式的基团 其中R’是氢或C1-6烷基的分子式I的化合物。特别优选K是 其中Z是N并且B是以下分子式的基团 其中R’是氢或C1-6烷基的分子式I的化合物。
优选化合物的具体例子包括N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧丁基]-L-2-氮杂环丁烷酰胺；N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧丁基]-D，L-2-哌啶酰胺；N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧丁基]-反-4-羟基脯氨酰胺；N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧丁基]-反-4-乙酰氧基脯氨酰胺；N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧丁基]-反-4-苄氧基脯氨酰胺；通常，分子式I的化合物可以按方案A所述用本领域已知的类似的标准化学反应制备。
方案A 方案A提供制备分子式I的化合物的总的合成方案。
P2，P3和K-P4基团可以连接到结构式(1)的氨基酸衍生物的游离氨基上。注意结构式(1)代表P1部分，其中的游离羧基被一个如上定义“X”部分取代。可以通过公知的肽偶联技术将P2，P3和K-P4连接到未保护的、游离氨基化合物上。此外，P1，P2，P3和K-P4基团可以按任何次序连接在一起，只要最终的化合物是K-P4-P3-P2-P1-X。例如，可以将K-P4与P3连接生成K-P4-P3并将其与P2-P1-X连接到；或将K-P4与P3-P2连接然后与一个适当的C-末端保护的P1连接并将C-末端保护基转变成X。
通常，可以通过将N-末端残基的α-胺脱保护并用所述的方法进行肽连接，与下一个适当的N-保护的氨基酸偶联将肽延长。重复脱保护和偶联过程直至得到想要的序列。偶联可以如方案A所述用组成的氨基酸以逐步的方式进行，或通过片段(两到多个氨基酸)的缩合，或两种方法的结合，或通过固相多肽合成，根据Merrifield，J.Am.Chem.Soc.1993，85，2149-2154所记载的方法，在此引入其公开内容用作参考。当使用固相合成方法时，C-末端羧酸与一个不溶性的载体(通常是聚苯乙烯)连接。这些不溶性载体含有一个基团，该基团可与醛基反应形成一个在延长条件下稳定但在此后易于断裂的键。这些载体的例子是氯-或溴乙基树脂，羟甲基树脂和氨基甲基树脂。这些树脂中许多都可以购买到，并且已经引入了想要的C-末端氨基酸。对于X是H的分子式I的化合物，在方案A的反应中还可以使用连接化合物将树脂连接到结构式(I)的氨基酸衍生物(其中X是H)的醛基官能团上。适当的连接化合物的例子是 另外，本发明的化合物还可以用自动多肽合成仪进行合成。除前述之外，在Stewart和Young，”Solid Phase Peptide Synthsis”，第二版，PierceChemical Co.，Rockford，IL(1984)；Gross，Meienhofer，Udenfriend编，”The PeptidesAnalysis，Synthsis，Biology”，1，2，3，5和9卷，AcademicPress，New York，1980-1987；Bodanszky，”Peptide ChemistryA Practicaltexrbook”，Springer-Verlag，New York(1988)；和Bodanszky等，”ThePractice of Peptide Synthsis”Springer-Verlag，New York(1984)中也记载了多肽的合成，在此引入其公开内容用作参考。
氨基酸之间、氨基酸与多肽之间，或者两个多肽片段之间的偶联可以通过标准的偶联方法进行，例如叠氮化合物的方法、混合碳酸-羧酸酸酐(氯甲酸异丁基酯)的方法、碳二亚胺(二环己基碳二亚胺，二异丙基碳二亚胺，或水溶性碳二亚胺)的方法，活性酯(对-硝基苯基酯，N-羟基-琥珀酰亚胺酸酯)的方法，Woodward试剂K的方法，羰基二咪唑的方法，磷试剂例如BOP-Cl，或氧化-还原的方法。其中的一些方法(尤其是碳二亚胺的方法)可以通过加入1-羟基苯并三唑得到改善。这些偶联反应可以以溶液(液相)或固相的形式进行。
组成氨基酸的功能基在偶联反应中通常必须保护以避免不想要的键的形成。可使用的保护基列于Greene，”Protective Groups in OrganicChemistry”，John Wile & Sons，New York(1981)和”ThePeptidesAnalysis，Synthsis，Biology”，Vol.3，Academic Press，NewYork(1981)，其公开的内容在此作为参考文献。
C-末端残基的α-羧基通常通过可以断裂形成羧酸的酯来保护。可使用的保护基包括1)烷基酯例如甲酯和叔-丁酯，2)芳基酯例如苄酯和取代的苄酯，或3)可以通过弱碱处理或温和的还原方法进行断裂的酯例如三氯乙酯和苯甲酰酯。
每一个要偶联到延长肽链上的氨基酸的α-氨基都必须进行保护。可使用本领域已知的任何保护基。它们的例子包括1)酰基型例如甲酰基，三氟乙酰基，邻苯二甲酰基和对-甲苯磺酰基；2)芳香氨基甲酸酯型例如苄氧羰基(CBz或Z)和取代的苄氧羰基，1-(对-二苯基)-1-甲基乙氧基-羰基；和9-芴基甲氧羰基(Fomc)；3)脂肪族氨基甲酸酯型例如叔丁氧羰酰基(Boc)，乙氧羰酰基，二异丙基甲氧羰酰基，和烯丙基氧羰酰基；4)环烷基氨基甲酸酯型例如环戊基氧羰酰基和金刚烷基氧羰酰基；5)烷基型例如三苯甲基和苄基；6)胺烷基硅烷例如三甲基硅烷；和7)硫醇型例如苯硫代羰酰基和二噻琥珀酰基。优选的α-氨基保护基是Boc或Fomc，优选Boc。许多用于多肽合成的适当保护的氨基酸都可以购买到。
在与下一个氨基酸偶联之前，先将新引入的氨基酸残基的α-氨基保护基断裂。当使用Boc保护基时，选用的方法是三氟乙酸，纯净的或溶于二氯甲烷中的，或溶于二恶烷或乙酸乙酯的HCl。然后将得到的铵盐用碱性溶液例如缓冲溶液或溶于二氯甲烷的三乙胺在偶联之前或就地中和。当使用Fomc保护基时，选用的试剂是溶于二氯甲烷的哌啶或取代的哌啶，但也可使用任何二级胺或碱性水溶液。脱保护在0℃到室温之间进行。
任何带有侧链官能团的氨基酸在多肽的制备过程中必须用上述的基团进行保护。本领域技术人员可以理解，对这些侧链官能团的适当保护基的选择和使用依赖于氨基酸和多肽中的其它保护基的存在。对这些保护基选择的重点是它必须在α-氨基的脱保护和偶联中不会被除去。
例如，当使用Boc作为α-氨基的保护基时，以下侧链保护基是合适的对-甲苯磺酰基(tosyl)部分可用来保护氨基酸例如Lys和Arg的氨基侧链；对-甲基苄基，乙酰氨基甲基，苄基(Bzl)，或叔-丁基磺酰基部分可用来保护氨基酸例如半胱氨酸的含硫侧链；苄基(Bzl)醚可用来保护氨基酸例如Ser和Thr的含羟基侧链。
当使用Fmoc进行α-氨基的保护时，基于叔-丁基的保护基通常是可以接受的。例如，Boc可用于赖氨酸，叔-丁基醚用于丝氨酸和苏氨酸，叔-丁基酯用于谷氨酸。
在多肽的延长完成时除去所有的保护基。当使用液相合成时，依据保护基的选择可使用任何方式除去保护基。这些方法是本领域技术人员所公知的。
当使用固相合成时，通常在除去保护基的同时将多肽从树脂上断裂下来。当在合成中使用Boc保护方案时，用含有添加剂例如二甲硫醚、茴香醚、茴香硫醚、或对-甲苯酚的无水HF在0℃处理是将多肽从树脂上断裂的优选方法。多肽的断裂还可以通过其它酸性试剂例如三氟甲磺酸/三氟乙酸混合物来完成。如果使用了Fmoc保护方案时，N-末端的Fmoc基团用前述的试剂断裂。其它的保护基和多肽从树脂的断裂用三氟乙酸和各种添加剂例如茴香醚等的溶液。
对于X是H的那些分子式I的化合物，分子式I的多肽可以通过酸/甲醛水溶液从连接化合物和树脂上断裂下来。
另外，分子式I的化合物还可以按方案B所描述用本领域已知的类似的标准化学反应制备。
方案B 方案B提供另外一种制备分子式I的化合物的通用合成方案。
可以如前方案A所述将P2，P3和K-P4基团连接到结构式(2)的氨基醇衍生物的游离氨基上生成结构式(3)的肽基醇。
然后将肽基醇的醇功能基用本领域普通技术人员所公知和理解的技术和方法，例如用草酰氯和二甲亚砜的Swern氧化，进行氧化生成分子式I的化合物。
方案A和B所用的原料是本领域普通技术人员易得的。例如，氨基酸P2，P3和K-P4其中K是氢可以购买到，而结构式(L1)的连接化合物在J.Am.Chem.Soc.，114，3157-59(1992)中有记载。另外，欧洲专利申请OPINo.0363284，1990年4月11日，记载了取代的氨基酸K-P4其中K是乙酰基，琥珀酰基，苯甲酰基，叔-丁氧羰酰基，苄氧羰基，甲苯磺酰基，丹酰基，异戊酰基，甲氧琥珀酰基，1-金刚烷胺苯磺酰基，1-金刚烷胺乙酰基，2-羧基苯甲酰基，苯乙酰基，叔-丁基乙酰基，二[(1-萘基)-甲基]乙酰基，或-A-Rz其中A是 Rz是一个含有Rz是一个含有6，10或12个碳原子的芳基，被1到3个独立地选自由氟、氯、溴、碘、三氟甲基、羟基、含有1到6个碳原子的烷基、含有1到6个碳原子的烷氧基、羰基、烷基羰基氨基，其中的烷基含有1到6个碳原子、5-四唑基、和含有1到15个碳原子的酰基亚磺酰胺基(即酰胺基磺酰基和磺酰胺基羰基)，如果酰基亚磺酰胺基含有一个芳基，该芳基还可以被一个选自氟，氯，溴，碘和硝基的基团进一步取代所组成的组群的基团取代；以及其它这类的与其功能相当的末端氨基保护基。
起始的结构式(1)的氨基化合物对于本领域普通技术人员是易得的。例如，保护了的结构式(1)的氨基化合物(其中X是H)是文献中公知的，并且在欧洲专利申请OPI No.0275101，1988年七月20日，和欧洲专利申请OPI No.0363284，1990年4月11日中也有记载。另外，欧洲专利申请OPINo.0503203，1992年九月16日，记载了结构式(1)的氨基化合物，其中X是-CF3，-CF2(CH2)tCH3，-CF2(CH2)tCOOR4，-CF2(CH2)tCONHR4，-CF2(CH2)tCH2OR4，-CF2CF3，-CF2(CH2)tCH＝CH3。欧洲专利申请OPINo.0195212，1986年九月24日，记载了结构式(1)的氨基化合物，其中X是-CF3，-CF2H，-C(＝O)-Y，CF2CH(R1’)-C(＝O)P2-Y和-C(＝O)-P2’-Y。OPINo.0275101，1988年七月20日，记载了结构式(1)的氨基化合物其中X是-CF2CH(R1’)NHC(＝O)R3并且可以通过类似的方法使用溴-氟乙酸乙酯代替溴-二氟乙酸乙酯制得结构式(1)的氨基化合物其中X是-CHFCH(R1’)NHC(＝O)R3。Biochem.J(1987)，241，871-5，Biochem.J(1986)，239，633-40和美国专利号4518528，1985年五月21日，记载了结构式(1)的氨基化合物其中X是-CFH2。欧洲专利申请OPINo.0363284，1990年四月11日，记载了结构式(1)的氨基化合物，其中X是-CO2R3，C(＝O)-R3-CH(R1)-C(＝O)P2’-Y。欧洲专利申请OPINo.0275101，1988年七月20日，记载了结构式(1)的氨基化合物其中X是-CF2CH(R1’)NHC(＝O)R3。另外，欧洲专利申请OPI No.0410411，1991年一月30日，记载了结构式(15)的氨基化合物其中X是-CF2CF3。在J.Am.Chem.Soc.1992，114，3156-3157中记载了从相应的酸制备用于合成分子式I的化合物(其中X是H)的连接化合物反-4-(氨甲基)-环己酸苄酯。
另外，方案A和B的所用的其它原料可以按照本领域普通技术人员所公知和理解的合成方法制备。
结构式的取代的氨基酸K-P4其中K是 其中Z 是N或CH，并且B 是以下分子式的基团 其中R’是氢或C1-6烷基用本领域公知的类似的标准化学反应制备。在方案C中概述了取代氨基酸K-P4其中K是 其中B是-C(＝O)-的制备方法，其中P4和Z如上所定义或与这些基团在功能上相当。
方案C 特别地，通过将氨基酸K-P4(其中K是氢)与结构式(4)的酰氯在一到四摩尔当量可起到卤化氢受体作用的适当的胺的存在下偶联制得氨基酸K-P4其中K是 其中B是-C(＝O)-。用作卤化氢受体的适当的胺是有机叔胺例如三(低级烷基)胺，例如，三乙胺，或芳香胺例如甲基吡啶、可力丁、和吡啶。当使用吡啶、甲基吡啶、或可力丁时，它们可以大大过量从而还可以起到反应溶剂的作用。特别适合于反应的是N-甲基吗啉(“NMM”)。偶联反应的进行可以通过向氨基酸K-P4(其中K是氢)的溶液中加入过量的，例如1-5倍，优选大约4倍摩尔过量的胺，然后加入结构式(4)的酰氯。溶剂可以是任何适当的溶剂，例如，石油醚、氯代烃例如四氯化碳，氯化乙烯，二氯甲烷，或氯仿、氯代芳烃例如1，2，4-三氯苯，或邻-二氯苯、二硫化碳、醚性溶液例如二乙醚，四氢呋喃，或1，4-二氧六环、或芳烃溶剂例如苯，甲苯或二甲苯。二氯甲烷是该偶联反应的优选溶剂。依据反应试剂、溶剂、浓度、以及其它因素，例如温度，可以从大约0℃到60℃，通常在室温下，即25℃，反应可以进行15分钟到6小时。N-保护的氨基酸K-P4，其中K是 其中B是-C(＝O)-可以通过任何适当的技术例如硅胶色谱从反应混合物中分离。取代的氨基酸K-P4，其中K是 其中B不是-C(＝O)-可以类似地进行制备，仅在方案C中用适当的中间体 其中B不是-C(＝O)-并且A是Cl或OH(相应的酸，酰氯或磺酰氯)代替结构式(5)的化合物。
结构式(4)的酰氯以及适当的分子式 其中B不是-C(＝O)-并且A是Cl或OH(相应的酸，酰氯或磺酰氯)的中间体可以购买到或可以通过本领域普通技术人员所公知和理解的技术和方法方便地制备。
例如，适当的分子式 的中间体可以如方案D所述进行制备，其中所有的取代基如上所定义。
方案D
方案D提供一种制备分子式 其中Z如前所定义的适当的中间体的通用合成方法。
在步骤a中，将适当的2，5-吡啶二羧酸，2-甲酯(6)(Nippon KagakuZasshi，1967，88，563)的羧酸功能基用本领域普通技术人员所公知和理解的技术和方法转变成它的酰氯，例如亚硫酰氯，生成相应的6-甲氧甲酰烟酰氯(7)。
在步骤b中，将酰氯(7)通过本领域普通技术人员所公知和理解的技术和方法用吗啉(8)酰胺化生成相应的5-(吗啉-4-羰基)-2-吡啶羧酸甲酯(9)。
在步骤c中，将甲酯功能基(9)通过本领域普通技术人员所公知和理解的技术和方法，例如氢氧化锂的甲醇溶液进行水解，生成5-(吗啉-4-羰基)-2-吡啶羧酸(10)。
另外，分子式 的适当的中间体可以如方案E所述进行制备，其中所有的取代基如前所定义。
方案E
方案E提供制备分子式 其中Z如前所定义的适当的中间体的通用合成方法。
在步骤a中，将适当的2，5-吡啶二羧酸，2-甲酯(6)(Nippon KagakuZasshi，1967，88，563)的游离羧酸功能基用本领域普通技术人员所公知和理解的技术和方法，例如叔-丁醇的六环己基碳二亚胺的加合物(Synthsis，1979，570)转变成它的叔丁酯，生成相应的2，5-吡啶二羰酸，2-甲酯，5-叔-丁酯(11)。
例如，将2，5-吡啶二羧酸，将2-甲酯(6)与过量一摩尔的叔-丁醇的六环己基碳二亚胺加合物在适当的有机溶剂，例如二氯甲烷中结合。反应一般在0℃到室温的温度范围内进行，反应时间的为2到24小时。用本领域公知的标准提取方法将2，5-吡啶二羧酸，2-甲酯，5-叔-丁酯(11)从反应混合物中分离并可以通过重结晶进行纯化。
在步骤b中，将(11)的甲酯功能基用吗啉(8)酰胺化生成相应的6-(吗啉-4-羰基)烟酸叔-丁酯(12)。
例如，将2，5-吡啶二羧酸，2-甲酯，5-叔-丁酯(11)与一摩尔过量的吗啉在适当的有机溶剂，例如四氢呋喃中结合。反应一般在从室温到回流的温度范围内进行，反应时间从5小时到3天。用本领域公知的标准提取方法将6-(吗啉-4-羰基)烟酸叔-丁酯(12)从反应混合物中分离并可以通过重结晶进行纯化。
在步骤c中，将(12)的叔-丁酯用例如，HCl的硝基甲烷溶液进行水解，生6-(吗啉-4-羰基)烟酸(13)。
结构式(1)的氨基化合物其中X是-C(＝O)-C(＝O)-Y可以通过本领域普通技术人员所公知和理解的技术和方法制备。
例如，结构式(1)的氨基化合物其中X是-C(＝O)-C(＝O)-Y可以如方案F所述进行制备，其中所有的取代基如前所定义。
方案F
特别地，如方案F中所述，结构式(1)的氨基化合物其中X是-C(＝O)-C(＝O)-Y的制备可以通过将适当的N-Boc保护的三羰基化合物(20)用适当的酸，例如氯化氢的乙酸乙酯或硝基甲烷溶液，或纯净的三氟乙酸或其在二氯甲烷中的溶液处理，随后用适当的碱形成游离的碱(21)。
中间体(20)通过将产物(19)用(a)臭氧和二甲硫醚或(b)单纯氧或(c)Oxone处理生成。臭氧化反应通常可以通过例如，将过量的臭氧通入适当的结构式(20)的产物的冷却溶液中进行。适当的溶剂包括可以溶解产物(20)的任何惰性溶剂，例如，简单链烷酸的烷基酯例如乙酸乙酯；氯代烃例如四氯化碳、氯仿、1，2-二氯乙烷、1，1，2，2-四氯乙烷、和二氯甲烷；芳烃例如苯、甲苯、二甲苯；氯代芳烃例如1，2，4-三氯苯和邻-二氯苯；或醚性溶剂例如二乙醚、四氢呋喃(THF)、和1，4-二氧六环。优选二氯甲烷。
臭氧化反应混合物的温度可以以任何温度来进行反应，一般从定义-78℃到0℃，优选从大约-78℃到-35℃，最为优选-70℃。反应时间依据产物、反应物浓度、温度及其它因素而变化。通常，将臭氧通入反应混合物中直至溶液变蓝显示臭氧过量。
然后将臭氧化物用过量的还原剂例如金属锌或优选的锌的二甲基硫化物处理。以任何常用的方式，一般是除去溶剂(通过蒸发)将化合物(20)以水合物的形式从反应混合物中分离出来。纯化可以通过，例如闪式色谱分离来完成(Still，W.C；Kahn，M；Mitra，A.；J.Org.Chem.1978，43，2923)。
当需要更温和或选择性更强的溶剂时，可以使用Oxone代替臭氧。一般地，将产物(19)用1.5当量的Oxone的THF-H2O溶液处理并将生成的水合的三羰基化物从反应混合物中分离出来。
使用单纯氧氧化也是公知的。更具体的讲，产物的单纯氧氧化生成三羰基酯已经被Wasserman等，J.Amer.Chem.Soc.，11，371(1989)所报道。单纯氧可以通过氧气的染料增感激活产生。适当的染料包括玫瑰红、曙红Y和亚甲基蓝。其它增感剂包括萘噻吩(inaphthalenethiophene)。一般地，玫瑰红、曙红Y连接在碱性阴离子交换树脂上而亚甲基蓝连接在酸性阳离子交换树脂上。激活通过紫外灯例如碘钨灯来完成。适当的溶剂是任何促进而不干扰所需反应的溶剂。这样的溶剂包括芳烃例如苯和甲苯；烃例如己烷；醚性溶剂例如二乙醚、四氢呋喃(THF)，1，4-二氧六环；氯代烃例如二氯甲烷和氯仿；和二硫化碳。混合物也是可行的。反应混合物的温度可以是从大约-78℃到30℃一般从大约-78℃到-50℃的任何适当的温度。反应时间依据反应物、溶剂、浓度、和温度而变化，可以从大约1分钟到2小时。可以通过以上臭氧分解反应混合物中的产物的分离和说明所描述的方法进行纯化和分离。
结构式(19)的N-Boc保护的产物通过将结构式(14)的N-Boc保护的氨基酸与结构式(16)的磷用水溶性碳二亚胺(WSCDI)例如1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(17)或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(18)甲碘化物在4-二甲氨基吡啶(DAMP)的存在下在适当的溶剂例如THF或二氯甲烷中偶联进行制备。反应需要大约30分钟到12小时，一般是大约2到3小时，依据氨基酸、产物、溶剂、和温度，温度可以是从大约-15℃到60℃，但一般在0℃。分离和纯化通过将反应混合物滤除固体产物并随后将滤液在例如硅胶上进行色谱分离来完成。
结构式(16)的所三价磷产物，Wittig试剂从相应的结构式(15)的α-卤代羧酸衍生物以常用的方式制备，即将α-卤代酯与一个三级膦例如三苯膦反应生成磷盐。当用强碱例如有机锂化合物，例如二异丙氨基锂(LDA)、氢化钠、或氨基钠处理时，酸性质子被脱去而形成所需产物。在形成Wittig试剂时使用的适当的溶剂包括任何惰性溶剂包括，例如，芳烃例如苯或甲苯、氯代烃例如四氯化碳，氯仿或二氯甲烷、或醚性溶剂例如二乙醚或THF。
反应通常可以在大约0℃到60℃下进行，一般在室温，即25℃下进行。α-卤代酯卤素基团优选是溴，但也可以是氯或碘或任何可以形成稳定鏻盐的良好的离去基团例如甲磺酰酯或甲苯磺酰酯基团。
另外，结构式(1)的氨基化合物(其中X为-CHF(CH2)tCH3)可以按方案G中描述方法制备，方案G中所有取代基如前定义。
方案G
方案G提供制备结构式(1)的氨基酸(其中X是-CHF(CH2)tCH3)的通用合成方法。在方案G中，除非特别声明，所有的取代基均如前所定义。
在步骤a中，将结构式(22)的适当酸用N-甲基-N-甲氧基胺通过本领域普通技术人员公知和理解的技术和方法，例如使用1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)和1-羟基苯并三唑(HOBT)的偶联反应进行酰胺化，生成相应的结构式(25)的酰胺。
在步骤b中，将适当的结构式(23)的酰胺用适当的结构式(24)的烷基金属化合物烷基化生成相应的结构式(25)的酮基化合物。
例如，将适当的结构式(23)的酰胺用适当的结构式(24)的烷基金属化合物在适当的非质子、无水有机溶剂例如四氢呋喃或二乙醚中处理。反应一般在-78℃到-40℃的温度范围内进行反应时间从30分钟到5小时。相应的结构式(25)的酮基化合物通过本领域公知的提取方法从反应区回收并可以通过色谱分离进行纯化。
在步骤c中，将适当的结构式(25)的酮基化合物用结构式(26)的N-氟磺酰胺化合物，或其它氯化试剂(27)，(28)或(29)氟化生成结构式(30)的保护的氨基化合物，即其中的氨基末端基团用Boc基团取代并且X是-CHF(CH2)tCH3的结构式(1)的氨基化合物。
例如，将适当的结构式(25)的酮基化合物用适当的非-亲核性的碱，例如二异丙氨基锂在适当的无水非质子有机溶剂例如四氢呋喃中在-78℃到-40℃的温度范围内处理5分钟到2小时。然后将反应混合物用结构式(26)的N-氟磺酰胺化合物处理，反应在-78℃到-40℃的温度范围进行反应时间从30分钟到10小时。通过本领域公知的提取方法将N-t-Boc保护的结构式(1)氨基化合物(其中X是-CHF(CH2)tCH3)从反应区回收并可以通过色谱分离进行纯化。
制备结构式(1)的化合物(其中X＝-CF2CF3)的其它途径在方案H中说明。
化合物(31)定义的所需原料可通过购买或应用现有技术已知的原理或技术方便的得到。术语“Pg”指如前所定义的适当的保护基。
方案H
在方案H，步骤a中将保护的氨基酸(31)转变为hydroxmate(32)。该酰胺化可以通过象两个氨基酸之间那样的偶联反应用保护的氨基酸(31)和N-烷基O-烷基羟胺进行。标准的偶联反应可以用如前所述的用于两个氨基酸之间的偶联的标准方法完成，生成hydroxmate(32)。
在步骤b中，将保护的hydroxmate(32)转变为保护的五氟酮(34)[或(35)]。该反应可以用下列参考文献M.R.Angelastro，J.P.Burkhart，P.Bey，N.P.Peet，TetrahedronLetters，33(1992)，3265-3268中描述的反应类型的反应进行。
在步骤c中，将hydroxmate(32)在如T.H.Green“Protection Groupsin Organic Synthesis”，John Wiley和Sons，1981，第7章所描述的本领域公知的条件下脱保护，生成脱保护的hydroxmate。将脱保护的hydroxmate通过用前述方法与下一个适当保护了的氨基酸通过肽键偶联、或通过片段的缩合、或通过两种方法的结合进行延长，生成延长了的多肽(33)。
在步骤d中，将酮(34)在前述条件下脱保护。将脱保护的酮(34)通过用前述方法与下一个适当保护了的氨基酸通过肽键偶联、或通过片段的缩合、或通过两种方法的结合进行延长，生成延长了的酮(35)。
另外，相应的N-保护的氨基酸酯(31)[即PgNHCH(R1)C(＝O)OR2，(32a)，其中R2和Pg如前所定义]可以代替hydroxmate(32)。相应的保护的氨基酸酯(31)可购买到或从(31)用本领域普通技术人员公知的方法容易地合成。在步骤b中，将氨基酸酯(32a)以与相应的hydroxmate所用的完全类似的方式转变为N-保护的五氟酮(34)[或(35)]。步骤c和d与使用hydroxmate(32)时相似。
例如，可以将氨基酸酯(32a)与适当的全氟化试剂，例如4-8当量的全氟乙基碘或全氟乙基溴反应。所述反应在适当的碱金属碱，例如4-8当量的MeLi/LiBr的存在下，在适当的无水溶剂(或混合溶剂)，例如乙醚，四氢呋喃，或甲苯中进行。其它适当的碱金属碱的例子包括t-BuLi，EtMgBr，PhMgBr，n-BuLi，及此类。反应在-100℃到0℃，优选-30℃到-80℃的降低温度下进行，分别生成保护的全氟丙基氨基酮和保护的全氟丁基氨基酮。步骤c和d与使用hydroxmate(32)时相似。
另外，可以首先将N-保护的氨基酸酯(32a)脱保护并与一个适当的N-保护的肽在适当的偶联剂及适当的偶联溶剂的存在下进行偶联。由此形成的N-保护的多肽酯[KP4P3P2NH-CH(R1)C(＝O)OR2，(33a)]然后以与相应的hydroxmate所用的完全类似的方式进行全氟化。步骤c和d与使用hydroxmate(32)时相似。
所有在分子式1的合成中用到的氨基酸均是可购买到的或相关领域的技术人员易于合成的。例如，P2中定义的氨基酸衍生物Pro(4-Ac)可以通过将Pro的残基用本领域普通技术人员公知的技术进行酯化来制备。
下述实施例代表方案A至方案H所述的一般性合成。应当理解，这些实施例仅是用来说明而不是以任何方式对本发明的范围进行限定。在此用到的系列术语具有所述的意义“g”指克；“mmol”指毫摩尔；“mL”指毫升；“bp”指沸点；“℃”指摄氏度；“mmHg”指毫米汞柱“μL”指微升；“μg”指微克；“μM”指微摩尔；“DME”指1，2-二甲氧基乙烷；“DDC”指二环己基碳二亚胺；“h”指小时；“DMF”指N，N’-二甲基甲酰胺；“conc”指浓缩；“NMM”指N-甲基吗啉；“in vacuo”指减压下蒸除溶剂。
实施例1N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-L-2-氮杂环丁酰胺的制备 a)N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-缬氨酰-琥珀酰亚胺的制备向冷的(冰浴)、搅拌下的BOC-L-缬氨酸(4.56g，0.021mol)和N-羟基琥珀酰亚胺(2.41g，0.021mol)的DMF(50mL)的溶液中加入DCC(4.75g，0.023mol)。反应液在5℃搅拌6h然后置于冰箱中放置过夜。然后将反应液冷过滤、Et2O洗涤、浓缩得到固体，将其用EtOAc/己烷重结晶得到白色结晶固体状所需产物(4.59g，69.5％)mp123-124℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ5.00-4.95(d，1H，J＝9.3Hz)，4.62(dd，1H，J＝4.97Hz)，2.85(s，4H)，2.75-2.44(m，1H)，1.45(s，9H)，1.25-0.90(m，6H)；13CNMR(CDCl3)δ168.6，167.9，155.1，155.0，80.4，77.4，77.2，77.0，76.6，76.5，57.0，31.6，31.1，28.2，28.1，28.0，27.99，27.93，25.5，18.6，17.3；MS(Cl/CH4) m/z 315(MH+)，299，287，259，241，215(基峰)，173，172，145，144，116，100，72。C14H22N2O6的分析理论值C，53.49；H，7.05；N，8.91。实测值C，53.67；H，7.06；N，8.81。b)N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-缬氨酰-L-2-氮杂环丁烷羧酸向搅拌下的(S)-(-)-2-氮杂环丁烷羧酸(1.0g，10mmol)和Et3N(1.5mL，11mmol)的DMF(30mL)溶液中加入(a)部分的产物(2.8g，9.0mmol)并将反应液加热至120℃2.5h。冷却中将反应液减压浓缩并将油状残余物溶于EtOAc并用1N HCl(2×30mL)洗涤，干燥(MgSO4)并浓缩得到白色泡沫状所需产物(1.88g，65％)。
1HNMR(300MHz，CDCl3)δ9.15(br，s，1H)，5.09(d，1H，J＝8.8Hz，NH)，5.00(dd，1H，J＝9.2，7.2Hz，Val的α-CH)，4.43(dd，1H，J＝7.0，1.49Hz)，4.17(m，1H)，3.94(appt，1H，J＝8Hz)，2.62(m，3H)，1.44(s，9H，tBu)，0.97(d，6H，J＝6.7Hz，2×CH3)c)N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-L-2-氮杂环丁酰胺在氮气下，向搅拌下的(b)部分的产物(1.80g，6.0mmol)和NMM(0.66mL，6.0mmol)的干燥CH2Cl2(50mL)溶液中于-20℃下滴加氯甲酸异丁酯(0.79mL6.0mmol)。20分钟后，加入4-氨基-1，1，1，2，2-五氟-5-甲基-3-己酮盐酸盐(1.54g，6.0mmol)(来自欧洲专利申请OPINo.0410411，1991年1月30日公开)，随后立即加入另一部分等量的NMM(0.66mL，6.0mmol)。反应混合物在-20℃搅拌1h，然后倒入冷的稀HCl中并用CH2Cl2萃取。有机萃取液用水、稀NaHCO3溶液、盐水洗涤，干燥(MgSO4)。减压浓缩得到无色油状所需产物(2.20g，73％)；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ 8.4(m，1H，NH)，5.12-4.90(m，2H)，4.38(m，1H)，4.11(m，1H)，4.00(m，1H)，2.73(m，1H)，2.42(2m，2H)，1.92(m，2H)，1.45(s，9H，t-Bu)，1.11-0.85(m，12H，4×CH3)；19F NMRδ-82.14(s，CF3)，-120.99和-123.09，-121.23和-122.84(2AB四重峰，J＝296Hz，CF2)d)L-缬氨酰-N-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-L-2-氮杂环丁酰胺盐酸盐在冰浴温度下，向搅拌下的(c)部分产物(2.0g3.98mmol)的EtOAc(40mL)溶液中通入HCl气体4分钟。然后将反应液在室温下搅拌2h，减压浓缩并与EtOAc共沸得到白色泡沫状所需产物(1.63g，96％)。IR(薄膜)3196，2972，2937，2883，2636，1755，1655，1523，1471，1398，1373，1350，1222，1201，1159，1116，1093，1066，1014，979，922，835，815，734，646，588；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.09(d，1H，J＝8.2Hz，NH)，8.02(d，1H，J＝8.5Hz，NH)，5.15(m，1H)，5.00(m，1H)，4.55(m，1H)，4.13(m，1H)，3.90(m，1H)，2.56(m，2H)，2.30(m，3H)，1.12-0.84(m，12H，4×CH3)；13C NMR(CDCl3)δ193.2，170.7，170.4，170.3，169.9，62.2，61.5，59.7，59.5，55.1，55.0，50.1，30.0，29.9，28.9，28.7，19.8，19.7，18.8，18.5，18.2，18.1，17.8，16.6，16.3；19F NMRδ-82.06 and-82.14(2s，CF3)，-121.16和-122.76，-121.33和-122.88(2AB四重峰，J＝296Hz，CF2)；MS(Cl/CH4)m/z(相对强度)442(6)，430(18)，402(MH+，100)，303(9)，72(42)。分析理论值C16H24F5N3O3·HClC，43.89；H，5.53；N，9.59。实测值C，43.43；H，6.07；N，9.23。e)N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-L-2-氮杂环丁酰胺(MDL 104238)向搅拌下的4-(4-吗啉羰基)苯甲酸(975mg，4.14mmol)和氯化苄基三乙基铵(4mg，0.008mmol)的1，2-二氯乙烷(30mL)悬浮液中加入亚硫酰氯(0.3mL，4.14mmol)并将反应液加入回流。2.5h后，将反应液冷却至室温并减压浓缩。然后将残余物与CCl4共沸并放置在真空下得到淡橙色油状吗啉代邻苯二酰氯(定量)，可不用进一步纯化直接使用。在一个分离圆底烧瓶内，将搅拌下的(d)部分的产物(1.5g，3.43mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液冷却至-20℃。加入NMM(1.35mL，12.3mmol)，随后立即滴加吗啉代邻苯二酰氯的CH2Cl2(5mL)溶液，滴加的速度保持内部反应温度在-10℃或更低。加完后，将反应混合物升至室温。在室温1.5h后，将反应混合物用CH2Cl2(20mL)稀释，1N HCl(2×20mL)、饱和NaHCO3(2×20mL)、盐水(1×20mL)洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩得到白色泡沫，将其立即进行闪式色谱分离(用1∶27MeOH-CH2Cl2洗脱)得到白色泡沫状所需产物(MDL104238)(335mg，16％)；IR(KBr)3690，3678，3429，3271，3011，2972，2931，2899，2876，2862，1755，1680，1631，1520，1494，1458，1437，1398，1373，1361，1330，1302，1280，1259，1234，1199，1159，1114，1068，1024，1012，896，860，842，787，773，763，669，597，563，540；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.32(m，1H，NH)，7.86(d，2H，J＝8.5Hz，芳基氢)，7.49(d，2H，J＝7.9Hz，芳基氢)，6.70(m，1H，NH)，5.00(m，2H)，4.50(m，2H)，4.19(m，1H)，4.86-3.30(一系列m，8H)2.82-1.95(一系列m，4H)，1.05(m，9H，3×CH3)，0.88(d，3H，J＝6.9Hz，CH3)；13C NMRδ174.07，174.05，170.6，169.2，166.4，138.66，138.62，135.0，134.9，127.4，127.3，66.8，66.7，62.0，61.7，59.7，59.6，54.1，54.0，49.3，31.5，31.4，28.7，28.5，20.0，19.0，18.8，18.2，18.1，18.09，18.05，16.1，16.0；19F NMRδ-82.12(s，CF3)，-120.98和-123.12，-121.20和-122.86(2AB四重峰，J＝296Hz，CF2)；MS(Cl/CH4)m/z(相对强度)647，619(MH+)，303，(100)，289，218。分析理论值C28H35F5N4O6·0.3H2OC，53.90；H，5.75；N，898。实测值C，53.75；H，5.86；N，8.86。
实施例2N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-D，L-2-哌啶酸的制备 a)N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-缬氨酰-D，L-2-哌啶酰胺向搅拌下的D，L-哌啶酸(1.30g，10mmol)和Et3N(1.5mL，11mmol)的DMF(30mL)溶液中加入实施例1，(a)部分的产物(2.0g，6.0mmol)并将反应液加入至120℃2.5h。冷却中，将反应液减压浓缩并将油状残余物溶于EtOAc，3N HCl(2×30mL)洗涤、干燥(Na2SO4)并浓缩得到黄色泡沫，将其闪式色谱分离得到白色泡沫状的所需化合物(579mg，29％)，为两个化合物的混合物；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.94(br s，1H)，5.62(d，1H，J＝9.8Hz，NH)，5.45(d，.5H，J＝3.98Hz，L-Pec)，5.07(d，.5H，J＝9.25，D-Pec)，4.60(dd，.5H，J＝8.83，5.06Hz，α-CH of Val)，4.25(dd，.5H，J＝8.69，4.66Hz，Val of D-compound)，3.93(app d，1H，J＝12.47Hz，Pec)，3.25(m，1H，Pec)，2.31(m，1H，Pec)，2.20(m，.5H，Val of D-compound)，2.01(m，.5H，Val)，1.78-1.33(m，5H，Pec)，1.44(s，9H，tBu)，1.01-0.86(m，6H，2×CH3).b)N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-D，L-2-哌啶酰胺在氮气下，向搅拌下的实施例2，(a)部分的产物(450mg，1.37mmol)和NMM(0.15mL，1.37mmol)的无水CH2Cl2(20mL)溶液中于-20℃下滴加氯甲酸异丁酯(0.18mL，1.37mmol)。20分钟后，加入4-氨基-1，1，1，2，2-五氟-5-甲基-3-己酮盐酸盐(351mg，1.37mmol)。反应混合物在-20℃下搅拌1h，然后倒入冷的稀HCl中并用CH2Cl2萃取。有机萃取液用水、稀NaHCO3水溶液、盐水洗涤，干燥(MgSO4)。减压浓缩得到无色泡沫状所需化合物(580mg，80％)；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ6.98(m，1H，NH)，5.36-4.88(m，3H)，4.60(m，1H)，4.43(m，1H)，3.92(m，1H)，3.10(m，1H，CH of Pec)，2.36-1.92(series of m，3H，Pec and CH or Val)，1.79-1.24(m，4H)，1.45(s，9H，tBu)，1.05-0.83(m，12H，4×CH3)；19F NMRδ-82.10(s，CF3)，-120.74--123.40(m，CF2).c)L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-D，L-2-哌啶酰胺，盐酸盐在冰浴温度下，向搅拌下的实施例2(b)的产物(530mg，1.0mmol)的EtOAc(10mL)溶液中通入HCl气体4分钟。然后将反应液在室温下搅拌2h，减压浓缩并与EtOAc共沸得到白色泡沫状所需产物(460mg，99％)。d)N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-D，L-2-哌啶酰胺(MDL 105759)向搅拌下的4-(4-吗啉羰基)苯甲酸(0.28g，120mmol)和氯化苄基三乙基铵(2mg，0.004mmol)的1，2-二氯乙烷(25mL)悬浮液中加入亚硫酰氯(0.09mL，1.20mmol)并将反应液加入回流。2.5h后，将反应液冷却至室温并减压浓缩。然后将残余物与CCl4共沸并放置在真空下得到淡橙色油状吗啉代邻苯二酰氯(定量)，可不用进一步纯化直接使用。在一个分离圆底烧瓶内，将搅拌下的实施例2(c)的产物(450mg，10.0mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液冷却至-20℃。加入NMM(0.5mL，4.0mmol)，随后立即滴加吗啉代邻苯二酰氯的CH2Cl2(5mL)溶液，滴加的速度保持内部反应温度在-10℃或更低。加完后，将反应混合物升至室温。在室温1.5h后，将反应混合物用CH2Cl2(20mL)稀释，1N HCl(2×20mL)、饱和NaHCO3(2×20mL)、盐水(1×20mL)洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩得到泡沫粗品(410mg)，将该白色泡沫状粗品立即进行闪式色谱分离(用1∶27MeOH-CH2Cl2洗脱)得到白色泡沫状所需产物(MDL 105759)(270mg，42％)；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.95-7.76(m，2H，aryl)，7.58-7.39(m，2H)，7.20-6.86(m，2H，aryl)，5.40-4.30(m，4H)，4.20-3.20(m，10H，2×NCH2CH2O and NCH2of Pro)，2.60-1.95(m，3H)，1.90-1.82(m，4H)，1.25-0.75(m，12H)；19F NMR (CDCl3)δ-81.97(m，CF3)，-121.82 and -119.87(m，CF2)；MS(Cl/CH4)m/z(rel.intensity)647(MH+)，564，536，474，428，363，331(100)，317，289，246，218，186，158，104，84，72。
实施例3N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-反-4-羟基脯氨酰胺的制备 a)N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-缬氨酰-反-4-羟基脯氨酸向搅拌下的反-4-羟基脯氨酸(1.31g，10mmol)和Et3N(1.4mL，10mmol)的DMF(40mL)溶液中加入实施例1，(a)的产物(3.14g，10mmol)并将反应液加入至110℃3h。冷却中，将反应液减压浓缩并将油状残余物溶于EtOAc，3N HCl(2×30mL)、H2O(2×10mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩得到白色泡沫状的所需化合物(1.85g，56％)；1H NMR(300 HHz，CDCl3)δ5.70-5.25(m，1H，NH)，5.05(m，1H)，4.80-3.95(m，4H)，3.85-2.80(series of m，3H)，2.35-1.80(m，2H)，1.44(s，9H，tBu)，1.01-0.95(m，6H，2×CH3)；MS(Cl/CH4)m/z(rel intensity)，331(MH+)，303，275(100)，259，231，217，172，162，144，132，116，86，72。b)N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-反-4-羟基脯氨酰胺在氮气下，向搅拌下的实施例3(a)的产物(1.80g，5.60mmol)和NMM(0.60mL，5.60mmol)的无水CH2Cl2(30mL)溶液中于-20℃下滴加氯甲酸异丁酯(0.70mL，5.60mmol)。20分钟后，加入4-氨基-1，1，1，2，2-五氟-5-甲基-3-己酮盐酸盐(1.40g，5.60mmol)，随后立即加入另一部分等量的NMM(0.60mL，5.60mmol)。反应混合物在-20℃下搅拌1h，然后倒入冷的稀HCl中并用CH2Cl2萃取。有机萃取液用水、稀NaHCO3水溶液、盐水洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩得到油状粗品，将其闪式色谱分离(5％MeOH/CH2Cl2)得到白色泡沫状所需化合物(1.44g，48％)；1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.98(br d，.5H，J＝7.6Hz，NH)，7.73(br d，.5H，J＝7.6Hz，NH)，5.47(br d，1H，J＝8.6Hz，NH)，5.04-4.95(m，1H)，4.76-4.67(m，1H)，4.49(br s，1H)，4.23(m，1H)，3.94(br d，1H，J＝10.8Hz)，3.66-3.59(m，1H)，2.50-1.98(series of m，4H)，1.42(s，9H，t-Bu)，1.09-0.88(m，12H，4×CH3)；13C NMRδ173.9，173.2，170.6，170.4，156.3，156.2，80.5，80.4，77.4，77.2，77.0，76.5，70.0，69.8，59.7，59.5，58.2，57.7，57.6，55.7，55.5，35.7，34.7，31.0，30.9，29.0，28.6，28.3，28.2，20.2，19.9，19.3，19.7，18.3，18.2，16.4，16.1；19F NMRδ-82.17(s，CF3)，-82.18(s，CF3)，-121.6 and-122.8(AB quartet，J＝296Hz，CF2)；MS(CI/CH4) m/z (relintensity)549(MNH4+，12)，532(MH+，54)，482(11)，330(15)，245(100)，189(15)。c)N-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-反-4-羟基脯氨酰胺盐酸盐和N-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-反-4-乙酰氧基脯氨酰胺盐酸盐在冰浴温度下，向搅拌下的实施例3(b)的产物(1.44g，2.70mmol)的EtOAc(20mL)溶液中通入HCl气体4分钟。然后将反应液在室温下搅拌2h，减压浓缩并与EtOAc共沸得到白色泡沫状的所需衍生物的组合(1.27g，100％)，乙酰氧基是较少的衍生物。d)N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-反-4-羟基脯氨酰胺(MDL 105160)和N-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-反-4-乙酰氧基脯氨酰胺(MDL105683)向搅拌下的4-(4-吗啉羰基)苯甲酸(280mg，1.90mmol)和氯化苄基三乙基铵(2mg，0.004mmol)的1，2-二氯乙烷(20mL)悬浮液中加入亚硫酰氯(0.15mL，1.90mmol)并将反应液加入回流。2h后，将反应液冷却至室温并减压浓缩。然后将残余物与CCl4共沸并放置在真空下得到淡橙色油状吗啉代邻苯二酰氯(定量)，可不用进一步纯化直接使用。在一个分离圆底烧瓶内，将搅拌下的实施例3(c)的产物(800mg，1.71mmol)的CH2Cl2(15mL)溶液冷却至-20℃。加入NMM(0.42mL，3.80mmol)，随后立即滴加吗啉代邻苯二酰氯的CH2Cl2(5mL)溶液，滴加的速度保持内部反应温度在-10℃或更低。加完后，将反应混合物升至室温。在室温2h后，将反应混合物用CH2Cl2(20mL)稀释，1N HCl(2×20mL)、饱和NaHCO3(2×20mL)、盐水(1×20mL)洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩得到两个化合物的泡沫状粗品混合物(MDL 105160是主要产物，MDL 105683较少的产物)。e)N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-反-4-羟基脯氨酰胺(MDL 105160)将实施例3(d)所述的两个化合物的混合物立即在SiO2上进行闪式色谱分离，用1∶27 MeOH/CH2Cl2洗脱得到具有较大Rf值(Rf大约为0.3-0.4)的白色泡沫状所需化合物(MDL 105160)(160mg，14.5％)；1HNMR(300MHz，CDCl3)δ7.82(m，2H，aryl)，7.45(d，2H，J＝8.3Hz，aryl)，7.35(d，.5H，J＝8.4Hz，NH)，6.91(d，1H，J＝8.7Hz，NH)，4.99(m，1H)，4.84(t，1H)，4.72(t，1H)，4.68(m，1H)，4.55(br s，1H)，4.18(m，1H)，3.8-3.4(br s overlapping m，9H)，2.86-2.03(series of m，4H)，1.26(m，9H，3×CH3)，0.96(m，3H，CH3)；13C NMRδ173.2，172.5，170.7，170.4，169.2，167.1，138.8，134.9，127.52，127.50，127.4，127.3，77.55，77.52，77.51，77.46，77.44，77.3，77.2，77.1，77.0，76.88，76.85，76.6，76.56，76.54，70.1，69.9，66.8，59.6，59.5，58.5，57.9，57.0，56.0，56.0，55.7，36.0，34.9，31.42，31.40，31.3，29.2，28.8，20.0，19.85，19.83，19.4，19.2，18.4，16.5，16.4，16.3，16.2；19F NMR(CDCl3)δ-82.1，-82.15(s，CF3)，-121.31，-123.02(AB quartet J＝293Hz，CF2)and -121.35，-122.82(AB quartet，J＝298Hz，CF2)；MS(Cl/CH4)m/z(rel intensity)649(MH+)，361，334，333(100)，317，289，218，200，111，86。分析理论值C29H37F5N4O7C，53.70；H，5.75；N，8.64。实测值C，53.44；H，5.77；N，8.38。
实施例4N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-反-4-乙酰氧基脯氨酰胺的制备 a)N-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-反-4-乙酰氧基脯氨酰胺(MDL 105683)MDL 105683是从如实施例3(e)所述的进行闪式色谱分离的两个化合物的混合物中得到的Rf值较小的物质(Rf大约0.05-0.1)。所述方法得到的是白色泡沫状的MDL 105683(90mg，7.6％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.84(d，2H，J＝8.4Hz，aryl)，7.72(.5H，J＝8.4Hz，NH)，7.47(d，2H，J＝8.3Hz，aryl)，6.74(d，1H，J＝8.6Hz，NH)，5.36(m，1H)，5.00(m，1H)，4.83(dd，.5H，J＝8.6，7.2Hz)，4.69(t，.5H)，4.08(br d，1H)，3.9-3.3(br s overlapping m，9H)，2.81(m，.5H)，2.64(m，.5H)，2.41-2.06(series of m，3H)，2.04(s，3H，OCH3)，1.02(m，9H，3×CH3)，0.94(m，3H，CH3)；13C NMRδ173.0，172.3，170.4，170.1，169.9，169.2，166.3，138.7，127.4，127.3，72.5，72.4，66.8，59.6，59.5，58.5，57.8，56.3，56.2，53.2，52.9，34.0，32.8，31.8，31.7，31.6，29.3，29.2，28.8，24.9，20.9，20.0，19.8，19.5，19.3，17.95，17.92，17.7，16.4，16.2；19F NMR(CDCl3)δ-82.1，-82.13(s，CF3)，-121.22，-123.06(AB quartet J＝296Hz，CF2)and-121.28，-122.86(AB quartet，J＝301Hz，CF2)；MS(Cl/CH4)m/z (rel intensity)691(MH+)，631，472，444，389，375(100)，349，318，317，289，264，225，218，128，100。分析理论值C31H39F5N4O8C，53.91；H，5.69；N，8.11。实测值C，54.40；H，5.79；N，8.15。
实施例5N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-反-4-苄氧基脯氨酰胺的制备 a)反-4-苄氧基脯氨酸盐酸盐向冰浴冷却的叔-丁氧羰酰基-O-苄基-L-羟基脯氨酸(5.0g，15.6mmol)的EtOAc(30mL)溶液中通入HCl(g)2分钟。然后将反应液密封，室温下搅拌1h并减压浓缩得到白色固体，将其与乙醚一起研制并真空干燥得到所需化合物(3.92g，98％)，mp188-190℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.1(br s，1H)，7.3(m，5H)，4.56(s，2H)，4.4-4.2(m，2H)，3.6-3.38(m，3H)，2.6-2.58(m，1H)，2.26-2.1(m，1H)；m/z(rel.intensity)262(M++C3H5)，250(M++C2H5)，222(MH+，100)，176，130，107，91，85，69。b)N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-缬氨酰-反-4-苄氧基脯氨酸向搅拌下的反-4-苄氧基-L-脯氨酸盐酸盐(2.57g，10mmol)和Et3N(3.0mL，22mmol)的DMF(25mL)溶液中加入实施例1，(a)的产物(3.14g，10mmol)并将反应液加入至80℃1.5h。冷却中，将反应液减压浓缩并将油状残余物溶于EtOAc，3N HCl(2×30mL)、H2O(2×10mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩得到所需化合物(1.8g，42％)。重结晶(EtOAc/己烷)得到白色固体mp125-128；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ 8.0(br s，1H)，7.4-7.2(m，5H)，5.35(d，1H，J＝9.2Hz，NH)，4.65(m，1H)，4.52(m，2H)，3.70(m，1H)，2.5-1.8(series of m，3H)，1.44(s，9H，tBu)，0.98(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)，0.92(d，3H，J＝6.8Hz，CH3)。c)N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-反-4-苄氧基脯氨酰胺在氮气下，向实施例5(b)的产物(1.40g，3.30mmol)和NMM(0.36mL，3.30mmol)的无水CH2Cl2(20mL)溶液中于-20℃下滴加氯甲酸异丁酯(0.43mL，3.30mmol)。20分钟后，加入4-氨基-1，1，1，2，2-五氟-5-甲基-3-己酮盐酸盐(840mg，3.30mmol)，随后立即加入另一部分等量的NMM(0.36mL，3.30mmol)。反应混合物在-20℃下搅拌1h，然后升至室温并倒入冷的稀HCl中并用CH2Cl2萃取。有机萃取液用水、稀NaHCO3水溶液、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并减压浓缩得到白色固体状所需化合物(2.0g，95％)mp 91-93℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.96(.5H，NH)，7.33(m，5H)，5.28(m，1H，NH)，4.95(m，1H)，4.83(m，1H)，4.70(t，.5H)，4.54(q，2H，CH2Ph)，4.30(m，2H)，4.07-3.9(m，1H)，3.60(m，1H)，2.68(dt，.5H)，2.49(dt，.5H)，2.33(m，1H)，2.2-1.88(m，3H)，1.44(s，9H，tBu)，1.09-0.86(m，12H，4×CH3)。d)N-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-反-4-苄氧基脯氨酰胺，盐酸盐在冰浴温度下，向搅拌下的实施例5(c)的产物(330mg，0.53mmol)的EtOAc(10mL)溶液中通入HCl气体2分钟。然后将反应液在室温下搅拌1h，减压浓缩并与EtOAc共沸得到白色泡沫状所需化合物(240mg，81％)；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.22(m，2H，NH2)，7.33(m，5H)，5.04(app q，1H)，4.88(dq，1H)，4.52(q，2H，CH2Ph)，4.33(m，1H)，4.0-3.8(series of m，4H)，2.42-2.1(m，4H)，1.09-0.86(m，12H，4×CH3)。e)N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧代丁基]-反-4-苄氧基脯氨酰胺(MDL 104865)向搅拌下的4-(4-吗啉羰基)苯甲酸(280mg，1.90mmol)和氯化苄基三乙基铵(2mg，0.004mmol)的1，2-二氯乙烷(20mL)悬浮液中加入亚硫酰氯(0.15mL，1.90mmol)并将反应液加入回流。2h后，将反应液冷却至室温并减压浓缩。然后将残余物与CCl4共沸并放置在真空下得到淡橙色油状吗啉代邻苯二酰氯(定量)，可不用进一步纯化直接使用。在一个分离圆底烧瓶内，将搅拌下的实施例5(d)的产物(558mg，1.0mmol)的CH2Cl2(15mL)溶液冷却至-20℃。加入NMM(0.40mL，4.0mmol)，随后立即滴加吗啉代邻苯二酰氯的CH2Cl2(5mL)溶液，滴加的速度保持内部反应温度在-10℃或更低。加完后，将反应混合物升至室温。在室温下2h后，将反应混合物用CH2Cl2(20mL)稀释，1N HCl(2×20mL)、饱和NaHCO3(2×20mL)、盐水(1×20mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并减压浓缩得到泡沫粗品，将其立即进行闪式色谱分离(1∶27 MeOH-CH2Cl2洗脱)得到白色泡沫状所需化合物(520mg，70％)；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.84(dd，2H，aryl)，7.78(d，.5H，NH)，7.45(dd，2H，aryl)，7.29(m，5H)，7.21(d，.5H，NH)，6.87(d，1H，NH)，4.98(m，1H)，4.82(m，1H)，4.69(t，.5H)，4.54(dq，2H，CH2Ph)，4.31(br s，1H)，4.08(dq，1H)，3.9-3.25(series of m，9H)，2.69(dt，.5H)，2.46(dt，.5H)，2.34(m，1H)，2.17(m，1H)，1.02(m，9H，3×CH3)，0.89(m，3H，CH3)；13C NMR(CDCl3)δ193.1，172.9，172.2，170.7，170.4，169.3，166.2，138.4，137.5，137.4，135.2，128.5，128.4，128.2，127.9，127.8，127.78，127.73，127.71，127.5，127.4，127.3，119.5，115.76，107.1，106.6，71.4，71.2，66.7，59.6，59.4，58.7，58.0，56.0，52.6，52.3，48.14，48.11，48.10，48.0，42.6，42.57，42.52，42.4，33.5，32.4，31.8，29.1，28.6，20.0，19.8，19.4，19.3，17.8，17.6，16.3，16.1；19F NMR(CDCl3)δ-82.10，-82.13(s，CF3)，-121.3，-122.9 and-121.4，-122.8(AB quartet，J＝296Hz，CF2)；MS(CI/CH4)m/z(rel.intensity)767(M++29)，740(10)，739(MH+，27)，632(11)，520(7)，492(5)，424(18)，423(100)，403(3)，345(5)，317(30)，289(4)，218(3)，176(11)，91(2)。分析理论值C36H43F5N4O7·0.4H2OC，57.95；H，5.92；N，7.54。实测值C，58.10；H，5.84；N，7.49。
实施例6Boc-Val-CF2F3其它制备方法 将288.0g(1.11mol)Boc-Val N-甲基-O-甲基异羟肟酸和4.7L无水Et2O的混合物加入到一个装有搅拌棒、温度计、干冰冷凝器、气体分散管及连续N2清洗的12L三颈瓶中。将得到的溶液冷却至-60℃到-65℃。在30分钟内，通过气体分散管向Boc-Val N-甲基-O-甲基异羟肟酸溶液中加入总量为885.2g(3.60mol)的C2F5I并保持温度为大约-65℃。气体加完后，立即在1h内加入总量为2.39L的1.5M CH3Li·LiBr的Et2O溶液(3.59mol)，保持反应温度为-52℃到-58℃。在加入1/3的CH3Li·LiBr后出现沉淀，但在全部加完后呈现透明溶液。将得到的溶液在-52℃到-58℃搅拌1h。反应通过GC进行监测(MDL101286的Rt＝1.3分钟，Boc-ValN-甲基-O-甲基异羟肟酸的Rt＝5.1分钟)并发现含有7.2％的Boc-ValN-甲基-O-甲基异羟肟酸。在15分钟内加入总量为255mL(3.47mol)的丙酮，保持反应温度为-52℃到-58℃并将得到的混合物搅拌10分钟。将混合物加入到一个含有4.7L冷却至大约0℃的0.75M KHSO4的22L烧瓶内终止反应。分离有机层并用3LH2O洗涤。有机层用500gMgSO4干燥并滤除干燥剂。滤液在40℃/100torr下浓缩至重409g的半固体。将粗品在45℃溶于1.2L己烷并在30分钟内缓慢降温至-25℃到-30℃。滤出结晶固体并用250mL己烷在-30℃洗涤。将得到的MDL101286真空干燥(25℃/100torr)得到176.7g。将滤液在35℃/100torr浓缩至重153.5g的残余物。将该物质置于Kuglrohr蒸馏器内，前馏分收集至40℃/0.6torr。更换收集器，在40℃-60℃/0.6torr收集到总量为100.5g的MDL101286粗品。将粗产物在大约50℃溶于500mL己烷。得到的溶液冷却至-30℃。滤出结晶的固体并用100mL冷(-30℃)己烷洗涤。产物在25℃/100torr下真空干燥得到另外68.0g的MD1101286，总产量为244.7g(70％收率)，GC纯度为99.9％。分析理论值，C12H18F5NO3(319.28)C，45.14，H，5.68，N，4.39；实测值C，45.30，45.49，H，5.50，5.58，N，4.26，4.35。
在进一步的实施方案中，本发明提供用于治疗染有中性粒细胞相关的炎症性疾病的病人的方法，包括向病人施用有效治疗量的分子式I的化合物。术语“中性粒细胞相关的炎症性疾病”指特征为白细胞迁移至炎症部位并且参与生物matirces的蛋白水解降解的疾病和情况。用分子式I的化合物治疗特别有用的中性粒细胞相关的炎症性疾病包括肺气肿、肺囊性纤维化、成人呼吸窘迫综合征、败血症、弥漫性血管内凝血、痛风、类风湿性关节炎、慢性支气管炎、炎症性肠道疾病。用于治疗中性粒细胞相关的炎症性疾病的特别优选的分子式I的化合物包括N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧丁基]-L-2-氮杂环丁烷酰胺；N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧丁基]-D，L-2-哌啶酰胺；N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧丁基]-反-4-羟基脯氨酰胺；N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧丁基]-反-4-乙酰氧基脯氨酰胺；N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧丁基]-反-4-苄氧基脯氨酰胺。
在此使用的术语“病人”指处于一个具体炎症性疾病阶段的温血动物例如哺乳动物。豚鼠、狗、猫、大鼠、小鼠、马、牛、羊、和人应理解为均在该术语所指的动物范围内。
术语“有效治疗量”指在给病人单或多剂量施用时，缓解中性粒细胞相关的炎症性疾病症状的有效量。在此使用的呼吸性疾病的“症状缓解”指没有治疗的情况下所预期的严重程度的减轻，而不是指疾病的完全消除或治愈。在确定有效治疗量或剂量中，参与的诊断医师应考虑大量因素，包括(但不仅限于)哺乳动物的种类；其大小、年龄、一般状况；涉及的特殊疾病；疾病涉及的程度和疾病的严重程度；各个病人的反应；施用的具体化合物、给药方式、给药制剂的生物利用度；选择的给药方案；辅助治疗的使用；和其它相关情况。
分子式I的化合物的有效治疗量预计为大约每天每公斤体重0.1毫克(mg/kg/天)到大约100mg/kg/天。优选量预期为大约0.5到10mg/kg/天。
本发明的化合物是弹性蛋白酶，尤其是人中性粒细胞弹性蛋白酶的非常有效的抑制剂。确信本发明的化合物通过抑制弹性蛋白酶产生抑制效果，从而缓解弹性蛋白酶介导的疾病，包括(但不仅限于)肺气肿、肺囊性纤维化、成人呼吸窘迫综合征、败血症、弥漫性血管内凝血、痛风、类风湿性关节炎。然而，应当理解本发明不受任何在解释其在end-use应用中的效果的具体理论或推测的机制的限制。
在感染有上述疾病的病人的有效治疗中，分子式I的化合物可以以任何能够产生化合物的生物利用有效量的形式或方式进行给药，包括口服、气雾剂、和胃肠外途径。例如，分子式I的化合物可以通过口服、气雾剂、皮下、肌肉内、静脉内、透皮、鼻内、直肠、局部及此类的方式给药。通常优选口服或气雾剂给药。依据所选化合物的具体性质、所需治疗的疾病状态、疾病的阶段、和其它相关情况，制剂制备领域的技术人员可以方便地选择适当的给药形式或方式。Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishig Co.(1990)。
化合物可以单独给药或以与其它药物可接受的载体或赋形剂结合的药物组合物的形式给药，载体和赋形剂的比例和性质由所选化合物的溶解性和化学性质、选择的给药途径、以及标准的药物实践确定。本发明的化合物，当其本身有效时，为了稳定性、方便结晶、增加溶解度及此类的目的，还可以以其药物可接受的盐的形式制成制剂或给药，例如酸加成的盐。
在其它实施方案中，本发明提供含有与一种或多种惰性载体混和或结合的分子式I的化合物的组合物。这些组合物可以用作，例如，分析标准、大量运输的方便方法、或药物组合物。分子式I的化合物的可测量量是可以通过本领域技术人员公知和理解的标准分析方法和技术方便地进行测量的量。分子式I的化合物的可测量量通常为组合物重量的大约0.001％到75％。惰性载体可以是任何不会降解或与分子式I的化合物发生共价反应的物质。适当的惰性载体的例子是水；缓冲水溶液，例如通常在高效液相色谱(HPLC)分析中所使用的；有机溶剂，例如乙氰、乙酸乙酯、己烷及此类；以及药物可接受的载体或赋形剂。
更具体地讲，本发明提供含有与一种或多种药物可接受载体或赋形剂混和或结合的有效治疗量的分子式I的化合物的药物组合物。
药物组合物以药物领域公知的方式制备。载体或赋形剂可以是可用作活性成分的赋形剂或媒介物的固体、半固体、或液体物质。适当的载体或赋形剂是本领域公知的。药物组合物可以采取口服、胃肠外、或局部应用并可以通过片剂、胶囊、栓剂、溶液、悬浮剂或此类的方式向病人给药。
本发明的化合物可以进行口服给药，例如，与惰性稀释剂或可食用载体一起。可以将它们封装在明胶胶囊内或压成片。为了口服治疗给药的目的，可以将化合物中掺入赋形剂并以片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆、片、口香糖及此类的方式使用。这些制剂中应至少含有4％的发明化合物-活性成分，但可以依据具体的形式进行变化，通常可以在单元重量的4％到大约70％之间。组合物中的化合物的量应是可以获得适当剂量的。制备了根据本发明的优选组合物和制剂，每一个口服剂量单元中含有5.0-300毫克本发明的化合物。
片剂、丸剂、胶囊、锭剂及此类还可以含有一种或多种以下添加剂粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖；崩解剂例如藻酸、Primogel、玉米淀粉及此类；润滑剂例如硬脂酸镁或Sterotex；glidants例如胶体二氧化硅；还可以加入甜味剂例如蔗糖或糖精或矫味剂例如薄荷、水杨酸甲酯或橙类矫味剂。当剂量单元是胶囊的形式时，除以上类型的物质外，它还可以含有液体载体例如聚乙二醇或脂肪油。其它的剂量单元形式可以含有调节剂量单元的外观的其它各种物质，例如包衣。因此，片剂或丸剂可以可以用糖、紫胶、或其它肠溶性包膜剂。除本化合物外，糖浆可以含有作为甜味剂的蔗糖以及某种防腐剂、染料和着色剂和矫味剂。制备这些组合物时使用的物质应当是药物醇的并且在使用量下无毒。
为达到胃肠外治疗给药的目的，可以将本发明的化合物掺入到溶液或悬浮剂中。这些制剂应含有至少0.1％的本发明的化合物，但可以在其重量的0.1到大约50％之间变动。本发明的化合物在这些组合物中的量应是可以获得适当剂量的。制备了根据本发明的优选组合物和制剂，每一个胃肠外的剂量单元中含有5.0-100毫克本发明的化合物。
本发明的分子式I的化合物和可以通过气雾剂给药。术语气雾剂用于表示从胶体性质的系统到由加压包装组成的系统的各种系统。可以通过液化或压缩的气体或通过可以发放活性成分的适当的泵系统输送药物。分子式I的化合物的气雾剂可以以单相、双相、或三相的系统传送以释放活性成分。气雾剂的发放系统包括必须的容器，活化剂，阀门，辅助容器及此类。本领域技术人员可以确定优选的气雾剂。
本发明的分子式I的化合物还可以局部给药，这样做时载体可以适当的含有溶液，药膏或胶基，例如，可以含有一种或多种以下物质凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂例如水和乙醇、以及乳化剂和稳定剂。局部制剂可以含有分子式的化合物或其药物盐的浓度从大约0.1到大约10％w/v(重量每单位体积)。
溶液或悬浮剂还可以包括一种或多种以下添加剂用于注射的无菌稀释剂例如水，0.6％食盐水溶液，固定油类，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂例如苄醇或羟基苯甲酸甲酯；抗氧剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸盐、枸橼酸盐或磷酸盐以及用于调整强度的物质例如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以封装在玻璃或塑料的安瓿、一次性注射器或多剂量管内。
用N-MeoSuc-Ala-Ala-Pro-Val-p-硝基酰苯胺(可购买到)作为底物对人中性粒细胞弹性蛋白酶进行体外测定。分析的缓冲剂、pH及分析的技术与Mehdi等，Biochemcial and BiophysicalResearchCommunications，166，595(1990)中所描述的相似。酶是从人唾液中纯化的，尽管最近它已可以购买到。此刻的抑制剂的动力学特性通过Dixon绘图法分析，虽然Williams和Morrison已对慢-和/或牢固结合的抑制剂特性使用的数据分析技术做了综述。在J.Bieth，B.Spiess和C.G.Wermuth，Biochemical Medicine，11(1974)350-375中记载了高度灵敏及易得的弹性蛋白酶的底物的合成及分析中的应用。表2概述了选择的本发明的化合物的抑制弹性蛋白酶的能力。
表2 *for human neutrophil elastase，using N-MeOSucAlaAlaProVal-pNA as substrate*对人中性粒细胞弹性蛋白酶，用N-MeoSucAlaAlaProVal-pNA作为底物。
表2(续) *对人中性粒细胞弹性蛋白酶，用N-MeoSucAlaAlaProVal-pNA作为底物。
序列表(1)普通信息(I)申请人(A)姓名MARION MERRELL DOW INC.
(B)街道2110 E.GALBRAITH ROAD(C)城市辛辛那提(D)州俄亥俄(E)国家美国(F)邮政编码(ZIP)45215(G)电话513-948-7960(H)传真513-948-7961(I)电报214320(ii)发明名称新型特性蛋白酶抑制剂(iii)序列数4(iv)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatenfIn Release #1.0，Version#1.30(EPO)(2)序列标号1的信息(I)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述序列标号1xaa xaa xaa xaa
1(2)序列标号2的信息(I)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述序列标号2xaa xaa xaa xaa1(2)序列标号3的信息(I)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述序列标号3xaa xaa xaa xaa1(2)序列标号4的信息(I)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述序列标号4xaa xaa xaa xaa权利要求
1.一种分子式 的化合物或其水合物、电子等排物，或药物可接受的盐，其中P4是Ala，bAla，Leu，Ile，Val，Nva，bVal，Nle或一个键；P3是Ala，bAla，Leu，Ile，Val，Nva，bVal，Nle或N-甲基衍生物，Pro，Ind，Tic或Tca，或在其ε氨基用一个吗啉-B-基团取代的Lys或在其δ氨基用一个吗啉-B-基团取代的Orn；”P2是Pip，Aze，Pro(4-OH)，Pro(4-OAc)或Pro(4-OBzl)；R1是Ala，Leu，Ile，Val，Nva或bVal的侧链；X是-CF3，-CF2H，-CFH2，-C(＝O)Y，-C(＝O)P2′-Y，-CF2C(＝O)P2′-Y，-CF2CH(R1′)C(＝O)P2′-Y，-CF2CH(R1′)NHC(＝O)R3，-CHFCH(R1′)NHC(＝O)R3，-H，-C(＝O)R3，-CH(R1)C(＝O)P2′-Y，-CF2CF3，-CF2(CH2)tCH3，-CF2(CH2)tCOOR4，-CHF(CH2)tCH3，-CF2(CH2)tCONHR4，-CF2(CH2)tCH2OR4，-CF2(CH2)vCH＝CH2，-CH2Cl或-C(＝O)-C(＝O)-Y；R3是C1-6烷基，苯基，苄基，环己基，环己基甲基；R4是H或C1-6烷基；R1‘是Ala，Leu，Ile，Val，Nva或bVal的侧链；P2’是一个键，Ala或Val；Y 是-NHR3，OR3；t 是2，3或4；v 是1，2或3；k 是氢，甲酰基，乙酰基，琥珀酰基，苯甲酰基，叔-丁氧羰酰基，苄氧羰基，甲苯磺酸基，丹酰基，异戊酰基，甲氧琥珀酰基，1-金刚烷磺酰基，1-金刚烷乙酰基，2-羧基苯甲酰基，苯乙酰基，叔-丁基乙酰基，二((1-萘基)甲基)乙酰基，-C(＝O)N-(CH3)2， -A-Rz其中A是 ；并且Rz是一个含有6，10或12个碳原子的芳基，被1到3个独立地选自由氟、氯、溴、碘、三氟甲基、羟基、含有1到6个碳原子的烷基、含有1到6个碳原子的烷氧基、羧基、烷基羰基氨基，其中的烷基含有1到6个碳原子、5-四唑基、和含有1到15个碳原子的酰基亚磺酰胺基，如果酰基亚磺酰胺基含有一个芳基，该芳基还可以被一个选自氟，氯，溴，碘和硝基的基团进一步取代所组成的组群的基团取代；或 其中Z是N或CH，并且B是以下分子式的基团 其中R’是氢或一个C1-6烷基。
2.一种权利要求1的化合物，其中R1是-CH(CH3)2或-CH2CH2CH3。
3.一种权利要求2的化合物，其中X是-CF2CF3，-CF3，-CF2(CH2)tCH3，-CF2(CH2)tCOOR4，-CHF(CH2)tCH3，-CF2(CH2)tCONHR4，-CF2(CH2)tCH2OR4，或CF2(CH2)vCH＝CH2。
4.一种权利要求3的化合物，其中K是苯甲酰基，叔丁氧羰酰基，苄氧羰基，异戊酰基，-C(＝O)N(CH3)2， 或 其中Z是N并且B是以下分子式的基团 其中R’是氢或一个C1-6烷基。
5.一种权利要求4的化合物，其中P3是Ile，Val，或Ala。
6.一种权利要求5的化合物，其中P3是Ala或一个键。”
7.一种权利要求6的化合物，其中R1是-CH(CH3)2。
8.一种权利要求7的化合物，其中X是-CF2CF3。
9.一种权利要求8的化合物，其中K是 Z是N并且B是以下分子式的基团 并且其中R’是氢或一个C1-6烷基特别优选。
10.一种权利要求9的化合物，其中P3是Val。
11.一种权利要求10的化合物，其中P4是一个键。
12.一种根据权利要求1的化合物，其中的化合物是N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧丁基]-L-2-氮杂环丁烷酰胺。
13.一种根据权利要求1的化合物，其中的化合物是N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧丁基]-D，L-2-哌啶酰胺。
14.一种根据权利要求1的化合物，其中的化合物是N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧丁基]-反-4-羟基脯氨酰胺。
15.一种根据权利要求1的化合物，其中的化合物是N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧丁基]-反-4-乙酰氧基脯氨酰胺。
16.一种根据权利要求1的化合物，其中的化合物是N-[4-(4-吗啉羰基)苯甲酰基]-L-缬氨酰-N’-[3，3，4，4，4-五氟-1-(1-甲基乙基)-2-氧丁基]-反-4-苄氧基脯氨酰胺。
17.一种含有权利要求1的化合物及载体的组合物。
18.一种含有权利要求1的化合物及药物可接受载体的药物组合物。
19.一种治疗感染中性粒细胞相关的炎症性疾病的病人的方法，所述方法包括向病人施用有效治疗量的分子式 的化合物或其水合物、电子等排物，或药物可接受的盐，其中P4是Ala，bAla，Leu，Ile，Val，Nva，bVal，Nle或一个键；P3是Ala，bAla，Leu，Ile，Val，Nva，bVal，Nle或N-甲基衍生物，Pro，Ind，Tic或Tca，或在其ε氨基用一个吗啉-B-基团取代的Lys或在其δ氨基用一个吗啉-B-基团取代的Orn；”P2是Pip，Aze，Pro(4-OH)，Pro(4-OAc)或Pro(4-OBzl)；R1是Ala，Leu，Ile，Val，Nva或bVal侧链；X是-CF3，-CF2H，-CFH2，-C(＝O)Y，-C(＝O)P2′-Y，-CF2C(＝O)P2′-Y，-CF2CH(R1′)C(＝O)P2′-Y，-CF2CH(R1′)NHC(＝O)R3，-CHFCH(R1′)NHC(＝O)R3，-H，-C(＝O)R3，-CH(R1)C(＝O)P2′-Y，-CF2CF3，-CF2(CH2)tCH3，-CF2(CH2)tCOOR4，-CHF(CH2)tCH3，-CF2(CH2)tCONHR4，-CF2(CH2)tCH2OR4，-CF2(CH2)vCH＝CH2，-CH2Cl或-C(＝O)-C(＝O)-Y；R3是C1-6烷基，苯基，苄基，环己基，环己基甲基；R4是H或C1-6烷基；R1‘是Ala，Leu，Ile，Val，Nva或bVal的侧链；P2’是一个键，Ala或Val；Y是-NHR3，OR3；t是2，3或4；v是1，2或3；k是氢，甲酰基，乙酰基，琥珀酰基，苯甲酰基，叔-丁氧羰酰基，苄氧羰基，甲苯磺酸基，丹酰基，异戊酰基，甲氧琥珀酰基，1-金刚烷磺酰基，1-金刚烷乙酰基，2-羧基苯甲酰基，苯乙酰基，叔-丁基乙酰基，二((1-萘基)甲基)乙酰基，-C(＝O)N-(CH3)2， -A-Rz其中A是 ；并且R2是一个含有6，10或12个碳原子的芳基，被1到3个独立地选自由氟、氯、溴、碘、三氟甲基、羟基、含有1到6个碳原子的烷基、含有1到6个碳原子的烷氧基、羧基、烷基羰基氨基，其中的烷基含有1到6个碳原子、5-四唑基、和含有1到15个碳原子的酰基亚磺酰胺基，如果酰基亚磺酰胺基含有一个芳基，该芳基还可以被一个选自氟，氯，溴，碘和硝基的基团进一步取代所组成的组群的基团取代；或 其中Z是N或CH，并且B是以下分子式的基团 其中R’是氢或一个C1-6烷基。
20.一种根据权利要求19的方法，其中的中性粒细胞相关的炎症性疾病是肺气肿。
21.一种根据权利要求19的方法，其中的中性粒细胞相关的炎症性疾病是肺囊性纤维化。
22.一种根据权利要求19的方法，其中的中性粒细胞相关的炎症性疾病是慢性支气管炎。
23.一种根据权利要求19的方法，其中的中性粒细胞相关的炎症性疾病是炎性肠道疾病。
全文摘要
本发明涉及弹性蛋白酶，尤其是人中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的化合物。该抑制剂是短链的合成多肽，其中的P
文档编号A61P21/00GK1149877SQ95193386
公开日1997年5月14日 申请日期1995年5月5日 优先权日1994年6月2日
发明者W·A·小麦兹, S·L·加里昂, J·P·布尔克哈特, M·R·安格拉斯特罗, N·P·皮特 申请人:赫彻斯特马里恩鲁斯公司