专利名称：一种诱导纤维堆囊菌表达制备埃博霉素的方法
技术领域：
本发明涉及抗肿瘤药物微生物发酵领域，更具体地，涉及一种诱导纤维堆囊菌表达制备埃博霉素的方法。
背景技术：
埃博霉素Gpothilone)是一类大环内酯类化合物，从粘细菌亚目的纤维堆囊菌菌株发酵液中可以分离埃博霉素，其主要组分为Epothilone A和B。它与紫杉醇具有相同的抑制肿瘤细胞生长的作用机制，并且对多重耐药肿瘤细胞和耐紫杉醇的肿瘤细胞均表现强大的抗癌活性。除具有活性方面的优势之外，埃博霉素具有较紫杉醇简单的化学结构和良好的水溶性，而且可以发酵法生产。埃博霉素分子结构如下:
权利要求
1.一种诱导纤维堆囊菌表达制备埃博霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤:酵菌种的制备:将纤维堆囊菌菌种培养至纤维堆囊菌生物量为0.8 1.2 XlO9CfVmL时，作为发酵菌种备用；酵培养:将SI中的发酵菌种加入发酵培养基中进行培养，当发酵液中纤维堆囊菌生物量大于等于lO'fu/mL时进行停止发酵培养，得发酵培养物；导发酵培养:在S2中的发酵培养物中加入诱导组合物进行诱导发酵培养，得诱导发酵培养物； 离诱导发酵培养物中的埃博霉素； 其中，S3中所述的诱导组合物包含如下重量百分比的组分: 5 15%甘油、I 10%色氨酸、Γ10%半胱氨酸、I 5%酪氨酸、Γ10% 2，3 二氢吡喃和Γιο%酵母提取物； S3中所述的诱导组合物的添加量为发酵培养物的广10 (体积)％; S3中所述的诱导发酵培养条件为:控制温度32 35°C，PH7.2 .5，在搅拌、通气、光照条件下培养12 36h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3中所述的诱导组合物包含 如下重量百分比的组分: 8^12%甘油、4 8%色氨酸、3 7%半胱氨酸、f 3%酪氨酸、3 7% 2，3 二氢吡喃和2飞％酵母提取物； 所述的诱导组合物的添加量为发酵培养物的3 7 (体积)％。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的诱导组合物包含如下 重量百分比的组分: 10%甘油、5%色氨酸、5%半胱氨酸、2%酪氨酸、5%2，3 二氢吡喃、4%酵母提取物； 所述的诱导组合物的添加量为发酵培养物的5 (体积)％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中所述的发酵培养,发酵培养方法为:将SI中制备得到的发酵菌种按5 10 (体积)％的接种量加入发酵培养基中，控制温度在25 30°C、PH 6.8^7.0，搅拌，通气，培养至发酵液中纤维堆囊菌生物量大于等于10lclcfu/mL。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基包含如下重量百分比的组分: Γ5%纸浆液、Γ2%马铃薯淀粉、Γ2%蛋白胨、Γ2%玉米浆、Γ2%葡萄糖、0.Γ0.2%磷酸氢二钾、0.Γο.2%CaCl2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，SI中所述的发酵菌种的制备，制备方法为:将纤维堆囊菌菌种在25 3(TC温度范围内，置于固体培养基上进行培养，4(T50h后，挑选生长均匀、呈橙色的菌落苔，转移至液体培养基中，在25 3(TC温度范围内、振荡培养至纤维堆囊菌生物量为0.8 1.2X 109cfu/mL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的固体培养基包含15 30mg/L卡那霉素B以及如下重量百分比的组分: Γ5%纸浆液、Γ2%马铃薯淀粉、Γ2%蛋白胨、Γ2%玉米浆、0.Γ0.2%磷酸氢二钾、琼脂粉 1.5 2.0%。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的液体培养基包含如下重量百分比的组分: 1~5%纸浆液、1~2%马铃薯淀粉、1~2%蛋白胨、1~2%玉米浆、0.1~0.2%磷酸氢二钾。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4中所述的分离诱导发酵培养物中的埃博霉素，分离方法如下:诱导发酵培养物中添加大孔吸附树脂组合物进行吸附埃博霉素，继续培养8 16h ；养结束后用水清洗大孔吸附树脂，上柱，先用1~5倍柱体积的10~30(质量)％的乙醇清洗杂质，再用80~100 (质量)%的乙醇洗脱，浓缩干燥的埃博霉素结晶粗品。
10.根据权利要求9 所述的方法，其特征在于，所述的大孔吸附树脂为MD-301大孔吸附树脂、D4020大孔吸附树脂和XD-5大孔吸附树脂中的一种或其混合。
全文摘要
本发明涉及抗肿瘤药物微生物发酵领域，公开了一种诱导纤维堆囊菌表达制备埃博霉素的方法。该方法包含如下制备步骤S1.将纤维堆囊菌菌种培养至纤维堆囊菌生物量为0.8~1.2×109cfu/mL时，作为发酵菌种备用；S2.将S1中的发酵菌种加入发酵培养基中进行培养，当发酵液中纤维堆囊菌生物量大于等于1010cfu/mL时进行停止发酵培养，得发酵培养物；S3.在S2中的发酵培养物中加入诱导组合物进行诱导发酵培养，得诱导发酵培养物；S4.分离诱导发酵培养物中的埃博霉素。本发明采用的多因素诱导纤维堆囊菌高效表达埃博霉素，埃博霉素的单位表达量明显提高。
文档编号C12R1/01GK103088084SQ201310035548
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月30日 优先权日2013年1月30日
发明者杜少平, 夏枫耿, 石笛, 戴南艺, 黄魁英, 赵培静, 秦鹏, 蓝碧锋, 张竞立, 陈勉华 申请人:广州市微生物研究所